N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶早期预测经皮肾镜取石术后急性肾损伤的价值

目的：前瞻性研究尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶（Nacetyl—β—D-glucosaminidase,NAG）在经皮肾镜取石（percutaneous nephrolithotomy,PCNL）患者发生急性肾损伤中的诊断价值。方法：采集2011年lO月～2013年1月期间住院的90例行PCNL手术患者的术前及术后相关病史资料,其中男64例,女26例,平均年龄（52．8±9．7）岁。采用比色法方法检测患者术前、术后尿液NAG水平,并检测血清肌酐值,进行综合分析。结果：PCNL术后,患者尿液NAG水平较术前有不同程度上升,术后各时间点尿液NAG活性均较术前显著升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。术后有11例发生急性肾损伤（acute kidney inury,AKI）,79例未发生AKI。AKI组和非AKI组比较,两组年龄、性别比例、基础肌酐的差异无统计学意义（P〉0．05）,但手术时间、术后感染率、CRP、住院天数方面的差异有统计学意义（P〈0．05）。术后2小时,AKI组NAG水平明显升高,且显著高于非AKI组（P〈0．05）。ROC曲线分析术后24小时尿液NAG上升幅度百分比,当检测截点为235．44％时,曲线下面积为0．878（P〈0．01）,其诊断AKI敏感度为81．8％,特异度为91．1％。结论：PCNI。术后发生AKI的患者尿NAG活性显著升高。其较血清肌酐更敏感、更早期地反映肾功能出现受损。手术时间、术后感染率可能是发生AKI的风险因子,尿NAG活性在PCNL术后早期诊断AKI具有一定的临床价值。     

草菇中木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

草菇(Volvariellavolvacea)在20L发酵罐中以稻草粉为基质进行培养,所产生的β 木糖苷酶(β 1,4 xylosidase,EC3.2.1.37)经硫酸铵沉淀、苯基 琼脂糖(Phenyl agarose)疏水性柱层析、DEAE Sephacel阴离子柱层析、TOSOHASS HW 5S分子筛过滤分离等提纯步骤,达到了电泳纯,提纯倍数为241倍,收率为14.5%.该酶反应的最适pH值为6.41～6.76,最适温度为55℃;在pH值5.78～7.68之间酶活力相对稳定,52℃的半衰期(t1/2)为1h.由凝胶过滤和SDS PAGE测得酶由4个亚基组成,酶的相对分子质量为2825000.在所测定的底物中,β 木糖苷酶仅对对硝基苯基 β D 木糖苷有专一性水解作用,其对对硝基苯基 β D 木糖苷水解的动力学参数Km值为2.4mmol/L,vmax为42μmol/(min·mg).该酶催化对硝基苯基 β 木糖苷水解将产物β 木糖反转成α 木糖.     

尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶水平与新生儿窒息后肾损伤关系

目的探讨新生儿窒息后尿 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-beta-D-glu-cosaminidase,NAG）、血清中α1微球蛋白（α1-microglobulin,α1-MG）、β2-MG 值水平变化以及与窒息程度和急性肾损伤（acute kidney inj ury,AKI）之间的关系,阐述其在窒息新生儿肾损伤中的诊断价值。方法选择围产期窒息新生儿40例（窒息组）,按照新生儿窒息Apgar评分标准分为轻度窒息者22例（轻度窒息组）,重度窒息者18例（重度窒息组）;根据有无发生 AKI 将40例窒息新生儿分为AKI组25例和无 AKI组15例;记录入选新生儿 Apgar评分、胎龄、日龄、体质量。另外选择20例无窒息史新生儿为对照组。所有纳入对象在出生后24 h内采取外周静脉血,同时收集尿液。采用胶乳增强免疫比浊法测定血清中α1-MG、β2-MG的含量;采用 ELISA法测定尿液中 NAG含量;同时用全自动生化仪检测尿素氮及血肌酐水平。结果（1）本研究40例窒息后新生儿 AKI 总发生率为62.5%（25/40）,并且轻度窒息与重度窒息对 AKI 影响不同,重度窒息患儿更易发生严重的肾损伤。（2）窒息组尿 NAG及血清中β2-MG、α1-MG明显高于对照组[（25.48±12.45）U/L 比（8.62±2.49） U/L,（4.82±1.32）mg/L比（2.92±0.89）mg/L,（29.85±5.59）mg/L 比（25.23±5.26）mg/L]。（3）重度窒息组尿 NAG及血清中β2-MG、α1-MG 明显高于轻度窒息组[（32.21±24.32）U/L、（5.89±1.59）mg/L、（34.32±7.64）mg/L]明显高于轻度窒息组[（17.25±7.32）U/L、（2.92±0.89）mg/L、（26.94±5.57）mg/L]。（4）AKI组尿 NAG及血清中β2-MG、α1-MG[（28.24±21.25）U/L、（5.79±1.49）mg/L、（31.32±5.28）mg/L]明显高于无 AKI组[（16.34±6.72））U/L、（2.82±0.79）mg/L、（26.49±5.52）mg/L]。（5）按照对照组尿 NAG及血清中β2-MG、α1-MG值设定在x＋2SD为对照上限值,窒息组中尿 NAG异常率达65%,明显高于血清中β2-MG、α1-MG 异常率（分别为32.5%和7     

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

将来自嗜热脂肪芽孢杆菌IAM 110 0 1的高温乳糖酶基因bgaB亚克隆到具强启动子的大肠杆菌载体 pKK 2 2 3 3中 ,经IPTG诱导后 ,表达出的重组蛋白质仍具有耐高温活性 ,其相对分子质量与天然蛋白质相似 ,表达量为 1.5U/mg ,比出发菌株高 10倍     

尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶在IgA肾病肾小管间质损伤中的评估价值

目的评估尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶在IgA肾病肾小管间质损伤中的价值。方法回顾性分析2014年2月至2018年6月于本院行肾穿刺活检确诊为IgA肾病的患者82例,分为NAG正常组(NAG<12 U/L,14例)、NAG升高组(NAG>12 U/L,68例);分析两组患者间临床与病理指标的差异,并评估NAG与肾小管间质病变的相关关系。结果NAG正常组的NAG、血肌酐、胱抑素-C、尿微量白蛋白的统计量显著低于NAG升高组(P<0.05),NAG正常组的eGFR的统计量显著高于NAG升高组(P<0.05),病理改变中,NAG正常组的肾小球系膜细胞增殖、肾间质炎症细胞浸润、肾间质纤维化、肾小管萎缩积分显著低于NAG升高组,进一步logistic回归分析显示微量白蛋白、eGFR、系膜增殖、肾小管间质的病理改变为影响NAG水平的独立危险因素。结论尿NAG水平与患者eGFR、mALB以及小管间质病变密切相关,可以作为评估和监测IgAN的小管间质病变程度的临床指标。     

具有β-半乳糖苷酶转苷能力的菌株筛选及鉴定

以乳糖为惟一碳源,5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)为显色剂,从土壤中筛选出10株产β- 半乳糖苷酶较高、生长较好的菌株.在30 ℃下发酵产酶,测定邻硝基苯- β- D-半乳糖苷(ONPG)水解能力.在50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中,加入400 g/L乳糖和200 g/L果糖,并分别添加10株菌所产β- 半乳糖苷酶, 至酶活为400 U/L,37 ℃下反应8 h,经高效液相色谱分析,编号为2-1样品中含有乳果糖.通过形态特征和16S rDNA 序列分析,鉴定菌株2-1为节杆菌属.     

乳腺癌浸润和转移与乙酰肝素酶表达的关系

目的 观察乙酰肝素酶(Hpa)在乳腺癌的表达,探讨它们的表达与乳腺癌浸润、转移的关系及临床意义.方法 对60例未行任何化疗、放疗和内分泌治疗的原发性乳腺癌病理标本进行分析,应用苏木素-伊红(HE)染色观察乳腺癌的组织形态和病理学变化;应用免疫组织化学法检测乳腺癌患者癌组织、癌旁2 cm乳腺组织及距癌组织5 cm以上的正常乳腺组织中Hpa的表达.结果 60例乳腺癌病理标本免疫组织化学结果显示,乳腺癌组织Hpa阳性表达率为68.33％ (41/60),癌旁组织(癌旁2 cm)Hpa阳性表达率40.00％(24/60),正常组织Hpa阳性表达率0.00％ (0/60).统计分析结果显示,与正常对照组织比较,Hpa在癌组织和癌旁组织表达升高且差异有统计学意义(P＜0.01).Hpa的表达与乳腺癌临床病理标志的相互关系分析结果显示:Hpa的表达与乳腺癌患者体内瘤块直径、组织学分级、腋下淋巴结状况及临床分期明显相关(P＜ 0.05),与患者年龄无明显相关(P＞0.05).而且具有腋下淋巴结转移的患者Hpa阳性表达率显著高于无腋下淋巴结转移组(P＜0.01).结论 Hpa在乳腺癌中的表达均较高,明显高于癌旁组织及正常乳腺组织;Hpa的表达与乳腺癌肿瘤大小、组织学分级、临床分期、淋巴结转移密切相关,与患者的年龄无明显相关.     

中压液相色谱快速分离纯化Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶

应用AKTA explorer 100型中压液相色谱快速纯化工艺，系统分离纯化了脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）β-D-半乳糖苷酶。K．fragilis发酵生产的菌体细胞经过破碎、离心后的上清液中含有K．fragilis β-D-半乳糖苷酶。粗酶经过AKTA explorer 100中压液相色谱的Hiprep^R 16／10 Source 30Q强阴离子交换柱和Hioad26／60 Superdex凝胶过滤色谱连续两步纯化，酶的回收率为27％，纯化倍数为42。纯化的K．fragilis β-D-半乳糖苷酶在垂直板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上，呈现一条染色谱带，表明纯化的酶具有较高的纯度。K．fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶相对分子质量约为60 000。     

全麻下泌尿外科后腹腔镜手术对患者尿NAG、血β2-微球蛋白的影响

目的探讨全麻下泌尿外科后腹腔镜手术对尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）、血β2-微球蛋白（β2-MG）的影响。方法 33例气管内插管全身麻醉下行后腹腔镜非肾切除手术患者,对术前和术后0h、24h、48h及72h的血β2-MG、尿NAG指标进行检测,应用统计学方法分析指标动态变化规律,并且比较不同气腹时间与术后各指标变化情况。结果与手术前相比,术后24～48h血β2-MG、尿NAG均有不同程度的增高,术后24～48h达到最高值;术后72h其水平下降明显降低,术前后变化差异具有显著性意义;比较不同气腹时间与各指标变化发现,气腹时间大于60min对血β2-MG、尿NAG、尿肌酐（Cr）影响较明显。结论全麻下实施泌尿外科保留肾脏后腹腔镜手术,可导致患者术后早期血β2-MG、尿NAG水平增高,但这种改变是可逆的,提示泌尿外科后腹腔镜手术可能对肾小球滤过功能及肾小管重吸收功能有一定影响。     

肾损伤分子-1、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶及尿微量白蛋白在重症感染中合并急性肾损伤的临床观察

目的 探讨尿肾损伤分子-1(Kim-1)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acecyl-β-D-glucosaminidase,NAG)及尿微量白蛋白(mALB)在重症感染中合并急性肾损伤的敏感性及临床价值.方法 回顾分析60例在本院ICU住院的重症感染合并急性肾损伤(AKI)患者的尿Kim-1、尿NAG及尿m...     

低氧时反义寡核苷酸对胰腺癌乙酰肝素酶表达及侵袭力的影响

目的 研究低氧对胰腺癌乙酰肝素酶(Hpa)表达的影响及与肿瘤细胞侵袭力的关系.方法 体外低氧培养细胞,观察低氧在不同时间胰腺导管癌细胞株BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白表达的变化;以Tranwell侵袭小室实验观察低氧及应用反义寡核苷酸(AS-ODN)阻断Hpa表达后肿瘤细胞侵袭力的变化,明确低氧促进肿瘤细胞侵袭力增加是否与Hpa有关.结果 在常氧条件下,BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白即有低量表达.在低氧条件下,Hpa mRNA和蛋白表达在3 h受到轻度抑制,在6 h、12 h、24 h和48 h表达明显升高,且mRNA和蛋白的表达水平一致.预先以Hpa AS-ODN序列阻断Hpa的表达,则低氧不能诱导Hpa mRNA和蛋白表达上调.低氧使穿过Transwell小室的BxPC-3细胞数量增加了96.2%(P<0.01),Hpa AS-ODN(400 nmol/L)对低氧诱导的侵袭细胞的抑制率为37.2%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 低氧可通过上调胰腺癌BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞侵袭力.     

低氧时反义寡核苷酸对胰腺癌乙酰肝素酶表达及侵袭力的影响

目的 研究低氧对胰腺癌乙酰肝素酶(Hpa)表达的影响及与肿瘤细胞侵袭力的关系.方法 体外低氧培养细胞,观察低氧在不同时间胰腺导管癌细胞株BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白表达的变化;以Tranwell侵袭小室实验观察低氧及应用反义寡核苷酸(AS-ODN)阻断Hpa表达后肿瘤细胞侵袭力的变化,明确低氧促进肿瘤细胞侵袭力增加是否与Hpa有关.结果 在常氧条件下,BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白即有低量表达.在低氧条件下,Hpa mRNA和蛋白表达在3 h受到轻度抑制,在6 h、12 h、24 h和48 h表达明显升高,且mRNA和蛋白的表达水平一致.预先以Hpa AS-ODN序列阻断Hpa的表达,则低氧不能诱导Hpa mRNA和蛋白表达上调.低氧使穿过Transwell小室的BxPC-3细胞数量增加了96.2%(P<0.01),Hpa AS-ODN(400 nmol/L)对低氧诱导的侵袭细胞的抑制率为37.2%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 低氧可通过上调胰腺癌BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞侵袭力.     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstearothermophilus的耐热β 半乳糖苷酶基因bgaB被克隆到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中,然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合载体pSAS144中,转化Bacillussubtilis受体菌BD170,在5μg/mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子.经摇瓶发酵后,得到耐热乳糖酶的比酶活为0.32U/mg,是出发菌株比酶活的2倍.     

益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织中乙酰肝素酶、转化生长因子β_1表达的影响

目的:观察益肾通络方对膜性肾病(MN)大鼠肾组织中乙酰肝素(Hpa)、转化生长因子β1(TGF-β1)的影响。方法:将SD大鼠随机分为正常组、模型组、贝那普利组、中药组,各组按相应剂量灌胃,于第9周末观察24 h尿蛋白定量、血清总蛋白(TP)、白蛋白(Alb);免疫荧光、电镜及免疫组化法检测各组大鼠Hpa、TGF-β1在肾组织的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠出现大量蛋白尿,血清TP、Alb均明显降低,血清TC、TG均明显升高,肾脏病理出现损害,肾小球内Hpa、TGF-β1表达显著增强(P0.05);与模型组相比较,各治疗组24 h尿蛋白定量,总胆固醇(TC)及三酰甘油(TG)均明显降低,血清TP、Alb均明显升高,肾脏病理损害较轻,肾小球内Hpa、TGF-β1表达减少(P0.05)。中药组与贝那普利组比较差异有统计学意义(P0.05),中药组优于西药组。结论:益肾通络方可显著降低MN大鼠尿蛋白、提高血浆蛋白,改善血脂代谢,能够抑制Hpa、TGF-β1在肾组织中的表达,抑制膜性肾病大鼠肾小球基底膜(GBM)免疫复合物的沉积以及基底膜的增厚,促进受损的肾小球基底膜修复,从而减轻肾脏损伤,延缓肾脏慢性病理进展。     

β-葡萄糖醛酸苷酶基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达

目的：探讨β-葡萄糖醛酸苷酶（βG）基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达的可行性。方法：采用基因工程技术构建带βG基因的真核表达载体，利用脂质体介导法在体外将βG基因导入人膀胱癌T24细胞，利用mRNA打点杂交、原位杂交、免疫组织化学、Western bloting 方法检测βG基因的转录和表达情况。结果：成功克隆出含人βG基因全长的真核表达载体pcDNA3.1-βG，以阳离子脂质体LipofectAMINE为载体将βG基因转染T24细胞后，经400mg/L的G418筛选后可形成抗性克隆；βG基因打点杂交和原位杂交结果显示转基因细胞中有βGmRNA的高表达；免疫组织化学和Western bloting证实转基因细胞中有βG蛋白的强阳性高表达。结论：βG基因可被成功转染入人膀胱癌细胞并能有效表达。     

β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的实验研究

目的观察β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷对膀胱癌EJ细胞生长及凋亡的影响,探讨β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前药系统用于膀胱癌治疗的应用前景。方法用不同浓度的苦杏仁苷与β-葡萄糖苷酶共同作用于膀胱癌EJ细胞株,用MTT法检测细胞的增殖活性,倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率与凋亡周期。结果与单纯用苦杏仁苷作用相比,加入β-葡萄糖苷酶后膀胱癌EJ细胞的增殖明显受限,增值抑制率可以达到前者的8.19倍;倒置显微镜和透射电镜观察到肿瘤细胞呈现凋亡的表现,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率增加、多数肿瘤细胞阻滞于S期,这些改变随着苦杏仁苷浓度的增加而明显增强。结论β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷后能够明显抑制EJ细胞的增长,其作用机制可能与将肿瘤细胞阻滞于S期而诱导其凋亡有关;β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前药系统可能成为治疗膀胱癌的有效策略。     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 .     

咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性检测

目的:初步证实咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性.方法:通过PCR扩增得到咖啡豆α-半乳糖苷酶基因克隆到载体pGEM-T easy,目的片段与预期的大小一致.咖啡豆α-半乳糖苷酶基因与分泌性原核表达载体pAS18连接,转化到宿主菌E.coli JM83.经过IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE电泳分析,Western-blot印迹证实蛋白表达的特异性.结果:PCR扩增得到目的片段测序结果正确.SDS-PAGE电泳分析得到目的蛋白41 kD,经过Western blot鉴定正确.ELISA检测证实咖啡豆α-半乳糖苷酶具有生物活性.结论:优化诱导条件,初步证实重组咖啡豆α-半乳糖苷酶基因具有生物活性.     

乙酰肝素酶2蛋白的表达与胰腺癌浸润、转移的关系及其意义

为探讨乙酰肝素酶2（Hpa2）蛋白与胰腺癌浸润、转移的关系及其临床病理意义，笔者应用免疫组织化学染色法检测26例胰腺癌组织中Hpa2蛋白的表达和微血管密度（MVD）。结果示Hpa2蛋白在正常胰腺组织中不表达，而在胰腺癌组织中的阳性率为69.23%（18/26），在癌旁组织中阳性率为33.33%（7/21），两者差异有显著性（P<0.05）。癌组织MVD为19.47±5.14，癌旁组织MVD为14.17±5.84，差异亦有显著性（P<0.05）。胰腺癌组织中Hpa2蛋白的表达和MVD分别与患者的年龄、性别、肿瘤直径无关（P>0.05），但与肿瘤的临床分期、包膜是否完整、是否有淋巴结转移有关（P<0.05）。Hpa2表达阳性组的MVD［（20.84±4.99）/HP］高于Hpa2表达阴性组MVD［（16.39±4.26）/HP］（P<0.05）。提示Hpa2蛋白可能参与胰腺癌的发生和发展过程，对判断胰腺癌的浸润、转移有一定的参考价值。