带核定位信号的维甲酸受体α 与Ubiquilin 1蛋白相互作用的验证

目的：验证带有核定位信号的维甲酸受体α（nuclear localization signal-retinoic acid receptor α, NLS-RARα）与Ubiquilin 1（UBQLN1）蛋白之间的相互作用。方法：将表达NLS-RARα诱饵蛋白和UBQLN1靶蛋白的两种重组表达质粒pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建真核细胞表达载体pCMV-HA-NLS-RARα 和pCMV-Myc-UBQLN1,经酶切鉴定后,共转染HEK293细胞,利用抗HA多克隆抗体沉淀,抗Myc单克隆抗体检测验证他们之间的相互作用。结果：pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;构建的重组表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-UBQLN1经酶切鉴定成功,转染HEK293细胞后,用免疫共沉淀技术检测到Myc-UBQLN1蛋白的表达。结论：酵母双杂交和免疫共沉淀技术可验证NLS-RARα与UBQLN1之间存在相互作用。     

带核定位信号的RARα与JTV1蛋白相互作用的验证实验

目的 通过实验验证带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)与JTV1蛋白之间的相互作用.方法 将表达NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白的两种重组表达质粒共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术在体外验证二者之间的相互作用.结果 NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行免疫印迹检测,可以检测到Myc-JTV1蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术验证了NLS-RARα与JTV1间存在相互作用.     

利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用

目的 利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypothetical protein,HT036)和P311间的相互作用.方法 构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋白(Myc-P311)的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证HT036与P311间的相互作用.结果 构建的重组表达载体pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确,转染293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-P311相互作用蛋白复合物后,用抗HA单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到HA-HT036的表达.结论 成功构建了HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实HT036与P311之间存在着相互作用.     

利用酵母双杂交系统鉴定MIF与CD74胞外片段间的相互作用

目的利用酵母双杂交系统鉴定巨噬细胞移动抑制因子（MIF）与Ⅱ型穿膜蛋白CD74胞外片段间可能的相互作用区域。方法利用分子克隆技术,分别构建以pGBKT7为载体的人全长MIF、MIF50-65、MIF1-50/65-115的重组诱饵质粒,以pGADT7为载体的人CD7473-232、CD7473-109、CD74109-149、CD74149-232的重组激活域（AD）质粒。用PEG/LiAC法将上述重组诱饵质粒分别与重组AD质粒两两共转化感受态酵母菌AH109,分别观察在SD/-Trp-Leu、含X-α-gal的SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上生长情况。结果限制性内切酶酶切和DNA测序证实所构建的重组质粒全部正确。3种重组诱饵质粒转化的酵母菌AH109均可在SD/-trp上生长,4种重组AD质粒转化的酵母菌AH109均可在SD/-leu上生长,而且上述转化的酵母菌AH109均无自身转录激活活性。只有MIF、MIF50-65、MIF1-50/65-115与CD7473-232表达质粒共转化的酵母菌AH109可在SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上生长,能激活MEL1报告基因,使X-α-gal变蓝。结论MIF能以功能域MIF50-65非依赖性方式与完整的CD74胞外片段相互结合,进行细胞信号转导。     

带核定位信号的RARα与谷氨酸氨连接酶蛋白相互作用的胞内外验证

目的通过胞内外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)之间的相互作用。方法将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白的两种重组表达质粒共同转化入AH109酵母菌,采用一对一的酵母双杂交技术验证它们在活细胞内的相互作用;通过构建GLUL及NLS-RARα蛋白标签融合表达载体,共转染至人胚肾HEK293细胞,利用免疫共沉淀技术在细胞外验证它们之间的相互作用。结果 GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色的阳性克隆;GLUL蛋白及NLS-RARα标签融合表达载体构建成功,共同转染至HEK293细胞,采用抗HA多克隆抗体免疫沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,抗c-Myc单克隆抗体免疫印迹检测,检测到GLUL-cMyc蛋白。结论采用酵母双杂交和免疫共沉淀技术成功地在胞内外验证了GLUL与NLS-RARα之间存在特异性的相互作用。     

人早幼粒细胞cDNA文库中与GINS2发生相互作用靶蛋白的筛选和鉴定

目的:采用酵母双杂交系统筛选与人GINS2编码蛋白发生相互作用的靶蛋白,阐明其在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的致病信号及相关机制.方法:采用热激法将诱饵质粒pGBKT7-GINS2与人早幼粒细胞cDNA文库质粒共同转化至酵母AH109感受态细胞中,筛选与GINS2编码蛋白相互作用的文库蛋白.利用多重报告基因检测和D...     

酵母双杂交RRS筛选系统对已知蛋白间相互作用的验证

目的:通过一对已知蛋白Pak和Chp间的相互作用介绍酵母双杂交RRS筛选系统,以期将此系统更广泛的用于蛋白间相互作用的研究.方法:挑选酵母温度缺陷株cdc25-2的低回复突变单克隆,醋酸锂法制备酵母感受态细胞.重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak 单独转化酵母,排除诱饵蛋白的白激活作用.将两重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak和Ura-M-ChpAc共转化酵母,设置不同质粒组合和不同培养基平板作为对照,观察酵母在36℃的生长情况.结果:制备感受态的cdc25-2细胞无回复突变发生.质粒Met425-Myc-Ras-Pak转化酵母后对细胞既无毒性也无自激活作用.只有当能够表达两已知蛋白的重组质粒共转化酵母,并且在适合它们表达的培养基上,cdc25-2细胞才能够在36℃生长.结论:(1)RRS筛选系统正确验证了Pak和Chp间的相互作用,可将其用于其它已知蛋白间相互作用的研究.(2)可以利用某已知蛋白构建诱饵,通过RRS筛选系统去寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白.     

应用酵母双杂交系统筛选MRP2胞内区相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术研究与多药耐药蛋白MRP2发生相互作用的蛋白.方法 应用酵母双杂交系统,以人MRP2胞内区C末端220个氨基酸为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白.利用生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交等提供的信息,筛除假阳性.结果 经过酵母双杂交共获得162个克隆,经过验证分析,最终确定3个无重复阳性克隆.结论 获得的3个基因编码的蛋白可能揭示MRP2新的作用机制.     

聚合酶亚基间相互作用的抗流感病毒药物筛选体系的建立

目的构建基于聚合酶亚基间相互作用的双靶点特异性抗流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。方法将流感病毒A/PR8/34株PB2、PA基因克隆至载体pGADT7,PB1基因克隆至载体pGBKT7,将构建的酵母双杂交重组质粒PB2-pGADT7、PB1-pGBKT7和PA-pGADT7、PB1-pGBKT7分别共转化酵母AH109,利用SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基筛选阳性菌落。结果 PB2-PB1共转化效率为1.4×104cfu/μg,PA-PB1共转化效率为1.6×104cfu/μg;双靶点特异性的酵母双杂交系统在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal上均有兰色菌落生长;PB2、PB1、PA基因PCR结果均为阳性。结论初步构建了流感病毒聚合酶亚基间相互作用的酵母双杂交系统,可用于抗流感病毒靶点特异性的药物高通量筛选。     

早老蛋白氨基端与羧基端结构域的相互作用

目的研究早老蛋白分子相互作用及相互作用结构域。方法利用 RT- PCR扩增人早老蛋白- 1和早老蛋白- 2全长 cDNA。在此基础上构建多种缺失体,采用酵母双杂交体系分析它们之间的相互作用。结果 (1）早老蛋白- 1的氨基端多肽与羧基端多肽之间存在直接的相互作用,能形成同源二（多）聚体。早老蛋白- 1羧基端相互作用位点定位于第 361～ 447位氨基酸。这一相互作用不依赖于其旁侧亲水环结构功能域的存在,也无需其它配体参与;（ 2）早老蛋白- 1氨基端片段或羧基端片段自身之间均不能形成同源二（多）聚体;（ 3）早老蛋白- 2氨基端多肽与羧基端多肽之间也存在上述相互作用,能形成同源二（多）聚体;（ 4）早老蛋白- 1的羧基端片段与早老蛋白- 2的氨基端片段、早老蛋白- 2的羧基端片段与早老蛋白- 1的氨基端片段不发生相互作用。结论早老蛋白氨基端多肽与羧基端多肽之间直接的相互作用可能参与、并有助于早老蛋白的装配和成熟,是其功能的结构基础。     

狼疮肾炎与妊娠的相互影响

【目的】探讨狼疮肾炎与妊娠的相互影响。【方法】回顾性分析 2 42次与狼疮肾炎有关的妊娠 ,研究狼疮肾炎病程和妊娠结果间的相互影响。【结果】患狼疮肾炎的妇女妊娠成功率低 ,新生儿存活率仅 30 %,显著低于无狼疮肾炎组(90 %,P <0 0 1) ,而死胎 (产 )的比例 (39%)显著高于无狼疮肾炎组 (3%,P <0 0 1)。有 49%的妊娠伴有狼疮肾炎加重。【结论】选择适当受孕时机和积极控制狼疮肾炎活动是提高狼疮肾炎妇女妊娠成功率的关键。     

功能性硫化锌纳米荧光探针与DNA的相互作用

目的:研究L-半胱氨酸包裹的ZnS纳米荧光探针与核酸的相互作用及其机理,建立DNA的定量分析方法。方法:通过考察溶液pH值、缓冲液用量及粒子浓度等影响因素,在最佳试验条件下,利用在pH值近中性时DNA对纳米荧光探针具有猝灭作用的特性,采用荧光光谱法进行研究。结果:当DNA浓度为20~600μg/L时,荧光强度与DNA的浓度呈良好的线性关系,检测限为0.032μg/L。结论:该方法简单,快速,灵敏度高。DNA与L-半胱氨酸-ZnS纳米粒子存在静电作用。     

Nelin与F-actin及Filamin相互作用的鉴定

目的 在用酵母双杂交方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选，得到3个阳性克隆的基础上，进一步探讨新基因Nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的功能，并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质。方法采用基因转染和表达技术，在真核细胞内外分别进行了Nelin蛋白与肌动蛋白（F-actin）结合的共沉降及免疫荧光共定位实验。并通过免疫共沉淀实验进一步验证所得的实验结果。结果 证实了在细胞内外Nelin蛋白均能同F-actin相结合；还能与Filamin的D末端免疫球蛋白样结构发生相互作用。结论 Nelin为一个新的兼有actin及Filamin结合能力的蛋白。在心肌细胞内，Nelin很可能作为一个膜一细胞骨架连接蛋白，参与了细胞黏着斑形成的过程。     

家庭变化与全科医学互动关系探析

全科医学是以人为中心，以维护和促进健康为目标，向个人、家庭与社会提供连续、综合、便捷的基本卫生服务的新型医学学科。家庭的变化是促使全科医学形成和发展的一个重要因素，而全科医学的形成和发展也对家庭产生了重要影响。     

Interaction Between Polysaccharides and Other Substances. Non-Equilibrium Conditions

Abstract

Platelet-derived growth factor B (PDGF-B) is a growth factor promoting and regulating cell migration, proliferation, and differentiation, involved in both developmental processes and in maintaining tissue homeostasis under strict regulation. What are the implications of prolonged or uncontrolled growth factor signaling in vivo, and when does a growth factor such as PDGF-B become an oncogene? Under experimental conditions, PDGF-B induces proliferation and causes tumor induction. It is not known whether these tumors are strictly a PDGF-B-driven proliferation of cells or associated with secondary genetic events such as acquired mutations or methylation-mediated gene silencing promoting neoplasia. If PDGF-B-driven tumorigenesis was only cellular proliferation, associated changes in gene expression would thus be correlated with proliferation and not associated with secondary events involved in tumorigenesis and neoplastic transformation such as cycle delay, DNA damage response, and cell death. Changes in gene expression might be expected to be reversible, as is PDGF-B-driven proliferation under normal circumstances. Since PDGF signaling is involved in oligodendrocyte progenitor cell differentiation and maintenance, it is likely that PDGF-B stimulates proliferation of a pool of cells with that phenotype, and inhibition of PDGF-B signaling would result in reduced expression of oligodendrocyte-associated genes. More importantly, inhibition of PDGF signaling would be expected to result in reversion of genes induced by PDGF-B accompanied by a decrease in proliferation. However, if PDGF-B-driven tumorigenesis is more than simply a proliferation of cells, inhibition of PDGF signaling may not reverse gene expression or halt proliferation. These fundamental questions concerning PDGF-B as a potential oncogene have not been resolved.     

胃癌组织中Notch1与BPHL基因融合产物的表达及意义

目的:探索Notch1与BPHL基因融合产物在胃癌组织中的表达和临床意义。方法:选取2018年5月至10月我院肿瘤外科50例初治、手术治疗且术后病理证实为胃癌患者的术后石蜡标本为研究对象,分别使用RT-PCR法及ARMS基因检测法检测胃癌组织、癌旁组织、转移淋巴结及正常胃黏膜中Notch1与BPHL基因融合产物的表达情况,分析其与不同临床病理类型的关系。结果:6例胃癌组织中检测到Notch1与BPHL基因融合产物,阳性率12.0%,癌旁组织和正常胃黏膜未检测到融合基因产物;性别间Notch1与BPHL基因融合产物检出阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05);是否淋巴结转移组间Notch1与BPHL基因融合产物检测阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05);不同分化程度组间Notch1与BPHL基因融合产物检测阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05);不同浸润深度组间Notch1与BPHL基因融合产物检测阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:胃癌组织中Notch1与BPHL基因融合产物高表达可能参与胃癌的浸润及转移,对胃癌的诊断和治疗具有一定应用价值。?     

妇炎洁泡腾片各成分的鉴别

目的：建立妇炎洁泡腾片各成分的鉴别方法。方法采用薄层色谱法对大黄、金银花、白芷、冰片进行定性鉴别。结果用薄层色谱法对大黄、金银花、白芷、冰片进行定性鉴别,专属性强、斑点清晰、分离度高、灵敏度高、重复性好、阴性对照无干扰。结论用薄层色谱法鉴定妇炎洁泡腾各成分的方法可靠、准确,可用于妇炎洁泡腾片成分的监测。     

人血清蛋白与两种天然抗癌有效成分的相互作用

本文应用平衡透析法在pH7.4,振动频率为140～160次/min,25℃恒温条件下,研究了喜树碱和秋水仙碱两种天然抗癌有效成分与人血清蛋白的相互作用.实验结果表明,喜树碱和秋水仙碱均能透过Viskisg纤维素膜.秋水仙碱与人血清蛋白二者的浓度均为1×10~(-5)～5×10~(-5)mol/L时,其结合率几乎为零,而喜树碱与人血清蛋白则有较强的结合力;当喜树碱的浓度为1×10~(-5)～2×10~(-5)mol/L,人血清蛋白浓度条5×10~(-6)～1×10~(-4)mol/L时,结合常数为9.58×10~4mol~(-1),并且喜树碱在人血清蛋白分子上有唯一的结合部位,经荧光光法测知,该结合部位在人血清蛋白分子的U部位.