洋葱伯克霍尔德氏菌L68邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、表达和纯化

采用自行设计的引物,从洋葱伯克霍尔德氏菌L68中PCR扩增得到phnE（邻苯二酚2,3-双加氧酶）基因,亚克隆到高表达载体pET 32a上,转入表达菌株中.经双向测序,证实构建过程中未出现突变.重组子经IPTG诱导后,可以表达有活性的重组双加氧酶.选择26 ℃进行重组蛋白诱导.薄层扫描显示,表达重组蛋白总量最高可占总蛋白的64.92%.利用金属螯合层析对重组蛋白进行了一步纯化,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白纯度达到95%.     

吲哚胺2,3双加氧酶在移植中的作用

吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)是一种免疫调节酶,可催化色氨酸分子中吲哚环发生氧化裂解,是其沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶.IDO具有免疫调节作用,树突状细胞(DC)是一种功能强大的抗原递呈细胞(APC),是唯一能够激活初始型T细胞的APC.IFN-γ等可刺激其表面表达IDO,并通过降解色氨酸,使局部组织中的色氨酸耗竭,代谢产物犬尿氨酸含量增加,从而抑制T细胞的增殖.因此DC表面表达IDO可能在移植中诱导免疫耐受方面起着重要的作用.     

诱导小鼠树突细胞表达吲哚胺2,3双加氧酶的研究

目的观察吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)在小鼠树突细胞(DC)中的表达及对T细胞增殖的影响。方法培养小鼠脾和骨髓DC并检测表型;γ-干扰素(IFN-γ)诱导IDO表达,半定量逆转录-聚合酶链式反应、Western blot及毛细管电泳法分析IDO表达水平及活性,混合淋巴细胞反应(MLR)法测定其刺激T细胞增殖的能力。结果脾、骨髓DC的CD8α阳性表达率分别为(15．46±0．85)％、(1．68±0．16)％;两者在mRNA和蛋白水平的IDO表达量相似。脾DC上清液犬尿酸浓度(43．31±0．48)μmol／L高于骨髓DC(7．38±0．38)μmol／L,脾DC刺激指数(SI,2．41±0．18)低于骨髓DC(2．92±0．15),差异均有统计学意义(P<0．01);加1-甲基色氨酸后脾DC的SI增高而骨髓DC变化不明显,两者水平相当。结论小鼠脾DC可表达活性IDO,活性IDO的表达可减弱其刺激T细胞增殖的能力。     

色氨酸2,3-双加氧酶在色氨酸分解代谢及免疫调节中的作用

色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)是催化色氨酸由犬尿氨酸(Kyn)途径分解代谢的限速酶.TDO主要在肝内降解色氨酸,调整体内色氨酸水平,能够抑制T细胞增殖,参与抗菌及炎性反应.代谢产物Kyn为芳烃受体(AhR)的内源性配体,TDO-Kyn-AhR通路具有调节肿瘤生长作用.随着对TDO介导色氨酸代谢免疫机制研究的不断积累,其在肿瘤治疗及移植免受耐受领域的应用前景令人期待.本文就TDO介导的色氨酸分解代谢及免疫调节作用进行综述.     

黑曲霉496-1菌株植酸酶的分离纯化及酶学性质

黑曲霉(A.niger)496 1菌株所产胞外植酸酶,经透析浓缩、DEAE cellulose离子交换层析及SephadexG 75,Sephacryl100凝胶过滤,获得了2个植酸酶,其相对分子质量分别为64200及41100.该2个植酸酶的最适pH分别为6.0和3.0,最适温度分别为55℃和40℃.初步确定一个是中性植酸酶,另一个为酸性植酸酶.     

吲哚胺2,3双加氧酶和叉状头转录因子3对胆囊癌免疫耐受的作用及影响

目的 研究吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)、叉状头转录因子3(FOXP3)在原发性胆囊腺癌中的表达情况,探讨其对胆囊癌细胞免疫耐受的作用及影响.方法 采用免疫组化SP法检测51例原发性胆囊腺癌组织、90例慢性胆囊炎组织和20例正常胆囊组织中IDO和FOXP3的表达情况.结果 IDO和FOXP3在胆囊癌组织的阳性率分别为72.5％(37/51)和60.8％(31/51);在正常对照组胆囊黏膜阳性表达率分别为5.0％(1/20)和20.0％(4/20);在胆囊炎及胆囊结石分别为11.1％(10/90)和32.2％(29/90).三组间IDO和FOXP3阳性表达率差异均有统计学意义(P＜0.01).IDO在单纯增生、不典型增生、胆囊癌Ⅰ～Ⅲ期和胆囊癌Ⅳ～Ⅴ期的阳性表达率分别为7.1％、17.7％、40.0％和77.4％,FOXP3的阳性表达率分别为14.3％、35.3％、35％和64.5％,IDO和FOXP3在单纯增生、不典型增生、胆囊癌Ⅰ～Ⅲ期和胆囊癌Ⅳ～Ⅴ期的阳性率差异均有统计学意义(IDO:x2=50.75,P＜0.01;FOXP3:x2=22.79,P＜0.01).胆囊癌在Nevin不同分期、有无淋巴结或远处转移、有无并发结石组间的IDO和FOXP3的阳性率表达差异均有统计学意义(P值均＜0.05),而不同性别、年龄、组织学分化程度间IDO和FOXP3的阳性率表达差异均无统计学意义(P均＞0.05).胆囊癌组织中IDO阳性表达率(69.8％)与FOXP3阳性表达率(58.1％)显著正相关(γ=0.406,P=0.003).结论 原发性胆囊癌组织中IDO的高表达,以及间质淋巴细胞FOXP3的表达与胆囊癌的免疫耐受密切相关.IDO可能为胆囊癌免疫治疗的新靶点.     

不同浓度γ干扰素诱导大鼠脾脏来源树突状细胞表达吲哚胺2,3-双加氧酶的变化及对T淋巴细胞增殖的影响

目的 观察不同浓度γ干扰素(IFN-γ)作用下大鼠脾脏来源的树突状细胞(DC)中吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO) mRNA和蛋白表达的变化及IDO对同种异体T淋巴细胞增殖的影响.方法 应用细胞因子体外诱导培养大鼠脾脏来源DC,应用流式细胞仪测定大鼠DC特异性分子OX62 和表面分子CD80、CD86的表达.分别用不同浓度(0、100、300、500 U/ml)的IFN-γ诱导作用DC后,实时聚合酶链反应( Real-time PCR)测定DC中IDO mRNA的相对表达水平,Westemblot检测DC中IDO蛋白在DC中的表达水平.同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)检测不同浓度IFN-γ诱导后的DC对同种异体T淋巴细胞增殖的影响.结果 体外诱导培养的DC光学显微镜下观察,具有典型的树枝状突起.0X62表达率达到80％以上,CD80、CD86的阳性表达也在80％左右;DC的IDOmRNA(2 -△△Ct值分别为:1.010 ±0.094、1.340±0.114、1.700±0.087、2.080±0.150)和蛋白的相对表达量(分别为:0.861 ±0.612、1.155±0.059、1.308±0.068、1.755±0.118)随着IFN-γ作用浓度的增大逐渐增大,分别为:不同浓度组间差异有统计学意义(P＜0.05);各组IFN-γ作用后DC与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率显著降低(P＜0.05);且随着IFN-γ作用浓度的增大T淋巴细胞的增殖率逐渐降低,A值分别为:0.458±0.041、0.423±0.030、0.349±0.019、0.312±0.036,各组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用改良的培养黏附法体外获得纯度较高的大鼠脾脏来源的DC;IFN-γ可以诱导大鼠脾脏来源DC表面活性IDO的表达增加,减弱脾脏DC对同种T细胞增殖的刺激能力.     

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质

茂原链轮丝菌Streptoverticilliummobaraense所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液通过抽滤、超滤、乙醇沉淀、离心和冷冻干燥,制得粗酶粉的酶活约为1033U/g.对粗酶研究发现,该酶的最适反应温度为52℃,最适pH为6.0;粗酶的pH稳定范围在4～8,温度稳定范围在20～40℃,离子强度对该酶的活性稍有影响.粗酶经CM 纤维素层析和SephadexG 75凝胶过滤层析后得到较纯的酶,通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白质纯度,得到较弱的单一区带.其中,CM 纤维素层析的纯化倍数为4.5,收率质量分数约为78.8%;凝胶过滤层析纯化倍数为1.11,收率质量分数为50%;用凝胶过滤法测得谷氨酰胺转胺酶的相对分子质量为40092.     

麦芽根中核酸酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵沉淀及色谱分离技术对麦芽根中核酸酶进行了分离纯化,通过Sephacryl S-200,DEAE Sephadex A-50 and Sephacryl S-2003步色谱分离,得到了部分纯化的两种核酸酶(Ⅰ和Ⅱ),核酸酶Ⅰ的纯化倍数为94,核酸酶Ⅱ的纯化倍数为1790.高效液相色谱显示两种酶作用于酵母RNA的产物均为5′-核苷酸.核酸酶Ⅰ的热稳定性比核酸酶Ⅱ好,在55℃下保温2h后,核酸酶I的活力损失仅13%,而核酸酶Ⅱ则高达64%.两种酶的最适温度分别为55℃和65℃.两种酶的pH稳定性相似,在pH2.5～9.0范围内很稳定.核酸酶Ⅰ的最适pH值为5.0和8.0～8.5,核酸酶Ⅱ的最适pH范围为4.0～5.5.     

盐藻胞外多糖分离纯化方法研究

盐藻培养液经离心、超滤浓缩得胞外多糖粗品溶液,然后用乙醇沉淀,丙酮及无水乙醚洗涤,并冷冻干燥得胞外多糖（Exopolysaccharides,EPS）粗品。粗糖经双酶解、透析等初步纯化后,用DE-52离子交换柱层析分离纯化得两种EPS组分（EPSⅠ和EPSⅡ）,琼脂糖凝胶电泳鉴定各自为均一的成分。经检测,两组分的糖质量分数以葡聚糖为对照分别为61.34%和52.81%,蛋白质质量分数3.97%和1.35%,且核酸质量分数小于0.025%,达到了比较高的纯度。     

一种苦瓜皂甙的分离纯化及结构推断

通过正相硅胶色谱和反相硅胶柱色谱从苦瓜中分离得到一种物质,定性检验该物质为苦瓜皂甙,薄层色谱检验为单一化合物,反相高效液相色谱鉴定其纯度为98.45%.进一步用质谱对其分子结构进行初步推断,这种皂甙是一个连有2个糖基的母核荷质比为491、相对分子质量为815的皂甙.     

顶青霉木聚糖酶的分离纯化与鉴定

使用硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５凝胶色谱脱盐、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５和ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０离子交换色谱等分离纯化技术，从顶青霉（Ｐｅｎｃｉｌｉｕｍｃｏｒｙｌｏｐｈｉｌｕｍ）培养液中分离到３种木聚糖酶组分，分别称为ＰａｒｔＡ、ＰａｒｔＢ和ＰａｒｔＣ．ＰａｒｔＢ和ＰａｒｔＣ经ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶过滤色谱和ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和色谱进一步分离纯化，分别得到２个纯木聚糖酶组分．ＰａｒｔＢ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为单带，相对分子质量为２４２００；ＰａｒｔＣ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定基本为单带，相对分子质量为４８３００     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶的分离纯化及性质

在有氧条件下,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Blue Sepharose CL 6B亲和层析提纯克雷伯杆菌胞内甘油脱氢酶.酶的纯化倍数和回收率分别为 32.61 倍和 5.83%.通过SDS PAGE电泳测得该酶亚基的相对分子质量约为 34 000.该酶最适表观反应温度和最适反应pH值分别为60 ℃和11.在30 ℃以下及pH值10~12时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH值11条件下,该酶以甘油和NAD 为底物的米氏常数Km分别为 0.75 mmol/L和 0.12 mmol/L.甘油脱氢酶对甘油的生理反应活性最大,对其它醇类如 1,2 丙二醇、乙二醇也有氧化能力.NH4 和Na 对酶有显著激活作用.巯基保护剂可明显地提高酶的活力.     

顶青霉木聚糖酶的纯化与性质

从顶青霉(Pencillium corylophilum)P-3-31培养液中分离到3种木聚糖酶组分，分别称为PartA、PartB和PartC.PartB进一步纯化，经SDS-PAGE鉴定为单带，相对分子质量为24200；PartC进一步纯化，经SDS-PAGE鉴定也是单带，相对分子质量为48300.PartA和PartB的最适反应条件为pH4.0,45℃;PartC的最适反应条件为pH5.5,55℃.PartA和PartB对木聚糖以外的底物不能水解；PartC具有水解CMC的交叉活性和β-木糖苷酶活性，但不能将木二糖水解成木糖.3个纯化酶组分和粗酶对不同来源的木聚糖底物均表现出不同的活性.对于粗酶，若桦木木聚糖为底物的相对酶活为100%，则玉米芯木聚糖为底物的相对酶活为143%，蔗渣木聚糖为底物的相对酶活为124%.     

解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究

通过采用盐析和透析等提纯方法，对解脂假丝酵母(Candidalipolytica)脂肪酶进行了纯化，比活提高了2.69倍，回收率45%.该酶反应的最适pH值为7.5，最适温度为38℃,pH稳定范围为6.0～7.5，温度稳定性较差，以2mol/L的蔗糖作保护剂效果较好.该酶为金属酶,5mmol/L的钙离子有较好的活化效果.     

金枪鱼碎鱼肉中肌红蛋白的初步提取和纯化

研究了从肌红蛋白含量较高的金枪鱼加工废弃物碎鱼肉中提取氧合肌红蛋白，得到了提取的最佳实验条件：样品体积2．5倍的0．01mol／LpH8．6Tris-HCI缓冲液、提取1．5h、硫酸铵饱和度90％盐析等，并经透析、DEAE-Sepharose FF离子交换柱进行了初步的层析纯化，得到蛋白质量分数迭87．11％的肌红蛋白。