耐热果胶裂解酶基因pel9A的克隆和表达

利用PCR技术从耐热梭状芽孢杆菌（Clostridium stercorarium）中扩增得到产耐热果胶裂解酶的结构基因pel9A,并将其克隆于表达载体pET28a中,最后将此重组质粒转化到受体菌E.coli BL-21中进行表达.诱导条件为：37 ℃诱导5 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L.重组菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表达的蛋白质的相对分子质量为130 000,与预期相对分子质量相符.细胞经超声破碎后,测得果胶酶的比酶活为15 U/mg粗蛋白.     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 .     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及高效表达

扩增了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因（gdh）,构建了诱导型表达载体pET-gdh,导入E.coliBL21（DE3）后获得了高效表达葡萄糖脱氢酶基因的重组菌BL21/pET-gdh。经过诱导时间、诱导温度参数的优化,IPTG诱导后重组菌BL21/pET-gdh的葡萄糖脱氢酶比酶活高达9.65 U/mg蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白的53%,实现了葡萄糖脱氢酶基因的高效表达,为氧化还原酶催化系统提供高效率的NADP＋与NADPH循环奠定了基础。     

碱性高温淀粉酶基因的克隆与表达及酶特性的初步研究

从土壤中筛选到一能分泌碱性高温淀粉酶的芽孢杆菌属菌株。用质粒pTB522作载体,该淀粉酶基因(amyA)被克隆并在枯草芽孢杆菌ANA-1中得到表达。又通过亚克隆,得到含酶基因的更小重组质粒pTBX32(14.6kb)。携带该重组质粒的枯草芽孢杆菌ANA-1分泌的淀粉酶的特性与供体菌的相同。该酶作用最佳pH为8.5、最适温度为75℃,但在65℃,pH8.5条件下处理1h,该酶活性不降低。通过硫铵沉淀、热处理、DEAE——纤维素色谱和亲和色谱等分离技术,从培养液中部分纯化了该酶,其分子量估计为56000。     

短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶（xylB）的分子生物学研究

根据已发表的环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶基因序列设计引物,首次扩增出短芽孢杆菌(Bacillus brevis)中的β-1,4-内切木聚糖酶(以下简称木聚糖酶,E.C.3.2.1.8)基因片段.序列分析表明,该基因与已登录的木聚糖酶基因AF490979.1和AF490980.1分别有97%和96%的同源性,与其它芽孢杆菌属的同源性也较高.将此基因片段插入表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).重组基因工程菌破碎后进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明,IPTG诱导后,木聚糖酶基因在大肠杆菌的胞内获得高效表达,且酶活力最高可达26.14 U/mL.重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为9.0.     

大肠杆菌中乙醇合成途径的构建

采用PCR技术扩增了运动发酵单孢菌Zymomonasmobilis的两个产乙醇的关键酶基因pdc和adhⅡ ,分别克隆到载体 pUC19和pUC18中 ,形成重组质粒 pUC19::pdc和 pUC18::adh ,从中分离出两基因并串联到经EcoRⅠ酶切的 pUC18中 ,转化大肠杆菌E .coliDH5α获得重组质粒 pPA .携带pPA的重组菌Pp +a被证明具有丙酮酸脱羧酶酶活且提高了乙醇脱氢酶酶活 .通过代谢工程在Escherichiacoli中成功地构建了乙醇合成途径     

利用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因检测转基因植物

GFP作为报告分子被广泛地运用在转基因植株检测中.利用PCR技术扩增得到番茄Bax inhibitor-1基因(LeBI-1),亚克隆到含GFP基因的pEGFP载体上,进一步将中间载体构建到植物表达载体pBI121上.重组pBI121-LeBI-1-EGFP经农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,分化筛选后获得抗性烟草植株.利用GFP作为报告基因,采用PCR、southern blot及荧光方法验证外源基因LeBI-1成功转化到烟草中.分析讨论报告蛋白GFP不同检测方法的优缺点.     

Pichia stipitis木糖醇脱氢酶基因XYL2在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2.将该基因连入酵母表达载体pYX212的强启动子磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子下,得到融合表达载体pYX-XYL2.通过电转化方法将pYX-XYL2转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A中,酶活测定表明在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2得到活性表达,酿酒酵母转化子粗酶液中木糖醇脱氢酶比活为每毫克蛋白0.6 U左右,约为供体菌的2.4倍.与基因供体菌不同,木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导,为组成型表达.     

植物乳杆菌乳酸脱氢酶的抽提与初步纯化

研究了从植物乳杆菌RS2 2中提取胞内乳酸脱氢酶的工艺过程,探讨了超声破碎时菌体质量浓度、处理量及处理时间对破碎效果的影响;对酶的提取工艺研究表明,0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)添加0.10～0.30mol/LNaCl可达到较好的抽提效果;对硫酸铵盐析去杂蛋白质及DEAE离子交换层析工艺进行了初步优化.在优化的工艺条件下,酶的总回收率为40.2%,比酶活提高到原来的18.9倍.     

高产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌选育、产酶与酶学特性

选育了一株高产环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的芽孢杆菌Sx菌株,经16S rRNA测序分析,结合菌体及菌落的形态特征,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).对其产酶条件与酶学特性进行了研究.结果表明,以l g/dL玉米淀粉和2 g/dL豆粕粉为碳氮源,pH 6.5,30℃,220 r/min,60 h的条件下,菌株所产CGTase酶活性可达5 596 U/mL;该酶在30～50℃,pH 5.5～9.0下保持稳定,在50℃,180 r/rain,pH 6.5,CGTase酶活力为1 107 U/mL的条件下对20 mg/ml,甜菊甙转化48 h,甜菊甙溶液中的昂莱鲍迪甙与甜菊甙的比值(RA/SS)从转化前的0.45上升到0.53.     

克隆与表达产甲酸草酸杆菌代谢基因Frc及临床意义

目的研究产甲酸草酸杆菌草酸代谢基因Frc转化大肠杆菌BL21后稳定表达代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)对草酸的降解效能。方法成功培养产甲酸草酸杆菌后,采用PCR方法从产甲酸草酸基因组中获得Frc基因,克隆到pMDTM19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段。经双酶切将目的基因片段插入到原核表达载体PGEX-4T-2上,测序正确后,转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,表达产物行western-blot鉴定分析。结果重组克隆载体pMDTM19-Frc经测序鉴定序列正确。成功构建融合原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,大肠杆菌BL21成为载体,并稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT的同时获得代谢草酸潜能。结论克隆产甲酸草酸杆菌Frc基因,成功构建PGEX-4T-2-Frc载体,并转化大肠杆菌BL21,能稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT,具有代谢草酸潜能,为肠道细菌获得代谢草酸潜能,减少胃肠道内草酸的吸收,降低尿液中草酸含量和临床防治草酸结石的研究奠定理论基础。     

耐热芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶的中试发酵工艺

对耐热芽孢杆菌(Thermophilicbacillus)XJT9503保藏、菌种活化、种子培养基和发酵培养基及7,25,250,3000L发酵罐的中试发酵工艺参数进行了研究,确定了耐热芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶的中试发酵工艺.在3000L发酵罐上控制罐温为46℃、转速180r/min、通气量4L/(L·min),培养18h后发酵酶活最高达13240U/mL.     

粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆及在毕赤酵母中的初步表达

采用连续延伸PCR方法克隆到粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）漆酶基因，并将其克隆到表达载体pPIC9k，重组质粒经线性化、电激转化Pichia pastoris KM71，部分阳性克隆的PCR结果表明：漆酶基因已整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，重组菌经甲醇诱导后3～5d产漆酶量最高，为2-3U／mL。     

酶法制备壳低聚糖对细菌的抑制作用

研究了由壳聚糖内切酶、外切酶和混合酶降解制备的5种不同相对分子质量壳低聚糖在不同浓度下对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性.结果表明,相对分子质量2 100的壳低聚糖对大肠杆菌抑制作用最明显.相对分子质量9 000的壳低聚糖对枯草芽孢杆菌抑菌效果最好.壳低聚糖对枯草芽孢杆菌抗菌作用随相对分子质量减小而逐渐减弱.壳低聚糖对两种菌的抑菌效果均随浓度的增加而增强.     

一种β-内酰胺酶基因的重组与表达

腊样芽孢杆菌的β-内酰胺酶类都属可分泌型的,每种酶以不同长短的肽链形式存在,其调节机理也不完全清楚。为此我们克隆了菌株5/B的β-内酰胺酶Ⅰ的基因penPC,完整地分析了基因的DNA序列,并将它同菌株569/H的相应基因进行了比较。两个基因的DNA序列及转译产物的分子量相差不大,但其信号多肽序列及基因的C端部位有着明显的不同。5/B的penPC基因重组到大肠杆菌中未能得到很好的表达,但重组到枯草杆菌中则表达得很好,90%以上的基因产物都能分泌到培养基中。     

中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的 观察中国人肠道产甲酸草酸杆菌(Ox.F)草酰辅酶A脱羧酶基因(oxc)的分离、克隆及其在293细胞中的表达.方法 提取中国人肠道Ox.F的基因组DNA,PCR扩增oxc基因片段并克隆入真核表达载体pEGFP-C1,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定基因片段.将重组质粒脂质体转染至293细胞,利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测oxc基因在真核细胞中的表达.结果 中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因全长1707 bp,与Gene Bank中的序列比较,碱基序列的同源性为93.61%,氨基酸残基序列的同源性为97.18%.重组质粒转染293细胞后24～48 h,可观察到明亮的绿色荧光,从mRNA和蛋白水平上可以检测到oxc基因在真核细胞中的表达.结论 中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出oxc基因;中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因存在一定的变异;oxc基因可在真核细胞293细胞中表达.     

国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库的构建及意义

目的　研究精子发生相关基因的结构与功能 ,构建中国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库。　方法　提取国人正常睾丸组织mRNA ,逆转录合成cDNA ,SalI/NotI酶切后基因重组法定向克隆于质粒表达载体pSPORT1中 ,转化细菌后扩增。　结果　文库大小为 7× 10 5,SalI/NotI酶切鉴定 ,插入的cDNA片段多为 0 .5～ 2 .0kb。　结论　国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库构建成功 ,质量较好 ,可进行包括低丰度mRNA在内的所有丰度mRNA的cDNA克隆筛选 ,为进一步研究精子发生相关基因的结构与功能提供了实验依据。     

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1多拷贝表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR的方法从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) 中扩增出3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因及侧翼序列 CgGPD1,分别构建了含不同 CgGPD1 拷贝数的根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1(Ⅰ)、pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1(Ⅱ)和pCAM3300-zeocin-CgGPD1 -CgGPD1-CgGPD1(Ⅲ).在大肠杆菌JM109中,研究了其在不同质量浓度NaCl、葡萄糖胁迫下表达情况.结果表明,在大肠杆菌中GPDH的活性随着NaCl、葡萄糖质量浓度的升高而增加.当NaCl质量浓度达到2.5 g/dL时,GPDH的酶活比在0.5 g/dL NaCl下平均提高31.2%; 当葡萄糖质量浓度提高至10 g/dL时,GPDH的酶活比2 g/dL葡萄糖下平均提高31.8%;在相同的NaCl、葡萄糖质量浓度下,GPDH的活性随着 CgGPD1 拷贝数的增加而升高,JM109(Ⅱ)比JM109(Ⅰ)的GPDH酶活平均提高8.2%,JM109(Ⅲ)比JM109(Ⅱ)的GPDH酶活平均提高9.9%.以上结果表明,在大肠杆菌中 CgGPD1 基因的表达同样受渗透压胁迫调节.     

L-乳酸脱氢酶生产菌的选育及产酶条件

从泡菜汁中筛得一株胞内L 乳酸脱氢酶(L LDH)活性较高的植物乳杆菌RS2 2,采用亚硝基胍和超声波同时作用进行诱变,使其比活力由3.48U/mg提高到7.49U/mg,并对突变株的产酶条件进行了研究.     

蛋白酶产生菌种间原生质体的转化

以地衣形芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)AS 1.807—9—9(Thr~-Ade—Str~rRif~5)的原土质体为受体,枯草芽抱杆菌(B.subtilis)ASl.398—28—6(Arg~-Leu~-Rif~rStr~s)*为供体菌,添加聚乙二醇(分子量6000)至终浓度为30%,经过一定时间的保温处理,成功地获得了芽孢杆菌的种间转化子。转化子有的是原养型,有的在含利福平(10单位/亳升)和链霉素(200单位/亳升)的培养基上能生长,也有的兼而有之。上述标记的转化频率在10~(-2)～10~(-5)之间。转化子的产芽孢性能和在含葡萄糖的完全培养基上分泌红色色素的性能亦各有差异,而受体菌是典型产芽孢和分泌红色色素的,供体菌是寡芽孢产株,亦不分泌红色色素。溶菌酶处理时间不同致使原生质体再生率有改变或供体DNA添加量不同都会影响转化频率。转化子的次代回变率约大于60%。原生质体转化可以是转化育种的一种新途径,原生质体也可能是经体外重组DNA的植入受体。