牵张负荷对大鼠膀胱ICCs细胞数量及c-kit表达的影响

目的 探讨牵张负荷条件对膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)数量及c-kit蛋白表达变化的影响,阐明牵张负荷对膀胱ICCs细胞兴奋性的调控作用.方法 构建大鼠不稳定逼尿肌模型,以光镜计数及免疫组化法检测牵张负荷下逼尿肌稳定组和逼尿肌不稳定组与正常对照组膀胱ICCs细胞数量及酪氨酸激酶受体(c-kjt)在蛋白水平表达的差异.结果 逼尿肌稳定组和逼尿肌不稳定组ICCs细胞数量与c-kit表达量较正常对照组均有增高(P＜0.01),逼尿肌不稳定组较稳定组升高显著(P＜0.01).结论 牵张负荷对ICCs细胞有调控作用;ICCs细胞数量及c-kit表达增多可能是其机制之一.     

外源性干细胞因子对逼尿肌活动低下大鼠Cajal间质细胞数及逼尿肌收缩力的影响

目的 探讨干细胞因子(stem cell factor,scF)对活动低下逼尿肌中Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)数及逼尿肌收缩力的影响.方法 将SD大鼠分为3组:对照组、逼尿肌活动低下(detrusor underactive,DU)组以及DU+ SCF组.采用ELISA检测血清SCF水平,免疫荧光组织化学法检测ICCs细胞数目,RT-PCR以及Western blot检测c-kit以及SCF的组织水平表达;体外肌条实验检测逼尿肌收缩能力.结果 活动低下逼尿肌组织中ICCs数显著减少(P＜0.05),SCF及c-kit表达显著降低(P＜0.05),逼尿肌收缩频率及收缩幅度显著下降(P＜0.05);外源性SCF可以显著增加活动低下逼尿肌组织中ICCs数(P＜0.05),增加SCF及c-kit的表达(P＜0.05),显著提升逼尿肌收缩幅度和收缩频率(P＜0.05).结论 外源性SCF可以影响活动低下逼尿肌组织中ICCs数,进而改变逼尿肌收缩能力.     

大鼠不稳定膀胱中ICCs细胞中HCN蛋白表达的变化

目的 研究HCN离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)蛋白在膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)中的表达及在不稳定膀胱ICCs细胞中表达的变化,探讨ICCs细胞兴奋性变化与逼尿肌不稳定(detrusor instability,DI)的关系.方法 ①将30只大鼠随机分为正常对照(10例),逼尿肌稳定组(DS,n=12),逼尿肌不稳定组(DI,n=8):大鼠尿道近端结扎,建立膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)模型.②对各组进行HCN和c-kit免疫荧光双标,确定HCN蛋白是否在ICCs细胞上存在及HCN表达的变化.③以Western blot法检测HCN蛋白表达量的变化.结果 ①免疫荧光双标显示,在c-kit阳性的ICCs细胞膜上,有HCN抗原的表达,c-kit阴性细胞未见HCN表达;与正常组相比,DI组、DS组HCN蛋白表达增加.②Western blot检测显示,与正常组相比,DI组、DS组的HCN表达增高,DI组增高显著(P＜0.01).结论 大鼠膀胱ICCs细胞可表达HCN通道蛋白,且DI膀胱ICCs细胞HCN通道明显增多,由此导致的ICCs细胞兴奋性增高可能在DI发生中起重要作用.     

体外培养豚鼠膀胱ICCs细胞表达NSE及nNOS

目的 探讨体外培养豚鼠膀胱组织Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase,NSE)及神经源性一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)的表达.方法 胶原酶消化法进行豚鼠膀胱组织ICCs细胞的原代培养,对照组为原代培养的膀胱平滑肌细胞,免疫荧光法进行c-kit及平滑肌肌动蛋白(SMA)染色,RT-PCR和Western blot法进行细胞培养后1、3 d和5 d的NSE及nNOS转录水平及蛋白水平的检测.结果 豚鼠膀胱ICCs细胞c-kit染色阳性,SMA染色阴性.豚鼠膀胱ICCs细胞NSE及nNOS转录及蛋白水平较高,膀胱平滑肌细胞不表达NSE及nNOS.结论 豚鼠膀胱ICCs培养细胞表达神经细胞特异性物质,提示豚鼠膀胱ICCs细胞参与膀胱功能调控.     

牵张负荷对豚鼠膀胱ICCs细胞内钙波的影响

目的 探讨牵张负荷对豚鼠膀胱起搏细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)兴奋性的影响.方法 胶原酶消化豚鼠膀胱,于特制的牵张培养皿中体外培养膀胱起搏细胞,激光共聚焦技术检测Fluo-4负载的起搏细胞在牵张负荷下Ca2 信号的变化.结果 以豚鼠膀胱组织铺片及体外培养细胞中观察到c-kit染色阳性及长梭形有突起的细胞鉴定为膀胱起搏细胞,即ICCs细胞.细胞于牵张膜上培养4～5 d后,予Fluo-4钙负载染色,激光共聚焦下检测,无应力状态时,ICCs细胞可观察到周期性的"钙波",且其平均荧光强度显著强于平滑肌细胞(P＜0.05).当牵张膜被动拉伸延长20%时,ICCs细胞先于平滑肌细胞发生钙波增强现象.结论 静息状态下ICCs细胞可出现周期性钙波,牵张负荷可兴奋ICCs细胞.     

不稳定逼尿肌中ICCs细胞与逼尿肌收缩的关系

目的 研究不稳定逼尿肌中ICCs细胞的数量、分布形式的变化及其功能改变对逼尿肌肌条收缩的影响,初步探讨ICCs细胞与逼尿肌不稳定的关系.方法 近端尿道结扎法建立大鼠不稳定膀胱模型.分别于正常及不稳定膀胱的相同部位剪取3 mm×4 mm逼尿肌组织进行免疫荧光组织化学法检测c-kit阳性细胞的表达及分布情况;再于相同部位剪取2 mm×7 mm肌条进行收缩特性测定实验,并检测c-kit受体阻断剂对收缩的影响.结果 不稳定逼尿肌中c-kit阳性细胞的数量较正常逼尿肌明显增多(P＜0.05);正常逼尿肌中c-kit阳性细胞以散在分布为主,不稳定逼尿肌中以细胞网络形式存在;不稳定逼尿肌肌条的收缩频率和收缩幅度显著高于正常膀胱(P＜0.05);加入Glevic后,不稳定逼尿肌肌条的收缩幅度显著减弱(P＜0.05),频率无显著差异(P＞0.05).结论 不稳定膀胱中ICCs细胞的数量明显增加,主要以细胞网络的形式存在;不稳定逼尿肌肌条收缩幅度和频率明显增高,但其收缩幅度可以被Glevic削弱,提示ICCs与逼尿肌不稳定的发生有密切关系.     

Cajal样细胞缺失对豚鼠逼尿肌自主收缩的影响及机制探讨

目的:观察在体内阻断c-kit信号途径造成豚鼠膀胱Cajal样细胞缺失后,豚鼠逼尿肌自主收缩活动的变化,探讨逼尿肌中Cajal样细胞的作用。方法:选取新生豚鼠20只,随机分成实验组、对照组。实验组在出生24h内的豚鼠腹腔内隔天注射c-kit抗体(ACK2)100μg,共5次,对照组腹腔内注射生理盐水,于第10天取膀胱。然后将两组豚鼠膀胱制作冰冻切片行免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察。制作豚鼠膀胱逼尿肌肌条,记录逼尿肌肌条自主收缩活动的变化。结果:10d后实验组与对照组豚鼠逼尿肌中Cajal样细胞在激光共聚焦显微镜下比较:实验组膀胱逼尿肌中Cajal样细胞数量减少甚至消失(P<0.01)。与对照组比较,实验组逼尿肌肌条收缩幅度、收缩频率明显下降(P<0.01)。结论:Cajal样细胞与豚鼠逼尿肌自发收缩活动密切相关。     

豚鼠膀胱组织ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin 43表达意义

目的 探讨体外培养豚鼠膀胱组织ICCs细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)间隙连接蛋白Connexin 43的表达.方法 胶原酶消化法进行豚鼠膀胱组织ICCs细胞的原代培养, 对照为原代培养膀胱平滑肌细胞,免疫荧光法进行两种细胞的特征性蛋白c-kit及平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)染色观察,免疫荧光法及Western blot法进行培养细胞Connexin43的检测.结果 豚鼠膀胱ICCs细胞特征性蛋白c-kit染色阳性,SMA染色阴性.豚鼠膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin 43表达水平较高,显著高于膀胱平滑肌细胞.结论 豚鼠离体膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin43高表达可能是其信号传递的重要物质基础.     

体外Cajal样细胞c-kit基因mRNA在高糖环境下表达变化及意义

目的：观察体外高糖环境下Cajal样细胞（interstitial cells of Cajal-like,ICCs）c-kit mRNA表达变化。方法：胶原酶消化法原代分离培养豚鼠膀胱ICCs,加入含葡萄糖浓度分别为5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L培养基培养24h、48h、72h后,应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测高糖环境下c-kit基因mRNA表达水平的变化。结果：RT-PCR电泳经分析显示15mmol/L、30mmol/L组ICCs c-kit mRNA表达较5mmol/L组降低（P〈0.01）,72h组较24h组、48h组表达降低。结论：高糖环境造成ICCs c-kit基因mRNA表达水平降低,可导致ICCs的SCF/c-kit信号通路异常,ICCs功能及结构障碍,可能是糖尿病膀胱病变的发病机制之一。     

周期性牵张诱导逼尿肌细胞高表达Cx43的实验研究

目的探讨周期性牵张对膀胱逼尿肌细胞表达连接蛋白43(Connexin43,Cx43)的诱导作用.方法运用牵张膀胱逼尿肌细胞体外模型,给予逼尿肌细胞周期性20%拉伸度的牵张,持续6 h;采用Western blotting、RT-PCR在蛋白和mRNA水平测定逼尿肌细胞Cx43表达.结果正常对照组Cx43表达量为(11.377 5±0.425 1),Cx43mRNA相对表达量为(0.423 3±0.187 5);而给予20%牵张刺激6 h逼尿肌细胞Cx43表达量增加至(14.015 0±0.526 2),Cx43mRNA相对表达量增加到(0.935 0±0.020 67),二者均较对照组有显著增加(P＜0.01).结论周期性牵张可显著诱导增加逼尿肌细胞Cx43在蛋白和基因水平的表达.     

Cajal间质细胞和缝隙连接蛋白43在先天性巨结肠中的表达

目的本研究通过观察Cajal间质细胞（ICCs）和缝隙连接蛋白43（connexin43）在先天性巨结肠（HD）肠管中的分布情况，探讨HD的发病机制。方法采用兔抗人多克隆c-kit抗体和connexin 43抗体，通过SABC双标免疫组化染色方法观察35例HD患儿肠管c-kit^＋ICCs和connexin 43的分布情况。结果ICCs分布在环肌内和肌间神经丛周围，ICCs彼此及与平滑肌细胞形成缝隙连接。在HD病变肠管ICCs数目明显减少甚至消失，与HD正常肠管相比，差异十分显著（P〈0．01）。在HD病变肠管connexin 43表达明显减弱。结论ICCs和connexin 43分布异常导致了HD病变肠管慢波节律和兴奋传导异常，从而引起或加重HD发病。     

miR-199a-3p调控c-kit/ERK通路在电针关元穴治疗神经源性尿潴留大鼠的作用机制

目的：探讨miR-199a-3p调控c-kit/细胞外信号调节激酶（ERK）通路在电针关元穴治疗神经源性尿潴留中的作用机制。方法: 采用改良脊髓横断法建立神经源性尿潴留大鼠模型60只，通过随机数表法平均分为5组：模型组、电针组、miR-199a-3p antagomir（抑制剂）组、miR-199a-3p antagomir阴性对照组、电针+miR-199a-3p antagomir组，另选取SD大鼠12只，设为假手术组，使用药物分组干预处理后，检测大鼠尿动力学，比较各组膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力；肌条实验检测大鼠逼尿肌兴奋性，比较各组肌条自发性收缩频率；HE染色检测各组大鼠膀胱组织病理形态改变；试剂盒测定各组大鼠血清炎性细胞因子环氧化酶（COX-2）、白细胞介素（IL-18）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平；实时荧光定量（qRT-PCR）实验检测各组大鼠膀胱组织miR-199a-3p与c-kit mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法检测各组大鼠膀胱组织c-kit/ERK通路蛋白表达水平。结果：与假手术组相比，模型组大鼠膀胱组织呈现严重病理损伤改变，膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、血清COX-2、IL-18及iNOS水平显著升高（P＜0.05），肌条自发性收缩频率、膀胱组织miR-199a-3p与c-kit mRNA表达水平、膀胱组织c-kit/ERK通路蛋白p-ERK/ERK、c-kit表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型组、电针+miR-199a-3p antagomir组分别相比，电针组大鼠膀胱组织病理损伤均减轻，膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、血清COX-2、IL-18及iNOS水平均降低（P＜0.05），肌条自发性收缩频率、膀胱组织miR-199a-3p与c-kit mRNA表达水平、膀胱组织c-kit/ERK通路蛋白p-ERK/ERK、c-kit表达水平均升高（P＜0.05）；miR-199a-3p antagomir组大鼠膀胱组织病理损伤均加重，膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、血清COX-2、IL-18及iNOS水平均升高（P＜0.05），肌条自发性收缩频率、膀胱组织miR-199a-3p与c-kit mRNA表达水平、膀胱组织c-kit/ERK通路蛋白p-ERK/ERK、c-kit表达水平均降低（P＜0.05）。与模型组相比，miR-199a-3p antagomir阴性对照组大鼠各指标水平无显著差异（P＞0.05）。结论：电针关元穴可通过上调miR-199a-3p表达而抑制c-kit/ERK通路激活，减轻神经源性尿潴留大鼠膀胱组织炎症损伤，增强逼尿肌兴奋性，修复其膀胱功能，改善大鼠尿潴留症状。     

足三针对术后结肠胱硫醚γ裂解酶和髓过氧化物酶的影响

【目的】观察针刺对结肠组织胱硫醚γ裂解酶(CSE)和髓过氧化物酶(MPO)的影响,探讨针刺促进结肠吻合术后胃肠起搏细胞Cajal间质细胞(ICCs)修复的机制。【方法】选用30只SD大鼠随机分为正常组、模型组(结肠吻合术)和针刺组。针刺组术后给予针刺双侧足三针(足三里、三阴交、太冲)。观察各组小肠推进率,采用免疫组织化学法检测术后大鼠结肠组织中酪氨酸激酶(c-kit)阳性ICCs的变化,以酶联免疫吸附(ELISA)法检测CSE的活性,生化法检测MPO的活性。【结果】与正常组比较,模型组小肠推进率显著下降,结肠组织c-kit阳性ICCs显著减少,结肠组织CSE和MPO活性显著升高(均P0.05)。针刺组较模型组小肠推进率显著加快,结肠组织c-kit阳性ICCs显著增加,CSE和MPO活性显著降低(均P0.05)。【结论】针刺能促进胃肠功能的恢复,其作用机制可能与调整术后结肠组织CSE和MPO活性以促进受损部位c-kit阳性ICCs修复有关。     

高糖环境下豚鼠膀胱ICCs细胞形态的改变

目的观察高糖环境下豚鼠膀胱ICCs细胞长度的改变,探讨糖尿病膀胱（DCP）是否与逼尿肌中ICCs细胞形态异常有关。方法胶原酶V消化豚鼠膀胱,分别在5、10、15mmol/L糖浓度下分别培养24、72h,激光共聚焦技术记录Fluo-4AM负载的ICCs细胞,观察在不同浓度、不同培养时间后其细胞长度的变化。结果非高糖组细胞无明显变化,高糖组遂培养时间延长及糖浓度增高细胞明显变小变短。结论高糖环境使ICCs细胞长度缩短,体积变小,导致其结构异常,起搏及传导功能下降,最终导致逼尿肌功能障碍发生DCP。     

ICCs细胞在糖尿病大鼠膀胱中的密度分布及其对糖尿病膀胱功能的影响

目的观察ICCs细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠膀胱中的密度分布情况,探讨其在糖尿病膀胱逼尿肌肌条兴奋性改变以及膀胱功能改变中的作用。方法腹腔注射链脲佐菌素(strepto-zotocin,STZ)建立糖尿病SD大鼠模型。12周后,行充盈性膀胱测压,比较DM组大鼠与对照组膀胱残余尿量、最大膀胱容量、最大膀胱压力及膀胱顺应性变化;行离体逼尿肌肌条实验,比较肌条兴奋性与对照大鼠的差异;应用免疫组织荧光染色法检测2组大鼠膀胱ICCs细胞的密度分布情况。结果DM组大鼠膀胱残余尿量[(0.50±0.28)ml]、最大膀胱容量[(1.72±0.73)ml]和膀胱顺应性[(0.04±0.02)ml/cmH2O]较对照组明显增加(P<0.01),而最大膀胱压力明显降低(P<0.05)。DM组逼尿肌肌条收缩频率较对照组明显降低(P<0.05),而且收缩幅度有降低趋势。DM大鼠膀胱ICCs细胞数量较对照组明显减少(P<0.01)。结论DM大鼠膀胱中ICCs细胞数量减少可能是糖尿病性膀胱病逼尿肌肌条兴奋性降低及在体膀胱功能改变的重要原因...     

Expression and function of c-kit receptor in bone marrow mononuclear cells of patients with myelodysplastic syndromes

目的　了解骨髓增生异常综合征 (MDS)骨髓单个核细胞c kit受体的表达与功能。方法　采用免疫荧光方法测定c kit受体蛋白 (CD117)的表达 ;逆转录 聚合酶链反应方法测定c kitmRNA的表达 ;细胞培养检测c kit受体的功能。结果　CD117表达率正常人为 3 0 4 %± 1 4 9% ,MDS患者为 8 58%± 5 2 8% ,两者差异有显著性 (P <0 0 5) ;RA患者为 5 12 %± 2 13% ) ,RAEB RAEB t患者为 10 0 1%± 5 0 7% ,两者差异有显著性 (P <0 0 5) ;MDS继发白血病患者为 32 4 3%± 18 16 %。MDS患者c kit基因mRNA表达与CD117表达相一致。正常骨髓单个核细胞体外半固体培养 ,在加入造血干细胞因子、白细胞介素 3、红细胞生成素 (SCF IL 3 Epo)后形成的粒 巨噬细胞集落 (CFU GM)较仅加入IL 3 Epo显著增多 (P <0 0 5) ,红系爆式集落 (BFU E)数量极显著增多 ,且BFU E体积显著增大(P <0 0 1)。MDS患者在上述相同条件下CFU GM数量无明显变化 (P >0 0 5) ,与正常对照比较 ,CFU GM和BFU E数量均显著减少 (P <0 0 5)。结论　MDS患者骨髓单个核细胞CD117表达明显高于正常对照 ,且与病情进展相关 ;c kitmRNA表达与CD117表达相一致 ;MDS患者骨髓单个核细胞体外培养时 ,SCF协同IL 3、Epo促进造血干 祖细胞增殖分化能力较正常对照明