P53融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的 为研制出能特异与Ｐ＾５３结合的单克隆抗体,使对Ｐ＾５３的检测得到更为广泛的应用。方法 用ＰＣＲ技术扩增编码人Ｐ＾５３Ｎ－端１８０个氨基酸的ＤＮＡ片段并将其克隆在谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）表达质粒Ｐ＾ＧＥＸ－２Ｔ中。用该重组质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９,并经异丙基β－Ｄ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导产生Ｐ＾５３－ＧＳＴ融合蛋白。用Ｐ＾５３－ＧＳＴ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。常规细胞融合,间接酶联免疫吸附试     

脑震荡大鼠大脑乙酰胆碱脂酶的变化

目的:观察脑震荡大鼠乙酰胆碱酯酶(AChE)的变化规律.方法:用自制单摆闭合性脑损伤机械打击装置复制脑震荡大鼠模型,随机分为伤后1、 2、 4、 8、 16、 24d和正常对照组.用免疫组织化学法和图像分析对大脑前额叶皮质(PFC)、尾壳核(CPu)、伏核,核心部(AcbC)、斜角带垂直臂核(VDB)、斜角带水平臂核(HDB)、梨形皮质(Pir)、顶叶皮质、海马CA1-3区(CA1-3)、丘脑背内侧核(MD)、丘脑背外侧核(LD)、下丘脑外侧区(LH)和杏仁核脑区AChE阳性表达物进行光密度测量.结果:与正常对照组相比,大鼠脑震荡后ACHE的阳性表达在上述脑区呈不同程度的下降.其中在VDB AChE表达于伤后第1天达低谷.在PFC、 CPu、 AcbC、 CA1、 CA3、杏仁核、顶叶皮质、Pir和HDB AChE表达于伤后第4天达低谷.在CA2、 MD、 LD部位ACHE表达于伤后第8天达低谷.在LH部位AChE表达于伤后第16天达低谷.各脑区ACHE变化恢复时间不相同,至24d均恢复接近正常或低于正常.结论:AChE可分布在大脑皮质各层神经元,海马、丘脑、尾壳核、基底前脑神经元;脑震荡鼠顶叶皮质、PFC、 CA1-3、 MD、 LD、 LH、 CPU、 VDB和HDB等多个功能脑区AChE伤后出现下调性病理变化;脑震荡鼠的认知行为障碍可能与相关脑区胆碱能神经的变化有一定联系.     

大鼠舌乳头神经结构的乙酰胆碱受体亚型配布

目的:探索味觉的传递机制是否系味蕾细胞所接受的信息直接通过神经递质受体作用于舌乳头的感觉神经来完成。方法:免疫组化SABC技术对大鼠舌粘膜各部位各种乳头内神经结构上乙酰胆碱受体(AchR)的8种亚型(VR1、α2、α3、α4A、α4H、α7、β1及β2)的分布进行观察。结果:除丝状乳头外,其他3种乳头的支配神经束及纤维分支不同程度地分布有AchR的各亚型受体。阳性反应的AchR自乳头中轴上的神经束(干)起,并沿其分支分布,在临近味蕾前即中止,未见受体阳性的神经纤维终末到达味蕾细胞。结论:味觉感受的传递机制并非由AchR阳性感觉神经纤维直接从味蕾细胞“接力”上行。     

人丙氨酸氨基转移酶(ALT2)的表达、单克隆抗体制备及鉴定

目的:克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT2),以此作为抗原免疫动物获得针对ALT2的单克隆抗体(mAb)株,用于ALT的免疫诊断。方法:通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT2)基因,并将其克隆至pET-28a表达载体中,带有组氨酸标签的ALT2蛋白经镍亲和层析纯化,纯化的ALT2作为抗原免疫小鼠制备mAb,通过Western blot和ELISA方法测定mAb的亲和力和特异性。结果:利用大肠杆菌成功表达ALT2蛋白,以镍亲和层析纯化获得ALT活性超过10 000 U/L的ALT2目的蛋白,以此蛋白免疫小鼠后得到5株mAb。结论:经过初步筛选获得2株高特异性的mAb,为研制ALT2蛋白定量检测试剂提供了重要工具。     

促肝细胞生长素单克隆抗体的制备及其免疫组织化学研究

采用超滤法从幼龄猪肝脏中制备的促肝细胞生长素（ＰＨＧＦ）是一类重均分子量为１０６８５Ｄａ的多肽或蛋白，具有特异性地促进肝细胞增生的生物学活性。以ＰＨＧＦ为抗原制备的两株单克隆抗体（ＭｃＡｂ）可以特异地中和ＰＨＧＦ的活性。利用亲和层析技术纯化的ＰＨＧＦ，其活性增加８００倍。经ＰＡＧＥ－ＳＤＳ电泳测其分子量为１１４００Ｄａ，呈均匀的单一组份。免疫组化定位研究表明，ＰＨＧＦ主要分布于胎儿、乳兔和乳猪的肝     

出生前后胆碱乙酰转移酶在大鼠脑内定位的研究

为探讨大鼠胚胎及生后发育期间脑内胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)的变化规律,本研究采用免疫组织化学方法,观察了胚胎和生后大鼠脑内ChAT样(ChAT-like immunoreactive,ChAT-LI)神经元表达的数量和灰度值。结果显示:ChAT-LI产物主要表达在细胞体、纤维及其末梢。ChAT-LI神经元最先在胚胎第12d(embryonic day12,E12),出现于端脑;E14时可见于隔核和中缝核;E16时内嗅区出现ChAT-LI神经元;E18时出现于视前区节细胞层;E20时,海马内部可见部分ChAT-LI纤维;生后第0d(postnatal day0,P0),少量带有生长锥的ChAT-LI纤维出现于海马;P5时,海马内出现ChAT-LI神经元,且ChAT-LI纤维进一步增加;P10时,海马、内嗅区和穹隆等结构中都可见ChAT-LI神经元胞体及纤维。上述结果提示:胆碱能神经元在出生前后的大鼠脑内,尤其是在海马记忆回路的发育过程中存在一定的变化规律,它们可能是学习记忆等功能的结构基础。     

由人免疫球蛋白转基因小鼠制备人抗乙酰胆碱受体单克隆抗体

目的：从人免疫球蛋白（Ig）转基因小鼠制备人源性抗乙酰胆碱受体（AChR）单克隆抗体。方法：以电鳐（Torpedo）AChR（tAChR）作为基础免疫原，分别以tAChR或人AChR（hAChR）α亚单位1～210位氨基酸（Hα1-210）与thioredoxin（Trx）融合制备的融合蛋白Trx-Hα1-210作为加强免疫原，注射人Ig转基因小鼠。应用ELISA检查由该小鼠制备的杂交瘤细胞培养上清液中人源性抗tAChR或抗Trz-Hα1-210单克隆抗体的分泌，应用放射免疫测定法（RIA）测定抗tAChR或抗Trx-Hα1-210单克隆抗体与hAChR的交叉反应性。结果：从tAChR作为加强免疫原组小鼠得到433株分泌人源性抗tAChR单克隆抗体的细胞株，从抗Trx-Hα1-210作为加强免疫原组小鼠得到20株分泌人源性抗Trx-Hα1-210单克隆抗体的细胞株。但这些人源性抗体均不能与hAChR起交叉反应。结论：由人Ig转基因小鼠制备人源性抗AChR单克隆抗体是可行的。     

抗重组GST单克隆抗体的制备及其在融合蛋白纯化中的应用

目的 制备抗重组GST的单克隆抗体（mAb),并用来纯化重组GST融合蛋白,方法 用含重组GST融合蛋白基因的pGEX4T-1质粒转化E.coliBL21,IPTG诱导GST融合蛋白表达,亲和层析和凝胶过滤法分离表达的重组GST融合蛋白,以此蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,按传统的杂交瘤技术制备mAb。将抗GSTmAb经ProteinA纯化后,与Sepharose4B偶联。结果 经3次亚克隆后,获得两株分泌抗GST载体特异性mAb的杂交瘤,采用该mAb对两种不同的GST融合蛋白进行亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定达到了商品化Glutathione-Resin的亲和层析纯化效果。结论 用抗GST蛋白特异性mAb亲和层析纯化融合蛋白是一种经济、实用的方法,且可用于Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。     

抗凋亡抑制蛋白——survivin单克隆抗体的制备

目的制备抗 survivin蛋白单克隆抗体。方法以大肠杆菌表达的 survivin融合蛋白为抗原 ,免疫 Balb/c小鼠 ,通过细胞融合 ,建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。结果获得了 6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。 6株单克隆抗体均能特异识别和结合大肠杆菌表达的 survivin融合蛋白 ,但其中仅有 3株能够结合肿瘤细胞系表达的天然 survivin蛋白 ,并与某些肿瘤细胞系中 5 0 0 0 0 u±分子量的未知蛋白存在交叉反应 ,与正常人外周血淋巴细胞样本未见任何反应。结论通过单克隆抗体的免疫印迹反应 ,可以观察 survivin特定分子量蛋白的表达 ,为深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。此外 ,这些单克隆抗体对于肿瘤诊断也具有一定应用价值。     

大鼠脑桥排尿中枢和脊髓交感中枢之间的形态学研究

为研究大鼠排尿过程中交感神经同副交感神经协同作用的形态学基础,通过形态学方法,用生物素标记的葡聚糖胺(BDA)顺行标记从脑桥排尿中枢(PMC)投射到腰6至骶1(L6~S1)脊髓节段的神经末梢。将荧光金(FG)注入盆节逆行标记副交感神经节前神经元(PPNs),并且通过免疫组化的方法判断该逆标的神经元是否为胆碱能性的。于L1~L2节段IML区和L6~S1节段骶副交感核(SPN)分别注射辣根过氧化物酶(HRP)和麦芽凝集素结合的HRP(WGA-HRP),分别在L6~S1检测逆标神经元和L1~L2节段检测顺行标记终末。结果显示,于L1~L2节段IML区交感节前神经元所在部位注射HRP,在同侧SPN的背内侧发现有逆标神经元,且该神经元为非胆碱能神经元,其胞体显著小于PPNs(P<0.05)。BDA标记的神经末梢主要位于L6~S1节段双侧IML区,也是SPN的所在部位,并发现有些末梢和同侧逆标的HRP阳性神经元有紧密接触。SPN中电泳入WGA-HRP,发现在L1~L2节段IML区有顺标的神经末梢。上述结果提示,脑桥排尿中枢可能通过位于SPN背侧的中间神经元对L1~L2节段IML区内的交感节前神经元发挥调控作用。     

抗菌肽Magainin Ⅱ单克隆抗体的制备及应用

本文采用硝酸纤维素膜脾内埋植免疫,利用淋巴细胞杂交瘤技术,首次制备了抗菌肽ｍａｇａｉｎｉｎ Ⅱ的单克隆抗体,获得４株稳定分泌抗ｍａｇａｉｎｉｎ Ⅱ ｍＡｂ的杂交瘤细胞株。利用该ｍＡｂ对提取的ｍａｇａｉｎｉｎⅡ进行竞争性ＥＬＩＳＡ和免疫组化分析,均获得较满意的效果。     

抗人重组SCF单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

本研究利用ＰＥＸ３１Ｂ作为载体，在大肠杆菌表达出重组人ＳＣＦ融合蛋白。用该蛋白作为抗原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过鼠－鼠杂交瘤技术，成功地获得４株分泌抗人重组ＷＳＣＦ单克隆抗体的杂交瘤细胞系。经检测，它们所分泌的抗体亚类均为ＩｇＧ１，免疫印迹试验和抗体特异性鉴定证实，４株单抗均能特异性地识别可溶性ＳＣＦ。抗ＳＣＦ单抗杂交瘤细胞系的建立，为深入研究ＳＣＦ的生物学特性、功能以及ＳＣＦ产品的纯化，提供了     

产毒性大肠杆菌菌毛抗原F_(41)单克隆抗体的制备及其特异性研究

本文报道以纯化的产毒性大肠杆菌菌毛F_(41)抗原,利用杂交瘤技术获得5株抗F_(41)抗原的单克隆抗体(1F6,2C5,3B6为IgG 1。1 H 5,4E11为IgM)。腹水抗体效价达10~(-6)培养上清抗体效价10~(-3)。通过免疫扩散、免疲印迹法及固相菌体ELISA试验证实,5株单克隆抗体均为针对ETEC菌毛F_(41)抗原的特异性抗体;红血球凝集抑制及肠上皮细胞粘附阻断试验证明1F6、2C5、3B6具有生物学活性,1H5与4E11无生物学活性,这可能(1)建立ELISA捕捉法,从粪便中直接检测F_(41)抗原以及用玻板凝集试验鉴定临床分离菌株。(2)用于F_(41)抗原性的分析及ETEC基因工程疫苗的监控手段。(3)为ETEC·F_(41)菌的致病性研究及被动免疫预防急性腹泻提供依据。     

Deltorphin Ⅰ单克隆抗体的制备及Deltorphin Ⅰ样免疫活性在在体和离体大鼠脑神经元的表达

本研究利用结合到BSA上的deltorphinⅠ肽(DADTⅠ)免疫Balb/c小鼠,成功地制备了特异性抗DADTⅠ单克隆抗体.交叉试验表明,所获抗体仅识别DADTⅠ和DADTⅡ而不识别其L型同分异构体LADTⅠ,也与其它DADTⅠ类似物无交叉反应.Epitope分析表明,该抗体识别DADTⅠ的N末端特异氨基酸序列,其中包括对其活性有重要影响的第二位的D-Alanine.利用这一抗体对成年大鼠脑组织和新生大鼠培养神经元进行了免疫组织化学研究.大鼠脑中有含量较低的DADTI样免疫活性,主要分布在某些特定部位的神经纤维和神经元胞体,如终纹床核、杏仁核、海马、伏核、下丘脑外侧区、黑质、中央灰质等部位.然而在培养的大鼠脑神经元,DADTI样免疫活性的含量却很丰富,神经元的胞体和突起均呈较强的DADTI样免疫活性.两项结果均提示哺乳动物脑神经元很可能产生一种与DADTI在结构上极其类似的物质.     

抗Ⅳ型胶原单克隆抗体CⅣ的研究与鉴定

用人胎盘Ⅳ型胶原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以杂交瘤技术建立了一株能稳定分泌抗ＣｏｌⅣ单抗（ＩｇＧ亚类为ＩｇＧ１）的杂交瘤细胞株。其染色体众数为８７。用胚胎及成人组织的免疫组化（ＡＢＣ－ＡＥＣ法）显示：皮肤，肾小球，肾小管，血管内皮，乳腺，肺组织，胎盘，眼球角膜的基底膜均呈特异性阳性染色，命名为ＣⅣ。此抗体的制成，对于较理想，可靠地显示基底膜，判断肿瘤的良恶性及探讨其浸润机制有重要意义。     

重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体,为rLZ-8的药效学及药代动力学研究奠定基础.方法:以纯度99%的rLZ-8免疫BALB/c小鼠;应用常规的细胞融合技术建立一种能够稳定分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔接种法制备腹水;Protein A Sepharose 亲和层析柱在AKTA纯化仪上对抗体进行纯化;间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价;Western blot胶片曝光方法对rLZ-8单克隆抗体特异性进行分析.结果:筛选出2株可特异性分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株.分别命名为clone13-2-3和clone11-4-4.其抗体亚型分别为IgG1亚型和IgG2a亚型.腹水抗体效价分别为1:12 000和1:7 500,细胞培养上清效价分别为1:3 000和1:2 800.Western blot检测证明这两株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均具有良好的特异性.结论:成功制备出较高效价和较高特异性的鼠抗rLZ-8的单克隆抗体.     

DeltorphinI单克隆抗体的制备及DeltorphinI样免疫活性在在体和离体大鼠脑神经元的表达

本研究利用以BSA上的deltorphinI肽（DAD I）免疫Balb/c小鼠,成功地制备了特异性抗DAD I单克隆抗体。交叉试验表明,所获抗体仅识别DADT I和DADTⅡ而不识别其L型同分异体LADTI,也与其它DADTI类似物无交叉反应。Epitope分析表明,该抗体识别DADTI的N末端特异氨基酸序列,其中包括对其活性有重要影响的第二位的D－Ala-nine。利用这一抗体对成年大鼠脑组织和新生大鼠培养神经元进行了免疫组织化学研究。大鼠脑中有含量较低的DADTI免疫活性,主要分布在某些特定部位的神经纤维和神经元胞体,如终纹床核、杏仁核、海马、伏核、下丘脑外侧区、黑质、中央灰质等部位。然而在培养的大鼠脑神经元,DADTI样免疫活性的含量却很丰富,神经元的胞体和突起均呈较强的DADTI样免疫活性。两项结果均提示哺乳动物脑神经元很可能产生一种与DADTI大结构上极其类似的物质。     

成年大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的共表达

目的 探讨成年大鼠心肌中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的组织学构筑及比例关系.方法 采用免疫组织化学、免疫荧光双标记和Western blotting等方法,观察10只成年大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的构筑特点;利用图像分析系统对Ⅰ、Ⅲ型胶原进行定量分析.结果 Ⅰ型胶原主要表达在心肌细胞群周围和血管外膜,多形成粗纤维,Ⅲ型胶原主要表达于每个心肌细胞周围和血管外膜,主要构成细纤维.免疫荧光双标记显示,粗、细两种胶原纤维均含有Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白.心肌Ⅲ型胶原总含量略高于Ⅰ型胶原.结论 由粗细胶原纤维构成的心肌胶原网络是由Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白共同构成,任何一种蛋白改变都可能影响心肌间质的功能.