编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与高效表达

利用PCR技术从大肠杆菌（既cherichia coli）中扩增出1．16kb的编码1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，将其连接到温控表达载体pHsh，得到重组哉体pHsh-yqhD，重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS-PAGE分析显示：融合表达产物的相对分子质量均为43000，同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yghD的基因工程菌进行表达研究表明：42℃诱导4h，1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到100IU／mg，而对照菌株的酶活力仅为0．5IU／mg。     

咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性检测

目的:初步证实咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性.方法:通过PCR扩增得到咖啡豆α-半乳糖苷酶基因克隆到载体pGEM-T easy,目的片段与预期的大小一致.咖啡豆α-半乳糖苷酶基因与分泌性原核表达载体pAS18连接,转化到宿主菌E.coli JM83.经过IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE电泳分析,Western-blot印迹证实蛋白表达的特异性.结果:PCR扩增得到目的片段测序结果正确.SDS-PAGE电泳分析得到目的蛋白41 kD,经过Western blot鉴定正确.ELISA检测证实咖啡豆α-半乳糖苷酶具有生物活性.结论:优化诱导条件,初步证实重组咖啡豆α-半乳糖苷酶基因具有生物活性.     

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1多拷贝表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR的方法从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) 中扩增出3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因及侧翼序列 CgGPD1,分别构建了含不同 CgGPD1 拷贝数的根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1(Ⅰ)、pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1(Ⅱ)和pCAM3300-zeocin-CgGPD1 -CgGPD1-CgGPD1(Ⅲ).在大肠杆菌JM109中,研究了其在不同质量浓度NaCl、葡萄糖胁迫下表达情况.结果表明,在大肠杆菌中GPDH的活性随着NaCl、葡萄糖质量浓度的升高而增加.当NaCl质量浓度达到2.5 g/dL时,GPDH的酶活比在0.5 g/dL NaCl下平均提高31.2%; 当葡萄糖质量浓度提高至10 g/dL时,GPDH的酶活比2 g/dL葡萄糖下平均提高31.8%;在相同的NaCl、葡萄糖质量浓度下,GPDH的活性随着 CgGPD1 拷贝数的增加而升高,JM109(Ⅱ)比JM109(Ⅰ)的GPDH酶活平均提高8.2%,JM109(Ⅲ)比JM109(Ⅱ)的GPDH酶活平均提高9.9%.以上结果表明,在大肠杆菌中 CgGPD1 基因的表达同样受渗透压胁迫调节.     

新型的病毒-基因治疗系统CNHK500-hγ的构建

目的研制出一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将主要晚期启动子(MLP)调控的人干扰素-γ基因插入腺病毒E1A基因受hTERT启动子调控、E1B基因受HRE启动子调控的增殖病毒载体质粒PXC70-HRE-TP的E1A上游,得到腺病毒质粒pSG500-hγ。通过pSG500-hγ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-hγ。用TCID50方法测定病毒滴度。通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。利用ELISA法检测人干扰素-γ抗癌基因的表达。结果CNHK500-hγ的病毒滴度为4×109pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hγ可以选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中增殖,CNHK500-hγ所携带的人干扰素-γ基因在肝癌细胞株中的表达量(442μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体(120μg/L)Ad-hγ(P<0.005)。结论CNHK500-hγ是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。     

人arresten基因的克隆表达及其对内皮细胞增殖的影响

目的克隆表达血管生成抑制因子arresten基因，并探讨其生物学活性。方法利用基因重组技术，从含有人arresten基因的克隆载体pGEMArr上切下目的基因片段，亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pRSET中，构建表达载体pRSETAN。将重组质粒pRSETAN转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导表达。菌体经超声波破碎，镍柱亲和层析纯化并复性。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定表达蛋白抑制血管内皮细胞的活性。结果酶切鉴定和测序验证，表达载体构建正确。在表达宿主菌中，arresten基因获得了高效表达，表达量占菌体总蛋白质的27％；表达产物经亲和层析纯化后，蛋白质纯度达96％。经复性，重组蛋白可显著抑制血管内皮细胞生长因子促脐静脉内皮细胞的增殖作用。结论人arresten基因能在pRSET表达系统中得到高效表达；复性后表达蛋白能有效抑制血管内皮细胞的增殖。     

人PAX8与PPARγ的融合基因（PPFP）的克隆及其重组质粒的构建

目的 探讨人PAX8/FPARγ融合基因(PPFP)表达质粒在甲状腺上皮细胞中的表达及作用.方法 从含有PAX8基因和PPARγ基因的质粒克隆模板PAX8-pOTB7及PPARγ-pCMV-SPORT6中,利用PCR方法 调取目的 基因PAX8和PPARγ,将PAX8和PPARγ定向连接后克隆到pEGFP-C1载体上,构建融合基因的真核表达质粒pEGFP-C1-PAX8/PPARγ,在大肠杆菌E.coli DH5α中转化并提取质粒,通过PCR和测序、分析比对验证PPFP融合基因后,将真核表达载体pEGFP-C1-PAX8/PPARγ的质粒用脂质体包合并转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1,通过RT-PCR和Western blot鉴定PPFP融合基因于靶细胞内在mRNA和蛋白水平上的表达.结果 构建的质粒通过鉴定证实正确;该质粒转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1后,经验证显示PPFP融合基因在mRNA和蛋白水平上顺利表达.结论 成功克隆了PPFP融合基因并构建其重组质粒pEGFP-C1-PAX8/PPARγ;该质粒转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1后可顺利表达PPFP蛋白,为进一步研究PPFP基因致瘤作用的分子机制提供了实验基础.     

短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶（xylB）的分子生物学研究

根据已发表的环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶基因序列设计引物,首次扩增出短芽孢杆菌(Bacillus brevis)中的β-1,4-内切木聚糖酶(以下简称木聚糖酶,E.C.3.2.1.8)基因片段.序列分析表明,该基因与已登录的木聚糖酶基因AF490979.1和AF490980.1分别有97%和96%的同源性,与其它芽孢杆菌属的同源性也较高.将此基因片段插入表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).重组基因工程菌破碎后进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明,IPTG诱导后,木聚糖酶基因在大肠杆菌的胞内获得高效表达,且酶活力最高可达26.14 U/mL.重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为9.0.     

携带HSV-TK基因的人肝癌特异性EB病毒表达载体的构建及临床意义

构建人肝癌组织特异性的基因治疗载体并探讨其临床意义。方法利用重组ＤＮＡ技术将ＨＳＶ－ＴＫ基因插入到含有及不含有α－ＦＰ启动子的ＥＢ病毒表达载体ＰＥＢＡＦ５．１、ｐＤＲ２中，并通过限制性内切酶分析鉴定重组质粒。结果ＴＫ基因成功地克隆入ＰＥＢＡＦ５．１及ｐＤＲ２中。结论含有α－ＦＰ启动子的ＥＢ病毒表达载体是原发性肝癌基因治疗中新型、理想的候选载体之一。     

人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶基因启动子区克隆与活性分析

目的 克隆人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶(cGCX)基因5'侧翼启动子区,并对其转录活性进行分析.方法 对GGCX基因5'侧翼区进行生物信息学分析,预测其转录调控区域;从人肾组织中提取基因组DNA,以其为模板扩增GGCX基因启动子区,通过酶切鉴定及测序分析无误后,将其构建至萤光报告基因载体pGL3-basic中,瞬时转染至Hela细胞,检测萤光素酶水平,从而分析扩增启动子区的转录活性.结果 成功克隆长度为804 bp(-891～-88)的GGCX基因启动子片段,并构建相应的萤光素酶重组子pGL3.GGCX Promoter,转染Hela细胞48 h后检测萤光素酶活性显示,pGL3-GGCX Promoter与空质粒对照pGL3-basic相对萤光素酶值分别为16.92±4.01与0.02±0.01,pGL3-GGCXPromoter萤光素酶活性显著增强(P<0.05).Matlnspector等分析显示该片段具有多个转录因子结合位点.结论 成功构建含有GGCX基因启动子序列的萤光素酶报告系统,为进一步研究GGCX基因功能及其转录调控奠定了基础.