带自身启动子的6gαB基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的启动子连同β半乳糖苷酶bgαB基因经PCR扩增后，连接在T载体上，再取代枯草杆菌载体pZ01-bgaB的启动子，将其在枯草杆菌宿主WB600中表达．经摇瓶发酵20h，得到乳糖酶活力6．37U／mL，比活力3．814U／mg，SDS—PAGE电泳显示有明显重组蛋白质条带．证明了嗜热脂肪芽孢杆菌来源的启动子在枯草杆菌中是完全适用的．     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

将来自嗜热脂肪芽孢杆菌IAM 110 0 1的高温乳糖酶基因bgaB亚克隆到具强启动子的大肠杆菌载体 pKK 2 2 3 3中 ,经IPTG诱导后 ,表达出的重组蛋白质仍具有耐高温活性 ,其相对分子质量与天然蛋白质相似 ,表达量为 1.5U/mg ,比出发菌株高 10倍     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 .     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstearothermophilus的耐热β 半乳糖苷酶基因bgaB被克隆到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中,然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合载体pSAS144中,转化Bacillussubtilis受体菌BD170,在5μg/mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子.经摇瓶发酵后,得到耐热乳糖酶的比酶活为0.32U/mg,是出发菌株比酶活的2倍.     

短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶（xylB）的分子生物学研究

根据已发表的环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶基因序列设计引物,首次扩增出短芽孢杆菌(Bacillus brevis)中的β-1,4-内切木聚糖酶(以下简称木聚糖酶,E.C.3.2.1.8)基因片段.序列分析表明,该基因与已登录的木聚糖酶基因AF490979.1和AF490980.1分别有97%和96%的同源性,与其它芽孢杆菌属的同源性也较高.将此基因片段插入表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).重组基因工程菌破碎后进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明,IPTG诱导后,木聚糖酶基因在大肠杆菌的胞内获得高效表达,且酶活力最高可达26.14 U/mL.重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为9.0.     

耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建及其发酵条件

利用PCR扩增技术以嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001染色体DNA为模板,扩增得到嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶编码基因perA。再与经EcoRⅠ酶切的温控表达载体pBV220连接,构建重组质粒,并转化宿主大肠杆菌JM109,得到耐热过氧化氢酶基因工程菌,然后对该工程菌在LB培养基和半合成培养基中的发酵条件进行了优化。结果表明：在LB培养基中,诱导时期和酶合成最佳诱导时间均为5h,最大产酶量达到72．9U／mL;在半合成培养基中,于30℃培养4h,再于42℃诱导培养6h,产酶量最高达到131U／mL。     

嗜热芽孢杆菌2004产β-甘露聚糖酶产酶条件优化和酶学性质

对芽孢杆菌2004 β-甘露聚糖酶进行了产酶条件优化、初步纯化及其酶学性质的研究.条件优化结果:1.5 g/dL槐豆胶,2 g/dL蛋白胨,培养温度为40 ℃,250 mL三角瓶装液量为70 mL,其他因素影响不大.此最佳产酶条件下,嗜热芽孢杆菌2004 12 h的产酶水平平均为41.92 U/mL,比原来提高了30倍.培养液离心得到上清液,经硫酸铵沉淀,Sephadex G-200分子凝胶过滤和DEAE纤维素离子交换,酶比活达到722 U/mg,纯化了23.94倍,收率为35.1 %.该酶的最适反应温度为70～80 ℃;反应的最适pH值为5.8～6.0;pH值稳定范围为4.0～9.0.金属离子Mg2 和K 对酶略有激活作用.适当浓度的Mg2 不仅对酶有激活作用,还对酶的热失活具有保护作用.     

高产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌选育、产酶与酶学特性

选育了一株高产环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的芽孢杆菌Sx菌株,经16S rRNA测序分析,结合菌体及菌落的形态特征,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).对其产酶条件与酶学特性进行了研究.结果表明,以l g/dL玉米淀粉和2 g/dL豆粕粉为碳氮源,pH 6.5,30℃,220 r/min,60 h的条件下,菌株所产CGTase酶活性可达5 596 U/mL;该酶在30～50℃,pH 5.5～9.0下保持稳定,在50℃,180 r/rain,pH 6.5,CGTase酶活力为1 107 U/mL的条件下对20 mg/ml,甜菊甙转化48 h,甜菊甙溶液中的昂莱鲍迪甙与甜菊甙的比值(RA/SS)从转化前的0.45上升到0.53.     

地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化方法

通过体外处理诱导地衣芽孢杆菌产生感受态性能 ,同时调整参数 ,建立了感受态细胞对质粒 pAPR的高效电转化方法 .当质粒DNA为 1.5 μg/mL、转化时电压为175 0V时 ,可得到 2 6 1个转化子 ,经鉴定均为阳性克隆子 .此为以芽孢杆菌为宿主进行高效电转化及为建立适合工业应用的分泌型表达载体提供参考 .     

耐热果胶裂解酶基因pel9A的克隆和表达

利用PCR技术从耐热梭状芽孢杆菌（Clostridium stercorarium）中扩增得到产耐热果胶裂解酶的结构基因pel9A,并将其克隆于表达载体pET28a中,最后将此重组质粒转化到受体菌E.coli BL-21中进行表达.诱导条件为：37 ℃诱导5 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L.重组菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表达的蛋白质的相对分子质量为130 000,与预期相对分子质量相符.细胞经超声破碎后,测得果胶酶的比酶活为15 U/mg粗蛋白.     

产β-葡聚糖酶淀粉液化芽孢杆菌的选育

通过对一株淀粉液化芽孢杆菌进行紫外和^60Co逐级诱变，使该菌株产β-葡聚糖酶酶活从80U／mL提高到105U／mL；对突变株进行多次单菌落分离及传代，对其传代稳定性的研究表明：该菌株产酶性能稳定；在5L发酵罐中突变株的产酶水平比摇瓶要高，可达120U／mL，产酶周期比摇瓶缩短了15h．     

枯草杆菌BF-7658α-淀粉酶生产菌株所产蛋白酶热稳定性研究

我国α—淀粉酶(EC3.2.1.1)生产是用枯草杆菌BF—7658菌株,它产生的酶是个复杂酶系。其中混杂的蛋白酶未见酸性蛋白酶。发酵液经热处理后,测蛋白酶活力。结果,碱性蛋白酶耐热性比中性蛋白酶强。发酵液经55℃,30分钟热处理后,碱性蛋白蛋残存活力与室温(20～25℃)下碱性蛋白酶活力相差不显著(P>0.05),而中性蛋白酶则相差显著(P<0.05)。用电泳法观察发酵液蛋白酶电泳谱型,显示两条蛋白酶区带。     

一株产海藻糖合成酶嗜中温芽孢杆菌的鉴定及其酶学性质

由长白山温泉附近土壤中筛选得到产海藻糖舍酶菌株，为革兰氏阳性菌，具有芽孢和鞭毛，其最适生长温度为55℃，对这一菌株进行生理生化指标测定。进一步对该菌株所产海藻糖合酶的酶学性质进行研究，酶反应最适作用pH值为7．0，在pH6．6～7．4时该酶稳定，最适作用温度为35℃，在25-45℃时该酶可稳定保存。     

啤酒酿造用复合酶的研制

从一系列枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）和淀粉液化芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）出发，经筛选和诱变选育，得到一株淀粉液化芽孢杆菌突变株（ＷＬ－ＢＡ－ｌ），该菌株经三角瓶摇瓶和２０Ｌ发酵后，在３０００Ｌ标准通风罐上进行试验，菌株发酵周期短，发酵液中β－葡聚糖酶约为１２０ｕ／ｍｌ，α－淀粉酶约１５０ｕ／ｍｌ，蛋白酶约１８００ｕ／ｍｌ．发酵液经压滤浓缩后制得液体酶制剂。     

BCG treatment and the importance of an inflammatory response

Summary A prospective study was performed on patients with superficial bladder tumour treated with bacillus Calmette-Guérin (BCG). The kinetics of interleukin-6 (IL-6) titres were monitored in urine collected at regular intervals for 24 h during 14 BCG treatments, each consisting of six weekly intravesical instillations. IL-6 titres were quantified with an ELISA system and compared with a bioassay (biologically active IL-6) system. After instillation, urinary IL-6 titres transiently increased, reaching maximum levels between 2 and 6 h after instillation. IL-6 titres appeared to be significantly correlated with an increase of total cells retrieved by bladder washout 3 h after instillation. The kinetics of the weekly maximum biologically active IL-6 titres indicate that three types of BCG-induced response occur: an early response starting at the first instillation; a late response after the third instillation; or no IL-6 response. The early response appeared to be associated, but not strictly correlated, with an IL-2 response. The results suggest that the effectiveness of BCG treatment is determined by two processes, an inflammatory one, followed by a delayed type of hypersensitivity response.Supported in part by a grant of the EORTC-GU groupThis paper was selected for publication in Urological Research from the program of the 1991 meeting of the European Society of Urological Oncology and Endocrinology (ESUOE)     

检测白细胞介素预测卡介苗灌注预防膀胱癌术后复发的疗效

目的：寻找早期评估卡介苗（BCG）灌注治疗预防浅表性膀胱癌术后复发的疗效指标。方法：对37例膀胱癌患者术后应用BCG灌注治疗，检测治疗前及治疗6周后的血及尿中IL－2，IL－6，IL－8的含量，并结合病理及临床资料，探讨其与BCG疗效的关系。结果：全组患者治疗前后血清IL－8的含量差异有显著性意义（P＜0．05），未复发组治疗后尿IL－2，IL－6，IL－8含量明显高于治疗前，而复发组治疗前后无明显变化。结论：检测尿液中IL－2，IL－6，IL－8等的含量变化，对早期评估BCG的疗效有重要价值。对血清中IL－2，IL－6，IL－8等的研究对深入理解BCG的作用机制，有较大的帮助。     

膀胱切缘注射白细胞介素2及术后灌注白细胞介素2加卡介苗预防膀胱癌复发(附33例报告)

目的：寻求预防膀胱癌术后复发的更有效方法。方法：采用术中膀胱切缘注射白细胞介素2（IL-2）和术后灌注IL-2加卡介苗（BCG）治疗33例膀胱癌患者。结果：随访4～77个月，复发率为9．1％。结论：采用此法预防膀胱癌术后复发安全有效。     

Early Disease Progression after Intravesical Bacillus Calmette-Guérin (BCG) Therapy for Superficial Bladder Cancer

Background : Disease progression after Bacillus Calmette-Guérin (BCG) instillation therapy for bladder cancer is not rare. The purpose of this study was to evaluate the outcome of patients treated with BCG for superficial bladder cancer, focusing on the patients who developed invasive disease during follow-up. The possible mechanism and risk factors for early progression after BCG therapy are discussed. Methods : A total of 25 patients with superficial bladder cancer (pTa, pT1, and/or pTis) were treated with intravesical BCG instillation (80 mg in 80 mL saline) once a week for eight weeks. Four of the 25 patients received maintenance therapy with BCG (once a month for 3 to 10 months). Patients were followed every three months and underwent cystoscopy, biopsy, and urinary cytology at these intervals. Disease progression was defined as invasion to muscle or prostate, or development of metastatic disease. Clinicopathological features of the patients, especially those with progression, were analyzed. Results : Progression was observed in six of the 25 patients (including four of 19 patients with carcinoma in situ and two of five patients treated prophylactically with BCG). The average time to progression was 8.7 months. Four patients died of cancer despite intensive treatment. Two patients are alive: one without evidence of disease after cystectomy and the other with metastatic disease. Conclusions : Proper patient selection, careful follow-up, and immediate aggressive therapy in case of progression were considered to be important factors to obtain satisfactory results with BCG therapy for bladder cancer.