密蒙花总黄酮含药血浆干预干眼症细胞凋亡模型AR mRNA表达

目的:探讨密蒙花总黄酮含药血浆对雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡模型ARmRNA表达的影响,并应用雄激素受体阻滞剂以确定ARmRNA表达与密蒙花总黄酮含药血浆和AR受体的结合效应有关。方法:体外分离及培养泪腺上皮细胞,以H2O2诱导大鼠泪腺上皮细胞凋亡,建立雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡模型。设立空白血浆组、密蒙花总黄酮含药血浆组、丙酸睾酮组,分别观察各组ARmRNA表达情况;并应用雄激素受体阻滞剂氟他胺,观察密蒙花总黄酮的拟雄激素效应。结果:密蒙花总黄酮含药血浆干预组与丙酸睾酮干预组中ARmRNA的表达增强,两组间的差异有显著性(P<0.05)。各组加入雄激素受体阻滞剂后,组间的ARmRNA表达无差异(P>0.05)。结论:密蒙花总黄酮含药血浆可促进ARmRNA表达,产生与丙酸睾酮相同的雄激素效应。ARmRNA的表达与密蒙花总黄酮含药血浆和AR受体的结合效应有关。     

密蒙花总黄酮含药血浆干预干眼症细胞凋亡模型STAT1磷酸化蛋白表达

目的:探讨密蒙花总黄酮含药血浆和雄激素受体阻滞剂对泪腺上皮细胞中STAT1的磷酸化蛋白表达的影响。方法:体外分离及培养泪腺上皮细胞。以H2O2诱导大鼠泪腺上皮细胞凋亡,建立雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡状态。设立空白血浆组、密蒙花总黄酮含药血浆干预组、丙酸睾酮干预组,分别观察各组STAT1的磷酸化蛋白表达情况;并应用雄激素受体阻滞剂氟他胺,考察密蒙花总黄酮的拟雄激素效应。结果:免疫印迹结果表明,含药血浆干预后,密蒙花总黄酮含药血浆干预组中(0.353±0.494)与丙酸睾酮干预组中STAT1的磷酸化蛋白(0.502±0.036)的表达增强,两组间的差异有统计学意义(P<0.01)。各组加入雄激素受体阻滞剂后,各组间(分别是0.268±0.061,0.283±0.106,0.213±0.071)的STAT1的磷酸化蛋白表达间无差异。结论:密蒙花总黄酮含药血浆可促进STAT1的磷酸化表达,并激活STAT1细胞信号传导通路,而产生与丙酸睾酮相同的雄激素效应。     

密蒙花总黄酮对去势导致干眼症雄鼠泪腺Bax mRNA、BcL-2 mRNA表达的影响

目的观察密蒙花总黄酮对雄激素水平下降所致干眼症雄鼠的泪腺上皮细胞中Bax mRNA、Bcl-2mRNA表达的影响。方法将健康1月龄、体质量150～180gWistar雄性大鼠150只随机分为A1、B1、C1、D1、E1、A3、B3、C3、D3、E3、A5、B5、C5、D5、E5共15组,每组10只。采用去势的方法建立雄激素水平下降所致干眼症动物模型,分别观察各组SchimerI试验、泪膜破裂时间及角膜荧光素染色情况,以确定干眼症模型是否建立成功。其中,A代表正常组;B代表假手术组;C代表模型对照组;D代表雄激素对照治疗组(造模成功后,丙酸睾酮1mg.kg-1大腿肌肉注射,每3d1次);E代表密蒙花总黄酮治疗组(造模成功后,密蒙花总黄酮0.045g.kg-1灌胃,每3d1次);1代表饲养1个月;3代表饲养5个月;5代表饲养7个月。用RT-PCR法对各组泪腺组织中Bax mRNA、Bcl-2mRNA的表达进行检测,并比较。结果SchimerI试验、泪膜破裂时间及角膜荧光素染色结果显示,大鼠均在造模3个月后形成干眼症。D3组、D5组泪腺组织中的BaxmRNA相对含量较C3组、C5组降低,差异均有统计学意义(均为P<...     

密蒙花提取物滴眼剂对实验性干眼症鼠泪腺组织细胞凋亡的影响

目的:观察密蒙花提取物滴眼剂对去势所致干眼症雄鼠基础泪液分泌量、泪膜稳定性、泪腺凋亡相关基因蛋白Bax和Bcl-2表达的影响。方法:将45只Wister雄性大鼠随机分为空白组(A1,A2,A3)、模型组(B1,B2,B3)、密蒙花提取物滴眼剂治疗组(C1,C2,C3),共9组,1:饲养1mo,2:饲养2mo,3:饲养3mo,每组5只。B,C组行去势术建立动物模型,C组以密蒙花提取物滴眼剂连续滴眼治疗,对全部实验大鼠行SchirmerⅠ试验、测量泪膜破裂时间,采用免疫组织化学的方法,对大鼠泪腺组织中凋亡相关基因蛋白Bax和Bcl-2进行检测。结果:C组SchirmerⅠ试验测量值明显高于B组(P<0.01),泪膜破裂时间明显长于B组(P<0.01)。泪腺导管及腺泡上皮细胞中Bax阳性表达的细胞数均明显低于B组,而Bcl-2阳性表达的细胞数均明显高于B组(P<0.01)。结论:密蒙花提取物滴眼剂可显著抑制雄激素水平降低后大鼠干眼症的发生,抑制泪腺细胞凋亡,维持泪腺基础分泌量和泪膜的稳定性。     

淫羊藿总黄酮含药血浆对雄兔干眼泪腺上皮细胞凋亡模型Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达的影响

目的　观察淫羊藿总黄酮含药血浆对雄兔干眼泪腺上皮细胞Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达的影响。方法　取61只健康无眼疾1月龄雄性新西兰大耳白兔，随机取1只雄兔泪腺，培养泪腺上皮细胞，取第3代泪腺上皮细胞用于实验。60只雄兔随机分成淫羊藿总黄酮10.0倍组、5.0倍组、2.5倍组和空白对照组，通过MTT法确定后续干预细胞的含药血浆的浓度。将所培养第3代泪腺上皮细胞随机分为淫羊藿总黄酮治疗组、含雄激素培养对照组和空白组（DMEM/F12低糖培养基中分别加入含淫羊藿总黄酮血浆、10^-6 mol·L^-1丙酸睾酮和空白血浆）。干预48 h后各组均加入H₂O₂继续培养60 min诱导细胞凋亡，采用RT-PCR法检测各组细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达。结果　MTT实验显示应选取淫羊藿总黄酮2.5倍组作为干预细胞含药血浆的浓度。淫羊藿总黄酮10.0倍组、5.0倍组、2.5倍组和空白对照组兔血浆中朝藿定A浓度分别为120.5 μg·L^-1、65.7 μg·L^-1、21.9 μg·L^-1、0 μg·L^-1，淫羊藿苷浓度分别为130.8 μg·L^-1、45.3 μg·L^-1、18.9 μg·L^-1、0 μg·L^-1。淫羊藿总黄酮治疗组、含雄激素培养对照组、空白组的Caspase-3 mRNA相对含量分别为0.35±0.07、0.68±0.18、1.00±0.19，Caspase-8 mRNA相对含量分别为0.27±0.21、0.72±0.10、1.00±0.15。空白组Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达均高于含雄激素培养组，空白组和含雄激素培养组均高于淫羊藿总黄酮治疗组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　淫羊藿总黄酮能够下调雄兔干眼泪腺上皮细胞Capase-3、Capase-8 mRNA的表达，这可能是其治疗干眼的关键机制之一。     

密蒙花滴眼液对去势雄兔泪腺细胞炎症因子的影响

目的：观察不同浓度密蒙花滴眼液对去势雄兔泪腺细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的影响,探讨不同浓度密蒙花滴眼液对去势雄兔干眼症模型的疗效。

方法：将密蒙花原药材制备成低、中、高3种浓度滴眼液。将42只健康成年新西兰长耳白兔(雄性),随机分为A：空白组; B：模型组; C：低浓度密蒙花滴眼液组; D：中浓度密蒙花滴眼液组; E：高浓度密蒙花滴眼液组; F：安慰剂滴眼液组; G：睾酮组等7组,每组6只。除A组外其余6组实验用兔行双侧睾丸及附睾切除术。从术后第3天开始C、D、E、F组分别予相应滴眼液滴双眼。各组实验用兔,分别于术前和术后第4wk各进行一次Schirmer I试验(SIT)和泪膜破裂时间(BUT)测定。采用免疫组化法对泪腺细胞炎症因子TNF-α和IL-1β的表达进行检测。

结果：1)SIT与BUT值比较：术后C组与D、E、G组比较,有统计学意义(P<0.01); D、E、G组间相比较,无统计学意义(P>0.05); 2)术后各组炎症因子TNF-α、IL-1β比较：C组与D、E、G组比较,有统计学意义(P<0.05); D、E、G组间相比较,无统计学意义(P>0.05)。

结论：1)密蒙花滴眼液具有与雄激素相似的抑制细胞炎症因子表达的作用,但其作用弱于雄激素; 2)中、高浓度密蒙花滴眼液对TNF-α和IL-1β的抑制作用要强于低浓度密蒙花滴眼液,但中、高浓度密蒙花滴眼液的抑制作用差别不明显。     

淫羊藿总黄酮对干眼症雄兔泪腺中Bax和Bcl-2表达的作用研究

目的　观察淫羊藿总黄酮对干眼症雄兔泪腺中Bax和Bcl-2表达的作用。方法　随机将80只雄性健康新西兰大耳白兔分为A组（空白组）、B组（手术组）、C组（淫羊藿总黄酮组）、D组（雄激素组）,每组20只。A组以生理盐水进行灌胃,B、C、D三组建立干眼症模型后分别以生理盐水灌胃、淫羊藿总黄酮灌胃、丙酸睾酮肌肉注射进行干预。每组根据喂养时间不同又分为A1~D1组（喂养1个月）和A2~D2组（喂养2个月）,每组10只。A1~D1组于造模前及造模后2周、4周时,A2~D2组于造模后6周及末次最后一次用药后对雄兔进行泪液分泌实验（Schirmer Ⅰ test,SIT）和泪膜破裂时间（BUT）检查;A1~D1组和A2~D2组分别在饲养1个月及2个月时处死雄兔,即刻摘取泪腺,应用Western blot检测凋亡相关因子Bax和Bcl-2的蛋白表达。结果　SIT、BUT检查结果显示,B、C、D三组雄兔均在造模1个月后形成干眼症。C1组、C2组及D1组、D2组雄兔泪腺组织中的Bax相对含量均较B1组、B2组低,差异均有统计学意义(均为P<0.01);C2组Bax相对含量低于C1组,差异有统计学意义 (P<0.05),而C2组与D2组Bax相对含量差异无统计学意义(P＞0.05);C1、C2组及D1组、D2组雄兔泪腺组织中Bcl-2相对含量均较B1组、B2组高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);C2组Bcl-2表达高于C1组,差异有统计学意义 (P<0.05),而C2组与D2组Bcl-2表达差异无统计学意义(P＞0.05)。结论　淫羊藿总黄酮可提高干眼症雄兔泪腺中Bcl-2 的表达,减少Bax的表达,且随用药时间增长其效果逐渐与雄激素相当。淫羊藿总黄酮很可能是通过促进凋亡相关基因Bcl-2、调低Bax的表达达到抑制细胞凋亡的作用。     

手机光照刺激对视网膜色素上皮细胞的影响

目的：观察手机光照刺激体外培养人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium; RPE)后形态及B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl2-Associated X(Bax)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)的mRNA表达变化。

方法：将体外培养的人RPE细胞随机分成4组,根据RPE细胞光照时间长短分为照射3h光照组、6h光照组、12h光照组和0h光照组。在特制的培养箱内,将智能手机屏幕开到最大亮度(200±20Lx)做为光源,持续静音情况下循环播放彩色图片。然后应用苏木精-伊红(HE)染色法,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法观察各实验组RPE细胞形态学改变,并运用聚合酶链反应(PCR)技术检测各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达变化。

结果：用HE染色、TUNEL染色、MTT法观察发现各光照组RPE细胞形态学无明显改变,差异均无统计学意义(P>0.05)。应用PCR技术检测发现RPE细胞在光照刺激3h光照组和6h光照组,细胞内的Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达与0h光照组的差异均无统计学意义(P>0.05)。但随着光照时间持续延长(12h),细胞内的Bcl-2表达下调,Bax、Caspase-3表达水平均上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：手机屏幕等作为人造光源在长期持续高亮度照射下会引起体外培养人视网膜色素上皮细胞的损伤。     

Bcl-2和Bax在结膜松弛症患者结膜组织中的表达

目的：研究Bcl-2和Bax在结膜松弛症患者的结膜组织中的表达状况。

方法：HE染色观察松弛结膜组织的组织特点,免疫组织化学方法检测20例结膜松弛症患者松弛结膜组织中Bcl-2和Bax的表达状况,并与10例正常结膜组织进行比较。

结果：松弛结膜组织鳞状上皮增生间质中有淋巴、浆细胞浸润,Bcl-2在松弛结膜组织中表达与对照组比较差别无显著性意义(P>0.05),Bax在松弛结膜组织中表达明显增加,与对照组比较差别有显著性意义(P<0.05),经Spearman等级相关分析(r=0.432,P>0.05),Bcl-2与Bax阳性表达间无相关性。

结论：Bcl-2和Bax表达失衡可能在结膜松弛症的发生和发展中起着重要的作用。     

密蒙花提取物滴眼对干眼症去势鼠泪腺组织雄激素受体数量的影响

目的:观察密蒙花提取物滴眼剂对去势所致干眼症雄鼠基础泪液分泌量、泪膜稳定性、泪腺中雄激素受体表达的影响,探讨密蒙花提取物滴眼剂抗雄激素水平下降所致干眼症的作用机制。方法:将45只Wister雄性大鼠随机分为空白组(A1、A2、A3)、模型组(B1、B2、B3)、密蒙花提取物滴眼剂治疗组(C1、C2、C3),共9组,1代表饲养1mo,2代表饲养2mo,3代表饲养3mo,每组5只,对B、C组行去势术建立动物模型,对C组以密蒙花提取物滴眼剂连续滴眼治疗1mo,对全部实验大鼠行Schirmer I试验、测量泪膜破裂时间,采用流式细胞仪检测泪腺中雄激素受体的表达。结果:C组Schirmer I试验测量值明显高于B组(P<0.01),泪膜破裂时间明显长于B组(P<0.01),显示密蒙花提取物滴眼剂能够显著维持泪腺基础分泌量和泪膜的稳定性;C组流式细胞仪检测的AR阳性表达率明显高于B组,显示密蒙花提取物滴眼剂中的有效成分可能有拟雄激素的效应。结论:密蒙花提取物滴眼剂中主要成分为黄酮类物质,可显著抑制雄激素水平降低后大鼠干眼症的发生,其作用机制可能与黄酮类物质结构与雄激素类似,可以起到拟雄激素效应,从而维持泪腺基础分泌量和泪膜的稳定性。     

Effect of Buddleia flavonoids drug-containing plasma on the expression of STAT1 phosphoprotein in lacrimal gland epithelial cells in vitro

AIM: To explore the effect of Buddleia flavonoids drug-containing plasma and androgen receptor (AR) blocker on the expression of STAT1 phosphoprotein. · METHODS: In vitro lacrimal gland epithelial cells were cultivated with H2O2 to establish the dry eye apoptosis state. Blank plasma group, Buddleia officinalis plasma total flavonoids interfere with drug-containing group, and the intervention group of testosterone propionate were set. The expressions of STAT1 phosphoprotein of each group were observed by Western blot. AR blocker flutamide was used to explore the intended androgen effect of Buddleia flavonoids. · RESULTS: After the intervention of drug-containing plasma, the expression of STAT1 phosphoprotein in Buddleja officinalis drug-containing plasma intervention group (0.353±0.494) and testosterone propionate intervention group (0.502±0.036) were enhanced and the differences between the two groups were significant (P <0.01). After using AR blocker, the expression of STAT1 phosphoprotein in each group (0.268±0.061, 0.283±0.106, 0.213±0.071) had no difference. · CONCLUSION: Buddleja officinalis drug-containing plasma total flavonoids can promote the expression of STAT1 phosphorylation.     

针刺对干眼兔泪腺形态学及泪腺上皮细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响

目的 探讨针刺对干眼兔泪腺形态学及泪腺上皮细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响,分析针刺对干眼的作用机制.方法 取健康新西兰白兔18只随机分为空白组、模型组、针刺组,每组6只,空白组不作任何处理;模型组皮下注射氢溴酸东莨菪碱,每天4次,每次2 mg·kg-1共24 d;针刺组在与模型组同样处理的基础上进行针刺,每天1次,共14 d.不同时段观察各组泪液分泌试验检测泪液量的结果,光镜、电镜观察泪腺形态学变化,免疫组织化学检测泪腺组织中凋亡相关基因蛋白的表达.结果 泪液分泌试验检测泪液量结果显示在针刺第4、7、14天同时段针刺组与模型组相比明显升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);在针刺第14天时,针刺组与实验前相比,差异无统计学意义(P＞0.05).光镜、电镜示针刺组泪腺上皮细胞胞浆丰富,排列紧密,活动良好,与空白组接近.免疫组织化学检测显示与模型组比较,针刺组泪腺导管及腺泡上皮细胞中Bax的阳性细胞半定量评分值明显低,差异有统计学意义(P ＜0.05);Bcl-2的阳性细胞半定量评分值亦低,但差异无统计学意义(P＞0.05).与空白组相比,针刺组Bax、Bcl-2评分值差异均无统计学意义(均为P＞0.05).与模型组比较,针刺组的泪腺导管及腺泡上皮细胞中Fas、FasL的阳性细胞半定量评分值明显低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).与空白组相比,针刺组Fas、FasL评分值差异均无统计学意义(均为P＞0.05).结论 针刺通过抑制干眼兔泪腺组织的细胞凋亡及腺体萎缩,促进兔干眼模型的泪腺代谢,从而达到增加泪液分泌的作用.     

密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼病血清睾酮水平的影响

目的:观察密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼病大鼠模型基础泪液分泌量、泪膜稳定性及血清睾酮水平的影响,探讨密蒙花总黄酮抗性激素水平失调导致的大鼠干眼病的作用机制。方法:将1月龄健康雄性Wistar大鼠150只,体质量200g左右,采用随机数字法分为5组,每组30只。分别为:A:正常组;B:假手术组;C:手术对照组;D:雄激素治疗组;E代表:密蒙花总黄酮治疗组;将C,D,E三组实验鼠切除双侧睾丸及附睾;B组只切开阴囊而不切除睾丸,作为假手术组;A组不做任何处理。各组在造模后1wk,待伤口基本愈合后开始用药。各组实验动物分别于用药1,3,5mo后随机取10只,行SchirmerⅠ试验(SⅠt)、测量泪膜破裂时间(breaking up time,BUT),于第5mo,抽血测定血清睾酮水平。结果:D,E组SⅠt测量值明显高于C组(P<0.05)、BUT明显长于C组(P<0.05),血清睾酮水平C,E组明显低于A,B,D组(P<0.0l)。结论:雄激素水平下降可导致干眼病,采用双侧睾丸及附睾切除的方法可成功建立雄激素水平下降所致的大鼠干眼病动物模型。密蒙花总黄酮具有拟雄激素效应,能够产生同丙酸睾酮治疗干眼病相似的效果。密蒙花总黄酮可能成为治疗干眼病的一个全新药物。     

紫外线照射对SD大鼠晶状体上皮细胞p53、Bax、Bcl-2表达的影响

目的 探讨p53、Bax、Bcl-2基因在紫外线诱导晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)凋亡中的作用.方法 6周龄SD大鼠40只随机分为对照组和实验组,对照组不做处理,实验组腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(0.35 mL/100 g),以波长为300～ 320 nm的紫外线照射眼球15 min,分别于紫外线照射后1、3、5、7d处死并取出晶状体.Hoechst33258染色法观察LEC的形态变化,实时定量PCR及免疫组织化学检测p53、Bax、Bel-2mBNA和蛋白在LEC中表达水平.结果 紫外线照射后晶状体发生混浊,其LEC发生凋亡,细胞排列不规则、大小不一.实时定量PCR检测结果显示,与对照组相比,紫外线照射后1 d BaxmRNA表达水平升高(P＜0.05),照射后3、5、7 d B趿和p53 mR-NA表达水平均升高(均为P＜0.01);与对照组相比,Bcl-2 mRNA表达水平在照射后ld降低(P＜0.01),而照射后5d和7d则升高(均为P＜0.01).紫外线照射后p53与Bax mRNA相对表达水平的变化呈正相关(r=0.952,P＜0.01).免疫组织化学结果显示,紫外线照射后LEC中p3和Bax蛋白表达逐渐增强,且由细胞质向细胞核转移;相反照射后1 d Bcl-2蛋白表达降低,而3、5、7d则逐渐增高.结论 紫外线诱导LEC凋亡与p53介导Bax/Bcl-2的表达调控有关.