pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

pQE-EGFP原核表达载体的构建及其表达和鉴定

目的:利用分子克隆技术构建原核表达载体pQE-EGFP,在大肠埃希菌中高效表达与鉴定。方法:以质粒pEGFP-N2为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,将其克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定表达蛋白质。结果:PCR扩增得到了EGFP全长结构基因。所构建的pQE-EGFP重组质粒经酶切及测序鉴定结果与设计序列一致;转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导后,目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量约为28 500,与理论预期值一致。结论:pQE-EGFP重组质粒的成功构建、表达和鉴定为TAT-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

EGFP逆转录病毒载体构建及在人骨髓间质干细胞中的表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒载体,转染人骨髓间质干细胞(hMSCs),探讨EGFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法:构建携带EGFP基因的逆转录病毒载体,用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入包装细胞,取阳性包装细胞克隆的病毒上清感染hMSCs,筛选稳定表达EGFP的细胞克隆(hMSCs-EGFP),MTT法测定hMSCs-EGFP的生长曲线。结果:病毒上清转染hMSCs后,绿色荧光蛋白能稳定表达一个月以上,生长曲线显示转基因细胞增殖速度和未转染细胞无明显差别。结论:hMSCs转染EGFP后,不影响其生长,EGFP可作为组织工程种子细胞良好的示踪剂。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

犬腺病毒1型疫苗株E3缺失表达载体的构建

目的：探索以犬腺病毒1型疫苗株（Cannaught Laboratory Limited,CLL）作为病毒重组疫苗和基因转移载体的可行性。方法：构建带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的E3缺失重组病毒CLLEGFP,将CLLEGFP感染各种人源细胞,并以灌胃,腹腔注射,尾静脉注射和肌肉注射等不同途径接种昆明小鼠,多时间点取小鼠组织标本,冷冻干燥切片,观察EGFP的表达,4周后采集小鼠血清,以Western blot分析抗EGFP抗体的产生,结果：CLLEGFP能够感染各种人源细胞并表达EGFP,在腹腔接种CLLEGFP3d的小鼠肝细胞细胞中可见转导的EGFP。Western blot分析显示,以各种途径免疫接种重组病毒4周后的小鼠血清中均存在抗EGFP特异抗体,结论：CLL具有开发成为病毒重组疫苗和苈转移载体的潜力。     

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

人S—100β表达载体的构建,体外表达和表达产物的纯化

构建人Ｓ－１００β表达载体并体外表达和表达产物的纯化。方法用ＲＴ－ＰＣＲ产生人Ｓ－１００βｃＤＮＡ,插入质粒ｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ中构成表达载体,经ＩＰＴＧ体外诱导表达并经ＤＥ－５２和Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＣＬ４Ｂ纯化。结论所获人Ｓ－１００β表达载体为设计构建,体外表达的产物为人Ｓ－１００β,为进一步研究奠定基础。     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

pET22b-TP17表达载体的构建与鉴定

目的：采用原核基因工程技术构建表达梅毒螺旋体外膜脂蛋白TP17的载体,并进行酶切鉴定,为获得重组抗原TP17及其用于梅毒血清学诊断试剂的研究奠定基础。方法：将化学合成的寡核苷酸（oligo）通过PCIk的方法拼接成TP17目的基因的序列,并将合成好的序列克隆入pMD18-TSimple载体。以pMD18-TSimple-TP17为模板,PCtk扩增TP17基因片段。PCR产物通过1．5％琼脂糖凝胶电泳回收TP17条带,随后用EeoRI和XhoI对TP17回收所得片段及目的载体pET22b进行双酶切并连接。连接产物电转化至感受态细胞DH10B中后,挑取克隆,提取质粒并鉴定。最后将质粒转化至BL21菌株中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果：PCR扩增片段、双酶切均出现445bp大小的目的基因条带,与预期结果相符。结论：本研究成功构建了重组质粒pET22b—TP17,为下一步用IPTG诱导BL21菌株表达重组目的蛋白的研究奠定了基础。     

天然型EGFP在无细胞翻译系统中的可溶表达

目的:构建能在无细胞翻译系统中表达天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体.方法:以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,NcoI和HindⅢ双酶切EGFP基因和pET28a载体.T4 DNA连接酶连接,转化E.coli DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定.正确重组的载体命名为pET28a-EGFP.在无细胞翻译系统中加入大抽后的pET28a-EGFP模板(0.6 mg/ml),孵育3 h.荧光显微镜观察荧光.Western blot鉴定EGFP.结果:测序证实重组EGFP基因序列与基因库中的序列完全一致,荧光显微镜下观察到无细胞翻译系统中强烈荧光,Western blot证实分子量约为27 kD的EGFP高效表达.结论:成功构建了能在无细胞翻译系统中高效表达可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步建立荧光强度标准物奠定了基础.     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2的构建

目的：构建含人B7-2基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2。方法：应用RT-PCR、巢式PCR方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增出人B7—2 cDNA基闪片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒pGEM—T和pEGFP—C3上．结果与结论：酶切及测序证实成功构建了克隆载休pGEM—B7—2和真核绿色荧光表达载体pEGFP—C3—B7—2。     

果蝇神经特异性拼接因子Dxl6N变体在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

目的：表达与纯化果蝇中SR蛋白家族新成员Dxl6N端变体。方法：用PCR方法扩增得到Dxl6N端基因片段，经酶切亚克隆至pGEX-4T-1原核表达栽体。在大肠杆菌BL21（DE3）中与GST融合表达。并用谷胱甘肽-sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白。结果：表达产物以可溶形式经亲和层析柱纯化后获得相对分子质量约为37000的融合蛋白。结论：成功克隆、表达并纯化了果蝇神经特异性拼接因子Dxl6N端变体与GST的融合蛋白。     

含绿色荧光蛋白报告基因pUC18筛选载体的构建

目的：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因，将GFP基因克隆入pUC18建立大通量的筛选载体。方法：用PCR方法扩增目的DNA片段，碱裂解法小量制备质粒DNA，用限制性内切酶消化质粒DNA，用低熔点琼脂糖凝胶分离和纯化大片段DNA，GFP基因与pUC18连接，用氯化钙法转化感受态细胞，DNA序列测定，琼脂糖凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果：pUC18-atg-GFP载体意外表达GFP蛋白，新合成的上游引物与原下游引物扩增GFP基因，克隆入pUC18构建pUC18-GFP载体，通过PCR，酶切鉴定和DNA序列分析，GFP基因的读码框架与原设计方案完全一致，该载体自身无GFP表达。结论：筛选载体内的GFP基因与克隆基因的融合基因可表达一种融合蛋白，在琼脂平板上含有该融合基因的克隆在紫外线激发下可发绿色荧光，因此，可表达基因能被挑选出来。     

p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体。方法 将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察。结果 重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中。结论 成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具。     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达

在大肠杆菌中克隆及高效表达绿色荧光蛋白基因。方法；ＰＣＲ法克隆ＧＦＰ－Ｓ６５ＴｃＤＮＡ并改造其两端的限制性内切酶位点，构建重组原核表达载体ｐＲＳＥＴ－ＧＦＰＳ６５Ｔ。结果；在ＩＰＴＧ诱导条件下，ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ的表达量占细菌蛋白的 上。细菌培养物及其超声上清在长波紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的：进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备，为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法：构建pGEX-4T3—EGFP重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行原核表达，用亲和层析法纯化GST—EGFP，免疫BAB／c小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果：①目的蛋白GST—EGFP表达量为8g／L。②获得纯抗体溶液5m1。浓度为0．4g／L。③EGFP抗体在1：100000稀释度时，Western blot检测条带清晰，背景干净。结论：通过优化诱导条件，利用大肠杆菌可低成本获得大量GST—EGFP。直接使用GST—EGFP融合蛋白免疫BAB／c小鼠，可在较短时间内大量制备EGFP多克隆抗体。