藤黄酸诱导骨髓瘤U266细胞凋亡及机制研究

目的探讨藤黄酸对人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的影响及机制。方法不同浓度藤黄酸处理U266细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响,AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞的凋亡,JC-1染色法检测线粒体跨膜电位水平,流式细胞仪检测荧光素激活的Caspase3、Caspase8、Caspase9阳性细胞水平。结果藤黄酸呈浓度依赖性抑制U266细胞的生长,藤黄酸>0.5μg/ml才出现较明显的诱导凋亡的能力,藤黄酸降低U266细胞线粒体跨膜电位水平。藤黄酸作用U266细胞24h和48h时激活的Caspase3、Caspase8、Caspase9阳性细胞比例分别上升24.9%、31.7%、32.4%和57.0%、64.5%、63.5%。结论藤黄酸可抑制U266细胞的生长,机制与诱导U266细胞凋亡有关,线粒体跨膜电位途径和胞浆激活途径参与了凋亡的发生。     

Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究

为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制，采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100nmol／L velcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin—V、线粒体跨膜电位（△ψm）和氧自由基（ROS），用半定量RT—PCR法检测bcl-2 mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖；诱导U266细胞凋亡，24小时Annexin—V阳性细胞比例增高，△ψm降低；12小时时活性氧明显增高，荧光强度增强；抗凋亡基因bcl-2表达降低。结论：velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作用。其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。     

激活Notch信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡

摘要多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞的增殖及凋亡受骨髓造血微环境的调节。Notch信号是骨髓中细胞与细胞之间通讯的主要信号通路之一，它对多发性骨髓瘤细胞的调节作用目前并不清楚。本研究旨在阐明Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡的调节作用。利用RT-PCR分析多发性骨髓瘤细胞Notch信号分子的表达和采用逆转录病毒介导的基因转移方法将Notch-1胞内区(Intracellular domain of Notch，ICN)转入多发性骨髓瘤细胞株，以建立激活)Notch信号的多发性骨髓瘤细胞系；采用台盼蓝拒染和TUNEL方法测定骨髓瘤细胞的死亡。结果表明：RT-PCR检测显示多发性骨髓瘤细胞表达、Notch-1及相关分子。逆转录病毒可以介导外源Notch-ICN在骨髓瘤细胞中表达，激活Notch-1信号可以抑制二甲基鞘氨醇(N，N-dimethylspingosine，DMS)诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡。结论：：Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡有抑制作用，这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供新的靶点．     

细胞凋亡与多发性骨髓瘤

本文主要阐述了与细胞凋亡有关的基因在多发性骨髓瘤细胞表面的表达,并对细胞凋亡在该病发病机制以及治疗当中的可能的作用进行了讨论。     

脂肪酸合成酶抑制剂抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的 明确脂肪酸合成酶（FAS）在人多发性骨髓瘤（MM）细胞中的高表达；探讨FAS抑制剂抑制MM细胞增殖及诱导其凋亡的机制。方法 通过RT-PCR方法检测FAS在MM细胞系U266、RPMI8226细胞中的表达；以MM细胞系U266细胞为模型，MTT法观察FAS抑制剂浅蓝菌素（cerulenin）对U266细胞增殖抑制率；以流式细胞术检测经cerulenin处理后U266细胞Annexin V的表达及细胞周期变化。结果 MM细胞系U266、RPMI8226细胞均有FAS mRNA的高表达，而健康献血员外周血单个核细胞（PBMNC）中不表达FAS mRNA；cerulenin对U266细胞增殖有显著的抑制作用，并呈剂量-效应相关；20μg／ml的cerulenin作用于U266细胞12h，细胞早期凋亡率为56．9％，24h细胞早期凋亡率为69．3％，而对照组分别为4．3％和1．8％（P＜0．01）；细胞周期DNA分析发现，20μg／mlcerulenin作用于U266细胞12h，S期细胞从对照组的9．7％上升至20．3％，作用24h，S期细胞上升为29．8％。结论 FAS在MM细胞中高表达；FAS抑制剂可抑制U266细胞的增殖；DNA合成阻止在S期，其抑制增殖的作用可能是通过促进U266细胞早期凋亡；FAS可能是一个潜在的抗MM的靶位。     

8-氯腺苷酸诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

本研究探究8-氯腺苷酸对多发性骨髓瘤细胞的可能作用。以多发性骨髓瘤细胞株RPMl8226细胞为体外模型,在观察8-氯腺苷酸对细胞生长、活力及形态学影响的基础上,应用流式细胞术检测细胞DNA含量分布和细胞表面Annexin—V的含量,以DNA凝胶电泳技术评判细胞凋亡与否,并应用Westernblot检测药物处理前后细胞内细胞周期调控蛋白cylinE和CDK2的变化。结果表明：低浓度8-氯腺苷酸（1—30μmol／L）能够明显地抑制RPMl8226细胞的生长,显著降低其细胞活力,且呈时间和浓度依赖性。进一步细胞形态学观察、流式细胞术及DNA凝胶电泳分析显示,这些浓度的8-氯腺苷酸诱导RPMl8226细胞凋亡。Western blot检测表明,8-氯腺苷酸可通过影响细胞周期调控蛋白cylin E和CDK2的表达而干扰细胞增殖。结论：8-氯腺苷酸能够有效地抑制多发性骨髓瘤细胞生长并诱导其凋亡。     

藤黄酸诱导Raji细胞凋亡的机理研究

本研究观察藤黄酸对Raji细胞的诱导凋亡作用,探讨死亡诱导清理子-1（death inducer-obliterator 1,DIO-1）在该过程中的作用。采用Annexin V—FITC／碘化丙锭（PU染色流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫印迹法检测Bcl—xL,DIO-1和pro—Caspase 3及其活化片段P17、P20的表达。免疫荧光化学和Hoechst 33258双标染色法检测DIO-1核转位。结果表明,藤黄酸呈剂量依赖性诱导Raji细胞凋亡,下调Bcl—xL表达并上调DIO-1与pro—Caspase 3片段表达,诱导Caspase活化片段的产生及DIO一1的核转位。结论：藤黄酸能诱导Raji细胞凋亡,其机制与DIO-1表达上调及核转位有关,可能通过Caspase 3活化而实现,DIO—1表达上调可能与Bcl—xL表达下调有关。     

醋酸棉酚诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及其机制的实验研究

本研究探讨醋酸棉酚对经典人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的作用及其机制。采用四唑盐比色试验（MTT）、细胞形态学观察、流式细胞仪检测、DNA电泳、Western—blot等方法分剐观察醋酸棉酚对RPMI8226细胞的抑制增殖、诱导凋亡效应及其机制。结果表明：醋酸棉酚在〉16μmol／L浓度时可显著抑制RPMI8226细胞的增殖、促进其凋亡,随着剂量的增加以及时间的延长,效应越明显。研究还发现,醋酸棉酚是通过抑制线粒体膜电位（△ψm）、诱导Bax、Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达来实现上述效应的。结论：醋酸棉酚对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞具有选择性抑制增殖、促进凋亡的效应。     

藤黄酸对K562细胞的凋亡诱导及其作用机制研究

本研究探讨藤黄酸（gambogi cacid,GA）对K562细胞的抑制作用及机制。以不同浓度的藤黄酸处理K562和K562／A02细胞;用四甲基偶氮唑盐（MTF）法检测GA对细胞增殖的影响;碘化丙啶（PI）染色分析细胞周期;AnnexinV／PI双染法检测细胞的凋亡;JC-1染色法检测线粒体跨膜电位水平;流式细胞仪检测荧光素激活的caspase-3、caspase-8、caspase-9阳性细胞水平。结果显示：藤黄酸呈时间和浓度依赖性抑制K562细胞增殖。K562／A02细胞（GA〉2μg/ml）比K562细胞（GA〉0．5μg／ml）需要更高的藤黄酸浓度才显示增殖抑制作用。藤黄酸呈浓度依赖性诱导K562细胞凋亡。藤黄酸0、0．5、1．0、2．0μg／ml浓度对K562细胞周期未显示明显影响。藤黄酸作用后的K562细胞的线粒体跨膜电位明显降低。藤黄酸2μg/ml作用24小时激活的caspase3、caspase8、caspase9阳性细胞比例与对照相比分别上升2．19％、-1．95％、34．01％;作用48小时分别上升60．4％、71．3％、77．7％。结论：藤黄酸对K562细胞株有显著的抑制作用,该作用是通过诱导细胞凋亡实现的。藤黄酸不影响K562细胞的细胞周期。藤黄酸通过线粒体跨膜电位途径和胞浆激活途径诱导K562细胞的凋亡。     

尿多酸肽通过调节caspase家族诱导多发性骨髓瘤细胞U266凋亡的实验研究

目的探讨尿多酸肽抑制多发性骨髓瘤（MM）细胞株U266增值及其机制。 方法采用四甲基偶氮唑（MTT）比色法计算不同尿多酸肽浓度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/g）对U266细胞生长的抑制率,Hoechst33258染色观察尿多酸肽作用后的细胞凋亡情况,Annexin-V/碘化丙啶（PI）检测尿多酸肽作用6、12、24 h后与对照组细胞（加细胞未加药物）的细胞凋亡率。使用Western-blotting法检测caspase 8、caspase 3及其激活物在U266细胞株经尿多酸肽（4 mg/g）作用6、12、24 h后的表达改变。 结果随着尿多酸肽浓度提高,U266细胞抑制率显著上升（F= 17.276,P< 0.001）。经尿多酸肽作用后,Hoechst33258荧光染色提示细胞核浓集及出现凋亡小体。Annexin-V/PI分析显示,尿多酸肽处理6、12、24 h后细胞凋亡率显著高于对照组细胞[（5.53 ± 0.28）%、（9.43 ± 1.78）%、（21.50 ± 2.45）%、（3.03 ± 0.11）%,F= 12.242,P<0.001]。同时,随着尿多酸肽作用时间延长,pro-caspase 8、pro-caspase 3表达明显下降（F= 18.241,P<0.001;F= 4.924,P= 0.005）,而active-caspase 8、active-caspase 3表达明显上升（F= 22.322,P<0.001;F= 6.213,P= 0.002）。 结论尿多酸肽可抑制U266细胞增殖,且可能通过caspase凋亡途径在其中起主要作用。     

苦参碱诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡的实验研究

本研究探讨苦参碱对人骨髓瘤细胞株RPMI8226的作用及其机制。用不同浓度苦参碱处理RPMI8226细胞24、48小时,通过形态学观察、Annexin-V分析、DNA琼脂糖电泳、线粒体膜电位检测观察苦参碱对RPMI8226细胞的促凋亡作用。结果表明：RPMI8226细胞经苦参碱处理后,出现典型的细胞凋亡形态,凋亡早期细胞膜外翻,DNA琼脂糖电泳出现典型的梯状结构,线粒体膜电位崩塌。结论：苦参碱能有效地诱导骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞凋亡,凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性。     

膜联蛋白A2基因对多发性骨髓瘤细胞的诱导凋亡作用及相关机制研究

本研究探讨膜联蛋白A2（AnxA2）基因诱导骨髓瘤U266、RPMl8226细胞凋亡的作用及相关机制。采用AnxA2siRNA转染人骨髓瘤U266、RPMl8226细胞,应用实时PCR和Westernblot检测AnxA2基因和蛋白的表达。应用流式细胞术检测细胞凋亡,应用实时PCR检测凋亡相关基因的表达水平。结果表明,AnxA2siRNA转染U266和RPMl8226后,AnxA2基因和蛋白表达水平均明显下调;细胞凋亡率增高（P〈0．05）,同时降低凋亡相关基因p65NF-κB、儿_2、IL-6的表达（P〈0．05）,增强P53基因的表达（P〈0．05）。结论：AnxA2基因沉默在骨髓瘤细胞U266和RPMl8226凋亡中起促进作用。     

藤黄酸通过MAPK通路诱导Jurkat细胞凋亡的机理

本研究探讨藤黄酸对Jurkat细胞的抑制作用及可能机理。以不同浓度藤黄酸与抑制剂处理Jurkat细胞,AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞的凋亡;流式细胞仪检测荧光素激活的caspase 3、caspase 8、caspase 9阳性细胞水平;免疫印迹检测pro-caspase 3、pro-caspase 9、磷酸化JNK及P38蛋白水平。结果表明,藤黄酸呈浓度依赖性诱导Jurkat细胞凋亡;藤黄酸作用Jurkat细胞后caspase 3、caspase 8、caspase 9阳性细胞水平升高,caspase 3、caspase 9活化蛋白及磷酸化JNK及P38蛋白水平升高;ROS、CaMKⅡ、caspase 3、caspase 9、MAPKK、JNK1/2及P38抑制剂减弱藤黄酸诱导Jurkat细胞凋亡的作用;ROS、CaMKⅡ、MAPKK、JNK1/2及P38抑制剂降低藤黄酸作用Jurkat细胞后caspase 3、caspase 9活化蛋白水平;ROS、CaMKⅡ、MAPKK、JNK1/2抑制剂降低藤黄酸作用Jurkat细胞后磷酸化JNK蛋白水平;ROS、CaMKⅡ、MAPKK、P38抑制剂减弱藤黄酸作用Jurkat细胞后磷酸化P38蛋白水平。结论:藤黄酸通过激活caspase途径诱导Jurkat细胞凋亡,该过程可能与ROS-CaMKⅡ-MAPKK-JNK/P38通路有关。     

三氧化二砷联合抗坏血酸增强人多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）联合抗坏血酸（AA）对人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞生长抑制及诱导凋亡作用。方法：四甲基噻唑氮蓝比色法检测As2O3联合AA对U266细胞生长抑制作用;流式细胞术检测As2O3联合AA对U266细胞周期和凋亡率的影响。结果：单用AA对U266细胞生长无影响,单用5μmol/LAs2O3对U266细胞生长有一定影响,As2O3联合AA较单用As2O3对U266细胞生长抑制作用显著（P〈0.05）。与单用As2O3相比,As2O3联合AA作用于U266细胞48h后,细胞凋亡率显著增加（P〈0.05）,G0/G1期细胞比例升高,S期细胞减少。结论：AA可以增强As2O3对U266细胞诱导凋亡作用。     

Longikaurin A诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的初步研究

本研究冬凌草甲素结构类似物longikaurin A对多发性骨髓瘤细胞H929的作用和机制。采用CCK-8法检测longikaurin A和冬凌草甲素对H929细胞的增殖抑制效应。在相差显微镜下观察longikaurin A处理12 h对H929细胞形态的影响;AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡的比例;Western blot检测caspase-9、caspase-3的活化水平及PARP的剪切情况;应用DCFDA探针检测2μmol/L longikaurin A处理不同时间H929细胞中活性氧的水平。结果显示,与冬凌草甲素(IC50为10.66μmol/L)相比,longikaurin A(IC50为0.85μmol/L)能够更有效地抑制H929细胞增殖;longikaurin A作用24 h,AnnexinⅤ阳性细胞比例显著升高,caspase-3、caspase-9活化,caspase-3的底物PARP发生剪切,提示longikaurin A能诱导H929细胞发生凋亡;活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸能够显著抑制longikaurinA诱导的细胞凋亡,然而longikaurin A本身并不升高活性氧水平。结论:与冬凌草甲素相比,longikaurin A在较低浓度下能够诱导多发性骨髓瘤细胞H929发生细胞凋亡。     

白桦脂酸对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226凋亡的诱导

为了探讨白桦脂酸对多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226的诱导凋亡作用,用MTT、Annexin—V／PI双标记流式细胞术、PI单标记流式细胞术和Hoechst33258染色分别检测白桦脂酸对RPMI一8226增殖抑制、凋亡诱导、细胞周期的作用和形态学变化.用RT—PCR技术检测加药后RPMI-8226凋亡相关基因bcl—xl和caspase3的表达的变化。结果表明：白桦脂酸对RPMI-8226作用24和48小时的Ic50值分别为10．156±0．659和5．434±0．212ng／ml,在一定浓度范围内,白桦脂酸对其增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性。RPMI．8226细胞的凋亡率随药物浓度的增加而增加。细胞周期测定显示,随药物浓度的增加G0／G1期的细胞比例增高,处于S期的细胞比例减低,药物对G2／M期细胞影响不明显。Hoechst33258染色在荧光显微镜下可见药物处理组和对照组之间细胞形态的显著变化。RT—PCR测定示,随加药浓度的增加,bcl—xl基因的表达呈降低趋势,而caspase3基因的表达呈增高趋势。结论：在一定的浓度范围内,白桦脂酸可诱导RPMI-8226发生凋亡且呈时间剂量依赖性,该过程可能与其上调caspase3和下调bcl—xl基因的表达有关。白桦脂酸还可以影响RPMI-8226细胞系的G1／S期,使细胞阻滞在G0／G1期。     

三氧化二砷对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的作用及机制研究

目的研究三氧化二砷(arsenictrioxide,ATO)对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖及凋亡的影响并探讨其机制.方法采用CCK-8法检测ATO作用后对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况;ELISA法检测RPMI8226细胞分泌VEGF的水平;Westernblot检测ATO作用后Bcl-2蛋白、ERK1/2及其磷酸化蛋白水平变化.结果 ATO对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖抑制呈剂量-时间依赖性.选取不同浓度ATO作用于RPMI8226细胞24h及48h,ATO诱导RPMI8226细胞凋亡,呈时间依赖性和浓度依赖性(P<0.05).随着ATO浓度的增加,G1期细胞数逐渐增多,提示ATO将RPMI8226细胞阻滞在G1期.此外,与空白对照组相比,ATO作用于细胞后,VEGF表达及分泌量越少,细胞内Bcl-2蛋白表达下降,ERK1/2及其磷酸化蛋白在RPMI8226细胞内稳定表达,其表达水平无变化.结论 ATO对RPMI8226细胞具有明显的抑制增殖及诱导凋亡作用;ATO将RPMI8226细胞阻滞在G1期;ATO作用后,细胞的VEGF表达及分泌量越少,Bcl-2蛋白表达下降,而对ERK1/2及其磷酸化蛋白表达无影响.     

氟达拉滨诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及其基因表达分析

目的 探讨氟达拉滨诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡及其分子机制.方法 用MTT法检测氟达拉滨对MM细胞的生长抑制作用;用流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法分析凋亡蛋白表达;采用细胞凋亡基因芯片技术检测并分析对照组与氟达拉滨处理组间的基因表达差异.结果 氟达拉滨显著抑制RPMI8226和KM3细胞生长,呈时间和剂量依赖性.24 h半数生长抑制值(IC50)分别为2.13μg/ml和0.36 μg/ml.流式细胞术分析显示,氟达拉滨作用24 h后MM细胞凋亡呈剂量依赖性,同时伴有caspase-3和PRAP激活,具有典型的细胞凋亡生物学特征.在97个凋亡相关基因中,筛选出25个差异表达基因.氟达拉滨处理组与对照组比较,表达上调的基因有13个,主要涉及Bcl-2家族促凋亡基因、肿瘤坏死因子及其受体超家族基因,以及胱天蛋白酶募集结构域家族.表达下调的基因有12个,主要涉及Bcl-2家族抗凋亡基因、肿瘤坏死因子超家族及其受体相关因子基因,以及凋亡抑制蛋白家族.结论 氟达拉滨显著抑制MM细胞生长,诱导细胞凋亡;其作用机制涉及多个凋亡相关基因表达改变.     

EGCG对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的抑制效应及机制初探

本研究探讨绿茶茶多酚成分之一表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG)]对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的影响及其机制。体外培养多发性骨髓瘤细胞KM3,观察不同浓度EGCG作用后的培养上清对血管内皮细胞株HUVEC迁移和形成血管能力的影响。ELISA法检测KM3细胞培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)分泌水平;RT-PCR方法检测KM3细胞VEGF mRNA表达水平。结果表明:EGCG以浓度依赖方式抑制KM3细胞培养上清促内皮细胞迁移的作用,5,25,50和100μmol/L的EGCG迁移细胞数目分别为414±27,299±70,202±42及116±13个,且EGCG的浓度与内皮细胞的迁移数目呈负相关(r=-0.952,p<0.05)。同时,内皮细胞形成小管的面积随EGCG浓度的升高而减少,25及50μmol/L时的面积分别是88343.9±3231.1和60897.5±914.1μm2,均明显低于对照组(p<0.01),小管面积与EGCG浓度呈负相关(r=-0.888,p<0.05)。5、25、50、100μmol/L的EGCG作用于KM3细胞48小时后培养上清中VEGF的含量分别为1399.0±47.4pg/ml,660.1±5.7pg/ml,108.5±5.8pg/ml和26.2±18.6pg/ml,与对照组比较,25、50、100μmol/L组均有统计学意义(p<0.01)。RT-PCR结果显示EGCG抑制KM3细胞VEGF的mRNA水平表达,且呈浓度依赖性。结论:EGCG能显著抑制多发性骨髓瘤细胞KM3的促血管新生作用;下调VEGF转录水平的表达,减少VEGF的分泌可能是其药理作用机制之一。     

伊马替尼诱导c-kit阳性多发性骨髓瘤细胞凋亡

目的 探讨伊马替尼在体外对c-kit表达阳性多发性骨髓瘤细胞的作用及机制.方法 不同浓度伊马替尼处理KM3细胞后,采用二甲氧唑黄比色法(XTT法)检测药物的细胞毒性作用,流式细胞术检测细胞周期,Annexin V/PI双标流式细胞术和DNA片段分析法检测细胞凋亡,Westernblot法检测蛋白质水平变化.结果 伊马替尼浓度在0.25 μmol/L或以上时,可明显抑制KM3细胞增殖,呈量效关系,48 h IC50为0.33μmol/L(P＜0.01);阻滞细胞周期于G0/G1期;Annexin V和DNA凝胶电泳检测提示随着伊马替尼浓度的增大,KM3细胞凋亡率增加,且可以促使caspase-3和聚ADP核糖聚合酶(PARP)发生裂解;处理后c-kit表达降低,且阻断外源性IL-6对c-kit的促磷酸化作用.结论 伊马替尼可以通过抑制c-kit受体相关信号传导途径抑制KM3细胞增殖,诱导细胞凋亡.