过表达整合蛋白α5β1的SMMC7721细胞株的建立和鉴定

目的 构建过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株。方法 应用分子克隆技术和基因转染建立过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株，应用ＲＴ－ＰＣＲ及汉式细胞术鉴定ＳＭＭＣ７７２１－细胞表达整合蛋白α５β１，６－７７２１细胞。结论、整事蛋白α５β１基因转染后，ＳＭＭＣ７７２１细胞整合蛋白α５β１的ＲＮＡ及蛋白质表达明显提高。过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株的建立有助于研究整     

褪黑素对人肝癌SMMC—7721细胞的抑制作用

观察褪黑素对人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞生长抑制作用及其作用机理。方法采用不同浓度的褪黑素通过体外细胞培养、ＭＴＴ显色技术研究其抑制作用,以流式细胞仪和电子显微镜技术观察其作用机理。结果褪黑色素对人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞具有抑制作用,其ＩＣ３０、ＩＣ５０分别为１．１０和２．００ｍｍｏｌ／Ｌ。以ＩＣ３０的褪黑素处理ＳＭＭＣ－７７２１细胞,使其倍增时间由２１．１ｈ延长到３８．４ｈ。流式细胞仪观察到     

乙酰咪唑修饰对高密度脂蛋白结合人肝癌SMMC—7721细胞的影响

利用Ｎ－乙酰咪唑修饰高密度脂蛋白－３（ＨＤＬ３）研究其对ＨＤＬ３结合肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞能力的影响。结果：ＨＤＬ３乙酰咪唑修饰降低其竞争结合作用。这一抑制作用取决于乙酰咪唑浓度，在１ｍｏｌ／Ｌ时达最大抑制。结果提示ＨＤＬ３中酪氨酸残基存在于ＨＤＬ３结人合确认部位，参与ＨＤＬ３的受体结合过程。     

奥沙利铂对人肝癌细胞株SMMC7721的体外抗肿瘤作用

目的研究奥沙利铂对人肝癌细胞株SMMC7721生长抑制及诱导凋亡的作用并探讨其机制。方法以不同浓度的奥沙利铂作用于SMMC7721细胞,应用MTT法检测奥沙利铂对SMMC7721细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态学变化;采用分光光度法检测caspase-3、cas-pase-8、caspase-9的活性。结果奥沙利铂可抑制SMMC7721细胞的生长并具有时间和剂量依赖性,Hoechst33258荧光染色可见典型的细胞凋亡特征,流式细胞仪检测到细胞阻滞于S期和SubG1峰。经过奥沙利铂诱导,caspase-3、caspase-9活性被上调,较对照组明显升高（P〈0.05）,caspase-8活性未见明显改变（P〉0.05）。结论奥沙利铂具有抑制肝癌细胞株SMMC7721增殖及诱导凋亡作用,此作用可能通过激活内源性凋亡途径实现。     

RN181过表达影响SMMC7721肝癌细胞凋亡的初步研究

目的构建过表达RN181基因的SMMC7721重组细胞株,研究RN181对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响,并初步探讨其凋亡机制。方法构建高表达RN181逆转录病毒感染SMMC7721细胞,显微镜观察其细胞株荧光强弱,Western blot鉴定RN181蛋白表达水平;采用DAPI染色法、Western blot检测RN181对顺铂诱导SMMC7721细胞株凋亡的变化情况。结果重组细胞株荧光表达良好,7721RN181细胞中RN181蛋白表达量高于其对照,差异有统计学意义(P0.05)。DAPI染色法观察到在顺铂作用下,7721RN181的细胞凋亡阳性率高于其对照,差异有统计学意义(P0.05);Western blot检测到7721RN181的activated caspase-3、cleaved PARP的表达量高于对照组,procaspase-6,pro-caspase-8的表达量低于对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 RN181表达能促进肝癌细胞的凋亡,其可能通过参与死亡受体凋亡途径来促进肝癌细胞凋亡。进而推测RN181基因可能成为肝癌靶向治疗的一个新靶点。     

多西紫杉醇对缺氧人肝癌细胞株SMMC7721化疗药物的敏感性及其作用机制

目的研究多西紫杉醇缺氧对人肝癌细胞株SMMC7721的化疗药物的敏感性及其作用机制。方法多西紫杉醇加入化疗药物干预过的人肝癌细胞株SMMC7721中,培养2 d后,MTT法检测SMMC7721中多西紫杉醇对人肝癌细胞株SMMC7721化疗药物的敏感性,流式细胞仪检测人肝癌细胞株SMMC7721凋亡情况,应用RT-PCR和Western-blot检测人肝癌细胞株SMMC7721中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA和蛋白水平的表达变化。结果缺氧对多西紫杉醇对化疗药物具有协同增效作用,200μmol/L多西紫杉醇增敏指数为2.58。多西紫杉醇诱导的人肝癌细胞株SMMC7721凋亡增加,且表现明显的浓度依赖效应。此外随着多西紫杉醇用药剂量增加,能显著降低HIF-1α的表达。200μmol/L多西紫杉醇组与对照组基因表达比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论缺氧对多西紫杉醇可以通过某种机制下调核转录因子HIF-1α表达,提高缺氧环境中人肝癌细胞株SMMC7721对化疗药物的敏感性。     

白英提取物诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡过程中bax和bcl-2基因表达

目的探讨中药白英提取物对肝癌SMMC7721细胞中细胞凋亡相关基因的影响。方法用不同浓度的白英提取物处理肝癌SMMC7721细胞,利用TUNEL法检测其细胞凋亡;通过原位杂交法、免疫组化法,研究白英提取物诱导肝癌SMMC7721细胞产生凋亡时,凋亡促进基因bax和凋亡抑制基因bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果 IPP图像分析表明,bax表达显著增高,bcl-2显著下降。结论白英提取物通过调节细胞凋亡促进基因和抑制基因,从而诱导肝癌SMMC7721细胞产生凋亡。     

bcl-2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性的影响作用

目的 观察bcl-2核酶对SMMC-7721细胞的作用,探讨bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响。方法 经脂质体介导的方法将PMTr-neo（下向bcl-2核酶真核表达载体）导入SMMC7721细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用TUNEL,TRAP-PCR-ELISA,免疫组化技术结合图像分析技术检测SMMC7721/PMTr-neo细胞凋亡=细胞端粒酶活性及P16,P12的改变。结果 较对照组SMMC7721/PMTr-neo细胞Bcl-2表达水平显著下降,伴有显著细胞凋亡现象;同时端粒酶活性下降,P16,P21表达水平显著增加。结论 bcl-2核酶可促进SMMC7721细胞发生凋亡,并降低细胞端粒酶活性,提示Bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性有一定的影响。     

过表达中期因子增强SMMC 7721细胞对5-Fu耐药及可能机制研究

目的探讨过表达中期因子(MK)增强SMMC 7721细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药及其可能的机制。方法将SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒过表达,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(WB)检测MK mRNA和蛋白的表达。5-Fu处理后,采用MTT法检测SMMC 7721细胞对5-Fu的耐药。采用WB法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和NF-κB及Bcl-2、survivin、caspase-3的表达。结果将SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒过表达后,MK mRNA和蛋白的表达增加,ConC组细胞对5-Fu的IC50显著高于Con-A组、Con-B组[(27.36±4.31)mg/L vs (4.57±0.34)mg/L,(4.96±0.46)mg/L],差异具有统计学意义(P0.05)。此外,与Con-A组、Con-B组比较,Con-C组细胞p-PI3K(0.66±0.04 vs 0.35±0.03,0.57±0.03)、p-Akt (0.31±0.02 vs 0.17±0.02、0.25±0.02)、NF-κB (0.63±0.05 vs 0.27±0.02,0.53±0.04)、Bcl-2(0.42±0.04 vs 0.13±0.01, 0.38±0.04)、survivin(0.58±0.04 vs 0.18±0.02,0.51±0.04)呈现高表达,caspase-3(0.41±0.04vs 0.88±0.06,0.43±0.03)呈现低表达(P0.05)。结论过表达MK可增强SMMC 7721细胞对5-Fu耐药,其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。     

siRNA介导的新趋化因子VCC-1沉默对人SMMC7721肝癌细胞生长的影响

 目的 探讨siRNA靶向抑制VCC-1表达对人肝癌细胞株SMMC27721生长的影响。方法 采用脂质体法将siRNA质粒导入SMMC7721细胞,建立VEGF相关的趋化因子1（(VEGF correlated chemokine 1,VCC-1）)VCC-1基因表达沉默的肝癌细胞系,用Western blot检测细胞中VCC-1的表达水平,用MTT法、软琼脂克隆形成实验等研究siRNA靶向抑制VCC-1表达对SMMC7721细胞生长的影响。结果 Western blot 结果显示RNA干扰组（shVCC1-1组）细胞VCC-1蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.01）; ,MTT法结果显示shVCC1-1组细胞增殖速度、克隆形成率均低于对照组（P<0.05）。结论 siRNA靶向抑制 VCC-1表达可以抑制人SMMC7721肝癌细胞增殖能力及克隆形成能力。     

腺病毒介导PSMA3基因过表达对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡及其荷瘤生长的影响

目的：构建蛋白酶体亚基α3（proteasome subunit alpha type 3,PSMA3）基因腺病毒重组载体,并观测腺病毒介导PSMA3基因过表达对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡及其荷瘤生长的影响。方法：RT-PCR法扩增PSMA3基因全长CDs序列后,克隆入pTG19-T载体,再亚克隆入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中,构建重组pAdTrack/PSMA3腺病毒载体,随后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组形成pAd/PSMA3重组腺病毒,经包装及滴度测定,获高感染力的pAd/PSMA3病毒。用pAd/PSMA3病毒感染人肝癌SMMC7721细胞,荧光显微镜观测被感染的SMMC7721细胞的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的变化情况。Cell counting kit-8（CCK-8）法检测pAd/PSMA3病毒对SMMC7721细胞增殖的影响。Real-time PCR和Western blot分别检测被感染的SMMC7721细胞的PSMA3基因、增殖细胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、Caspase-3促凋亡基因及其编码蛋白的表达情况。流式细胞仪（FCM）检测被感染的SMMC7721的周期、凋亡变化。将经pAd/PSMA3病毒感染的SMMC7721细胞移植裸鼠皮下以生成荷瘤,逐日观察荷瘤的生长情况。所有实验以空病毒感染及未感染的细胞做对照。结果：克隆到768 bp的PSMA3基因,并构建了其具高感染力的pAd/PSMA3重组病毒。CCK-8法结果表明,过表达PSMA3基因的SMMC7721细胞,其增殖明显减慢（P<0.05）。Real-time PCR、Western blot检测显示,pAd/PSMA3重组病毒可介导SMMC7721细胞过表达PSMA3基因,上调其Caspase-3基因及其编码蛋白的表达,并下调其PCNA 基因及其蛋白的表达（P<0.05）。FCM检测证实,过表达PSMA3基因的细胞可被阻滞于G1期（细胞周期）,并可促使其凋亡,其凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）。动物实验证实,pAd/PSMA3病毒可明显抑制裸鼠荷瘤的生长（P<0.01）。结论：重组病毒pAd/PSMA3可将SMMC7721细胞阻滞于G1期（细胞周期）,抑制其增殖,促使其凋亡,并可抑制其裸鼠荷瘤的生长,这些可能和下调其增殖相关PCNA蛋白,上调其凋亡相关caspase-3蛋白的表达密切相关。     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

乙酰咪唑修饰对高密度脂蛋白结合人肝癌SMMC－7721细胞的影响

利用Ｎ－乙酰咪唑修饰高密度脂蛋白－３（ＨＤＬ３）研究其对ＲＤＬ３结合肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞能力的影响。结果：ＨＤＬ３乙酰咪唑修饰降低其竞争结合作用。这一抑制作用取决于乙酰咪唑浓度，在１ｍｏｌ／Ｌ时达最大抑制。结果提示ＨＤＬ３中酪氨酸残基存在于ＨＤＬ３结合确认部位，参与ＨＤＬ３的受体结合过程。     

失巢凋亡过程中整合蛋白α5β1过表达对人肝癌细胞Survivin表达的影响

目的：探讨整合蛋白α5β1过表达引起肝癌细胞凋亡的机理。方法：利用poly—hema使细胞非贴壁生长12h、18h、24h，诱导失巢凋亡。通过Westerm迹法检测Survivin表达量。结果：随着poly—hema诱导时间的增加，α5β1—7721和β1—7721细胞凋亡和死亡率也随之增加，而Survivin表达量则减少，β1—7721细胞的减少程度显著大于α5β1—7721，在18h时减少了55％。结论：Survivin在β1—7721细胞的凋亡过程中所起的作用大于α5β1—7721细胞。     

稳定表达肌肉型乙酰胆碱受体的细胞株建立和鉴定

目的:建立稳定表达骨骼肌细胞乙酰胆碱受体(AChR)的人胚肾(HEK293)细胞系,进行各种药理学研究.方法:将编码小鼠m-nAChR的α、β、γ、δ和ε亚基的cDNA分别重组于真核细胞表达质粒pcDNA3.1,用脂质体转染技术将重组质粒导入HEK293细胞,使其细胞膜上分别表达胚胎型乙酰胆碱受体(γ-nAChR)和成年型乙酰胆碱受体(ε-nAChR).用G418和免疫荧光技术筛选出稳定表达两种受体亚型的细胞株. 结果:在G418反复筛选后的HEK293细胞系中,有14株明显表达ε-nAchR;4株明显表达γ-nAchR,受体大部分表达于细胞膜上. 结论:用重组后的pcDNA3.1转染HEK293细胞,经筛选后可以稳定表达m-nAChR.     

过表达ERCC1蛋白细胞系的建立

[目的]建立过表达ERCC1蛋白的细胞系，为遗传毒性化合物的研究提供模型细胞系，并有可能为具有DNA加合作用化合物提供新的毒理学筛选方法。[方法]应用PCR和DNA重组技术将核苷酸切除修复交叉互补组1(Excision repair cross complementation groupl，ERCCl)基因与pT7Blue载体相连接，然后构建真核细胞重组表达质粒pcDNA3．1／Zeo( )-ERCC1，并导入293细胞。经Zeocin抗性筛选后获得转染ERCC1基因的细胞克隆。细胞增殖后以Western-blot检测目的蛋白的表达。[结果]获得稳定转染ERCC1基因的细胞系，并在细胞中检测出有ERCC1蛋白的过表达．[结论]用基因转染法成功建立了过袁达ERCC1蛋白的ERCC1-293细胞系。     

STAT3基因在人肝癌细胞株HepG2、Bel7402、SMMC7721和肝癌组织中的表达及意义

目的：探讨STAT3基因异常活化在人原发性肝癌发生、发展中的作用及可能的机制。方法：应用免疫组化染色法、RT-PCR和Western blotting法检测人肝癌细胞株HepG2、Bel7402、SMMC7721和肝癌组织中STAT3基因的mRNA和蛋白水平表达。 结果：肝癌细胞株SMMC7721、Bel7402和HepG2中均有STAT3基因的高表达,3种肝癌细胞间表达量比较差异无显著性（P>0.05）。原发性肝癌组织和癌旁组织中均有STAT3的mRNA及蛋白水平的高表达,与正常肝组织比较差异有显著性（P<0.05）,而肝癌组织与癌旁组织比较差异无显著性（P>0.05）。肝癌组织中VEGF、survivin和c-myc 的mRNA表达上调,p53的mRNA表达下调。结论：STAT3
的异常活化可能发生在癌变的早期,在肝癌的形成和发展中可能起重要的促进作用。     

整合蛋白α5、β1亚基在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

目的 探讨整合蛋白α5、β1亚基在肾透明细胞癌中的表达与癌细胞的病理分级和临床分期的关系。方法 采用免疫组织化学ABC法检测30例正常肾脏组织和30例肾透明细胞癌石蜡标本整合蛋白α5、β1亚基的表达水平,结果 肾透明细胞癌组织与正常肾脏组织相比,癌组织整合蛋白α5、β1亚基表达减弱或消失（P〈0.05）。整合蛋白α5、β1亚基表达水平随肾透明细胞癌的病理分级（分化程度）升高而升高,随临床TMN分期的升高而降低。结论 在正常肾脏组织中整合蛋白α5、β1亚基的表达比肾透明细胞癌中高,其表达水平与肾透明细胞癌的病理分级呈正相关关系,与临床分期呈负相关关系。整合蛋白α5、β1亚基的表达可能与肾透明细胞癌的分化、转移密切相关,     

稳定表达外源性p16基因肝癌SMMC-7721细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达外源性p16基因的肝癌SMMC-7721细胞株。方法利用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3．1( ),将外源性p16基因转染入此基因表达下调的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中,经G418筛选,建立稳定表达的细胞株,用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫组织化学法鉴定p16基因的表达,同时对细胞株分泌蛋白进行活性检测。结果转染p16基因的SMMC-7721细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达。结论建立稳定表达P16抑癌蛋白的SMMC-7721细胞株有助于研究p16抑癌基因在肝癌发生中的作用。