BMP-4cDNA的克隆表达及活性的初步测定

目的：利用原核基因工程生产有诱骨活性的骨形态发生蛋白－4（BMP－4），方法：应用RT－PCR技术，从成熟人的胎盘组织中扩增出长0．34Kb编码入骨形态发生蛋白－4成熟肽的基因序列，经测序证实后，装入表达载体pET-22b，诱导表达后SDS－PAGE显示在14kd处有一明显的表达条带，经初步鉴定，证实表达蛋白部分位于裂菌处理后的上清中，部分以包涵体的形式存在于沉淀中，将沉淀中的包涵体蛋白纯化，变性和复性处理，和上清中的蛋白分别经真空冷冻干燥后，植入小鼠的肌肉内检测蛋白活性。结论：第14d和21d，组织切片可见骨细胞和骨基质的形成，结论：大肠杆菌表达的BMP－4的经复性处理后具有诱骨活性。     

不同复性方法制备的rhBMP-2m诱导异位成骨活性比较

目的:用三种不同方法复性重组人骨形成蛋白2成熟肽(rhBMP-2m),比较其异位诱骨活性.方法:将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的rhBMP-2m用三种不同方法复性:①对pH 4.8复性液透析复性;②对pH 9.0复性液稀释复性;③对pH 6.5复性液透析复性.不加任何载体,1 mg复性后rhBMP-2m直接植入小鼠肌肉观察诱骨生成.结果:得到纯度为98%的rhBMP-2m.①pH 4.8透析复性后蛋白可溶.经过滤除菌,可溶性rhBMP-2m没有损失.冻干后植入肌袋,2 wk后诱导生成软骨,4 wk诱导生成骨小梁.②pH 9.0稀释复性后虽然肉眼观察蛋白似为可溶,但经除菌膜过滤rhBMP-2m损失90%以上.冻干后植入肌袋,1 wk诱导生成软骨,2 wk诱导软骨内成骨,3 wk出现骨小梁.③pH 6.5透析复性后蛋白不可溶,植入肌袋,2 wk诱导生成骨小梁,4 wk后出现骨髓样细胞.结论:相比酸性和碱性条件,中性条件下复性的rhBMP-2m的诱骨活性最好,但酸性条件下复性的rhBMP-2m溶解度好.     

重组人骨形成蛋白-7成熟肽的表达、纯化及活性的研究

目的:研究重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性,为其实际应用打下基础.方法:将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2-B7m,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达;通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白;用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性,用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12-K4检测其活性.结果:成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2-B7m;42℃诱导5 h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白40.3%,表达产物以包涵体形式存在.包涵体经洗涤、离子交换层析纯化,目的蛋白纯度至少在96.0%以上.Western blot实验证实其抗原性,细胞株C2C12-K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP-7m有较强的活性.结论:成功地在E.coli中表达了hBMP-7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.     

重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和初步活性测定

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体, 研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ 重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２ （ＢＭＰ－２） 成熟肽的０．３６ ｋｂ 基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７ （ＢＭＰ－７） 成熟肽的０．４４ｋｂ 基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７ 融合基因; 经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。克隆质粒转化的工程菌,经４２℃诱导４～６ ｈ 后,高效表达重组人骨形态发生蛋白－２／７, 在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一新的蛋白带, 分子量约２９ ｋｕ,约占菌体总蛋白的２０％ ,表达蛋白以包涵体的形式存在,经初步纯化、裂解、复性后的ＢＭＰ－２／７ 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。ＢＭＰ－２／７ 融合基因的构建和表达,可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白     

人骨形成蛋白2碳端肽在大肠杆菌中的高表达及活性测定

利用基因工程技术生产人骨形成蛋白（ｈＢＭＰ），为其诱骨机理及临床应用研究提供前提条件。作将ｈＢＭＰ２ ｃＤＮＡ３’端７３２ｂｐ片段，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，经ＩＰＴＧ诱导后，表达产物存在于包涵体中，将其纯化复性后，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＦＰＬＣ分析，并作小鼠体内异位诱骨活性检测。表达的ｈＢＭＰ２与ＧＳＴ的融合蛋白Ｍｒ＝５１ｋｕ，占菌体总蛋白的３０％，纯化、复性后，ＦＰＬＣ分析示尖而     

重组人骨形态发生蛋白-2原核表达及单克隆抗体制备

目的 利用原核表达系统(E.coli)表达纯化重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m),并制备rh-BMP-2m的单克隆抗体.方法 将工程菌株进行常规发酵,自诱导表达,裂菌离心分离包涵体,包涵体变性后经阳离子交换色谱分离纯化.纯化后的变性rhBMP-2m经稀释复性,获得具有生物学活性的rhBMP-2m.并以此作为抗原,免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体.结果 获得还原SDS-PAGE下95％以上纯度的rhBMP-2m.细胞活性结果分析显示,所获得的rhBMP-2m具有较强的生物学活性.免疫小鼠最终获得两株稳定分泌抗rhBMP-2m抗体的杂交瘤细胞株.结论 成功制备了具有生物学活性的rhBMP-2m及其单克隆抗体,为rhBMP-2未来的研究和制备奠定良好的基础.     

创伤弧菌溶细胞素基因重组蛋白复性条件的优化及溶血活性鉴定

目的:对由大肠杆菌表达系统表达的创伤弧菌溶细胞素蛋白包涵体的复性条件进行优化并对其溶血活性进行评价.方法:表达、提取并纯化重组蛋白,并对其包涵体利用PBS透析复性、16种不同复性液透析复性和柱上复性方法进行复性比较,复性蛋白用溶血试验验证其活性.结果:利用三种蛋白复性方法,重组蛋白均不同程度得到复性,其中复性液中盐酸胍、助溶剂及盐离子作用显著.柱上复性效果明显,其复性率高达98%.利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2 μg/HU.结论:成功对重组蛋白包涵体复性条件进行优化,并对复性后蛋白质的溶血活性进行鉴定,为今后的免疫学活性和变性蛋白质复性研究奠定了基础.     

重组人BMP-2生物活性的鉴定

目的鉴定在大肠杆菌中表达的重组人骨形态发生蛋白2（recombinant human bone morphogeneticprotein-2,rhBMP-2）的生物学活性。方法构建重组人BMP-2的原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白,纯化复性后,采用细胞及动物实验对其生物活性进行鉴定。结果细胞实验表明,重组人BMP-2具有诱导MC3T3-E1前成骨细胞向成骨细胞分化的特性。动物实验显示,重组人BMP-2在大鼠肌肉内具有诱导异位成骨功能。结论制备的重组人BMP-2具有较好的生物学活性。     

屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定

目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。     

人骨形成蛋白2，3成熟肽削短／突变体的表达及其诱骨活性

0　引言　骨形成蛋白 [1 ] (bone morphogenetic proteins,BMPs)是属于 TGF-β超家族的成员 ,目前已有 18个 h BMP基因被克隆 .除 BMP- 1外 ,其他 BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用 [2 - 4 ] ,因而BMPs有十分乐观的临床应用前景 .利用 E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性 [5 ,6 ] ,但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系 ,尚未见报道 .在上述工作的基础上 ,本研究在大肠杆菌中表达削…     

澳大利亚GMP与我国GMP的比较分析

目的:对澳大利亚和我国GMP管理进行对比分析和探讨.方法:借鉴澳大利亚TGA的药品质量监管经验,对GMP体系、现场检查和跟踪检查进行全面阐述,并与我国情况的比较分析.结果与结论:我国GMP管理体系存在严重缺陷,必须进行改进以适应GMP管理国际一体化的发展趋势,促进我国医药企业进入国际市场.     

青少年儿童近视成因及防控进展

众所周知,近视可由遗传、外界环境、不良用眼习惯等综合性因素导致,主要预防措施为定期进行视力筛查,并及时对症治疗,与此同时养成良好用眼习惯,保持充足睡眠,保证一定运动量及营养均衡。若判定为近视,可通过光学镜片、西药治疗及中医治疗等方式延缓度数增加,若以上方式均无效,还可通过手术方式进行矫正。目前,近视给青少年的健康及成长带来的重大影响已成为公论,故我国近视低龄化问题也越发受到社会各界的关注。针对社会人群而言,了解近视成因,对精准预防与有效控制格外重要。本文对近年来文献报道进行总结,从近视形成原因、预防、筛查及控制措施等方面进行综述。     

苦参碱和氧化苦参碱体内外模型的肝毒性比较研究

目的比较苦参碱(matrine,MT)和氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)的肝毒性,以探索其毒性严重程度和特征,并初步阐明毒性机制。方法用对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)、苦参碱和氧化苦参碱处理肝细胞,24 h后,检测IC50、肝细胞酶含量、病理形态、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,并检测凋亡率。用对乙酰氨基酚、苦参碱和氧化苦参碱处理斑马鱼,96 h后,检测LC50、肝细胞病理形态、丙二醛和谷胱甘肽含量,并检测凋亡率,同时检测氧化应激相关基因zgc:136383、凋亡相关基因EIF4EBP3和zgc:123120的表达。结果苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞有毒性作用,苦参碱IC50为5.3 mmol/L,氧化苦参碱为19mmol/L。苦参碱和氧化苦参碱处理肝细胞的谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶含量升高,肝细胞肿胀,丙二醛含量升高,谷胱甘肽含量降低,凋亡率增加(P0.05)。苦参碱和氧化苦参碱对斑马鱼有毒性作用,苦参碱的LC50为0.41 mmol/L,氧化苦参碱为3.8 mmol/L。苦参碱和氧化苦参碱处理的斑马鱼肝细胞呈现轻度至中度空泡化,丙二醛含量和凋亡率增加,谷胱甘肽含量降低(P0.05)。苦参碱下调氧化应激相关基因zgc:136383(P0.05),下调抗凋亡基因EIF4BP3,上调促基因zgc:123120(P0.05)。结论体内外模型结果一致,苦参碱和氧化苦参碱具有肝毒性,其毒性特征相似,苦参碱的毒性大于氧化苦参碱。肝毒性机制与氧化应激和细胞凋亡有关:苦参碱下调基因zgc:136383减少脂质转运,并激活氧化应激反应;苦参碱上调促凋亡基因zgc:123120,下调抗凋亡基因EIF4EBP3并诱导肝细胞凋亡。     

广州市海珠区2005～2006年托幼机构消毒监测结果分析

目的 了解广州市海珠区托幼机构消毒卫生情况,分析存在问题及提供解决办法,促进托幼机构管理水平的提高,切实保障幼儿的身心健康.方法 于2005、2006年分别选取120所、143所托幼机构参照国家GB15982-1995、GB14934-1994卫生标准和《广东省医疗机构、托幼机构消毒质量监测实施方案》对课室空气、物表、教师手、玩具以及食具消毒情况进行监测,采用spss13.0统计软件对数据进行统计分析.结果 2006年监测结果与2005年相比,除玩具消毒合格率差异有统计学意义（χ^2=5.8429,P＜0.05）、食具消毒感官合格率差异有统计学意义（χ^2=31.0794,P＜0.01）外,其余监测指标差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 托幼机构需继续加强消毒卫生工作,为幼儿的健康成长提供一个良好的环境.     

犬小肠缺血再灌注后NO和SOD的改变及免疫细胞凋亡基因的表达

目的 :研究小肠缺血再灌注后一氧化氮 (NO)和超氧化物岐化酶 (SOD)浓度的改变及Bax、c Fos和增殖性细胞核抗原 (PCNA)在小肠粘膜白细胞和淋巴细胞的表达 .方法 :阻断分布小范围细小小肠动脉 ,建立缺血再灌注模型 .分别于动脉阻断前、开放后 0 ,30及 6 0min从伴行静脉抽取血液标本 ,检测NO和SOD的浓度 .以免疫组织化学SP法研究Bax ,c Fos和PCNA在小肠粘膜固有层白细胞和淋巴细胞的表达 .结果 :与血管阻断前相比 ,NO和SOD浓度明显下降 .再灌注 0 ,30和 6 0min后NO的浓度分别是 (12 .1± 4 .6 ) ,(11.6± 4 .4 )和 (15 .5± 4 .8) ,SOD的浓度分别是 (75 .0±4 .5 ) ,(4 3.4± 11.4 ) ,(90 .3± 2 7.9)× 10 3 NU·L -1.再灌注0 ,30和 6 0min ,Bax阳性细胞率分别为 (5 4± 8) ,(80± 5 )和(70± 7) ,c Fos阳性细胞率分别为 (85± 3)、(92± 5 )和 (6 0±4 ) ,PCNA阳性细胞率分别为 (90± 5 ) ,(93± 4 )和 (5 7± 3) .结论 :小肠小范围缺血再灌注后NO和SOD浓度的下降提示氧自由基的增多 ,Bax ,c Fos和PCNA的表达改变可能在小肠粘膜固有层白细胞和淋巴细胞的免疫损伤、凋亡和其他病理改变过程中起重要作用     

社区高血压患者中医症状及证型的调查分析

目的：通过流行病学调查了解高血压患者的中医症状分布情况,在此基础上结合中医诊断学分析证型分布情况.为制定高血压病中医辨证标准和疗效评价标准提供参考.方法：采用以门诊为基础的非随机、大样本病例现场抽样调查方法,采集符合西医诊断为高血压患者的资料,经过统计分析得出症状分布情况,分析证型分布情况.结果：症状出现率在20％以上者有33分项,症状出现率在20％以下者有11分项.结论：症状出现率大于20％的症状近似认为是高血压的经典临床表现[1],其中以头面、心胸部及精神症状为主.     

卡介苗多糖核酸和舒利迭在稳定期COPD中的应用研究

目的:探讨卡介苗多糖核酸和沙美特罗/氟替卡松(舒利迭)对慢性阻塞性肺疾病(chro-nic obstructive pulmonary disease,COPD)稳定期患者免疫功能和肺通气功能的影响。方法:将60例稳定期COPD患者随机分为观察组和对照组各30例,对照组给予氨茶碱、异丙托溴铵等治疗,观察组给予沙美特罗/氟替卡松和卡介苗多糖核酸,随访3个月,比较两组患者的血清IgA、IgG、IgM、CD3+、CD4+和CD8+水平,以及肺功能改善情况。结果:与对照组比较,观察组患者血清IgA和CD4+水平明显升高,CD8+水平明显降低,肺功能明显改善,差异有显著性(P<0.05)。结论:卡介苗多糖核酸和沙美特罗/氟替卡松可以改善稳定期COPD患者的机体免疫功能和肺通气,值得临床推广应用。     

Gli1与FoxM1在子宫颈癌组织和细胞中的表达及意义

目的:了解宫颈癌组织和细胞中Gli1及FoxM1的表达及意义,并探究这二者的相关性,进而明确FoxM1是否为Gli1在Hh信号通路中的下游靶基因,从而为宫颈癌的分子靶向治疗提供依据。方法:通过免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测70例宫颈癌组织和10例正常宫颈组织中Gli1及FoxM1的表达;体外培养宫颈癌细胞系Hela、Siha,将两株细胞分别分为5组,分别下调和上调Gli1基因的表达后,应用逆转录(RT)-PCR法检测各组细胞中Gli1及FoxM1的mRNA表达量,并分析二者的相关性。结果:Gli1和FoxM1蛋白表达水平在宫颈癌组织中明显高于正常宫颈组织(P<0.05)。Gli1的表达在分化程度低的宫颈癌组织中较高(P=0.022),与宫颈癌的侵袭程度有关(P=0.005),在有淋巴结转移中更高(P=0.017);FoxM1的表达与宫颈癌的侵袭程度有关(P=0.011),与年龄相关(P=0.033)。Spearman秩相关检验提示,Gli1与FoxM1相关系数r=0.405(P<0.001),呈显著正相关;分别下调Hela细胞和Siha细胞中Gli1表达后,两细胞系中FoxM1mRNA表达量均明显降低,均呈现正显著相关(r=0.613,r=0.729,P<0.05);分别将Gli1过表达质粒导入Hela细胞和Siha细胞中,两细胞系中FoxM1mRNA表达量均明显增高,均呈现正显著相关(r=0.593,r=0.660,P<0.05)。结论:Gli1和FoxM1在宫颈癌组织中均高表达,且Gli1可调控宫颈癌细胞系Hela、Siha中FoxM1的表达,进而促进宫颈癌的发生发展。     

多巴胺受体在大鼠胃和十二指肠的定位及表达

目的 通过定量原位杂交技术，检测胃十二指肠中是否存在多巴胺受体，以及多巴胺５个亚型受体的定位和表达情况。方法 参照文献选定核苷酸序列，制备寡核苷酸探针，并以末端脱氧核苷转移酶末端标记＾３５Ｓ，然后与新鲜冰冻组织胺Ｙｏｕｎｇ方法行原位杂交、曝光、显影。银粒密度由电子图象分析系统计并行统计学处理。结果 多巴胺５亚型受体均存在于胃肠道，但表达水平高代不一；多巴胺受体分布于胃的粘膜固有层，沿粘膜层分布，而