聚乳酸/聚羟乙酸共聚物和Pluronic-F127凝胶为支架复合软骨细胞构建组织工程骨软骨复合组织的界面相容行

背景:目前关节软骨的损伤修复研究倾向于构建组织工程骨与软骨复合物,旨在修复软骨下骨缺损的同时,使移植体在缺损区的整合固定界面由软骨-骨变为骨-骨界面,从而加快界面的愈合.目的:以三维多孔聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poiy(laetide-co-glyco-lide),PLGA)、Pluronic-F127水凝胶分别作为骨和软骨支架材料,验证两者作为组织工程支架联合应用于构建组织工程骨软骨组织的可行性.设计、时间及地点:开放性实验,2006-07/2007-04于中山大学附属第二医院医学研究中心完成细胞培养,于中山大学北校区实验动物中心完成动物实验.材料:将培养的新西兰大白兔关节软骨细胞和胫骨骨膜的成骨细胞分别与Pluronic-F127凝胶及PLGA混合形成复合物后,在骨细胞复合物的表面涂布负载软骨细胞的Pluronic F-127水凝胶制备组织工程骨软骨复合物.方法:裸鼠20只切开背部皮肤及皮下组织,切口左侧植入组织工程骨软骨复合物1枚,切口右侧植入单纯PLGA支架和单纯Pluronic-F127凝胶各1枚为对照.主要观察指标:植入后2个月取材,进行大体形态学及组织学观察骨组织及软骨组织形成情况,Ⅱ型胶原免疫组化观察软骨细胞Ⅱ型胶原表达能力.结果:术后2个月形成有弹性骨软骨复合物,在暗红色的部分,新形成的骨组织连接成片块状或条索状,PLGA已完全降解,在白色的部位,已形成较成熟的软骨组织,形态基本正常,分布较均匀,Pluronic-F127已完全吸收:软骨组织与骨组织的交界面处二者结合良好,部分区域可见软骨部分嵌入于骨组织中.实验组软骨组织Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性.结论:Phironic-F127和PLGA'作为骨和软骨支架材料,可以形成具有良好界面结合的骨软骨组织.     

聚乳酸/聚羟乙酸共聚物和Pluronic-F127凝胶为支架复合软骨细胞构建组织工程骨软骨复合组织的界面相容性

背景：目前关节软骨的损伤修复研究倾向于构建组织工程骨与软骨复合物,旨在修复软骨下骨缺损的同时,使移植体在缺损区的整合固定界面由软骨-骨变为骨-骨界面,从而加快界面的愈合。目的：以三维多孔聚乳酸/聚羟乙酸共聚物（poly（lactide-co-glyco-lide）,PLGA）、Pluronic-F127水凝胶分别作为骨和软骨支架材料,验证两者作为组织工程支架联合应用于构建组织工程骨软骨组织的可行性。设计、时间及地点：开放性实验,2006-07/2007-04于中山大学附属第二医院医学研究中心完成细胞培养,于中山大学北校区实验动物中心完成动物实验。材料：将培养的新西兰大白兔关节软骨细胞和胫骨骨膜的成骨细胞分别与Pluronic-F127凝胶及PLGA混合形成复合物后,在骨细胞复合物的表面涂布负载软骨细胞的PluronicF-127水凝胶制备组织工程骨软骨复合物。方法：裸鼠20只切开背部皮肤及皮下组织,切口左侧植入组织工程骨软骨复合物1枚,切口右侧植入单纯PLGA支架和单纯Pluronic-F127凝胶各1枚为对照。主要观察指标：植入后2个月取材,进行大体形态学及组织学观察骨组织及软骨组织形成情况,II型胶原免疫组化观察软骨细胞Ⅱ型胶原表达能力。结果：术后2个月形成有弹性骨软骨复合物,在暗红色的部分,新形成的骨组织连接成片块状或条索状,PLGA已完全降解,在白色的部位,已形成较成熟的软骨组织,形态基本正常,分布较均匀,Pluronic-F127已完全吸收;软骨组织与骨组织的交界面处二者结合良好,部分区域可见软骨部分嵌入于骨组织中。实验组软骨组织II型胶原免疫组化染色呈阳性。结论：Pluronic-F127和PLGA作为骨和软骨支架材料,可以形成具有良好界面结合的骨软骨组织。     

AdLacZ基因修饰山羊耳软骨细胞复合F127构建组织工程化软骨

目的:应用AdLacZ基因修饰体外培养的山羊耳软骨细胞,并与Pluronic F127支架材料复合,观察裸鼠皮下软骨形成的情况,为进一步应用软骨分化因子基因修饰重建软骨的研究提供参数。方法:实验于2004-11/2006-12在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。①实验材料:取健康雄性山羊,体质量26～30kg。6周龄BALB/c裸鼠24只,体质量20g。体外培养山羊耳软骨细胞,转染AdLacZ基因,检测基因转染效率。②实验方法:将基因修饰的细胞与可吸收生物材料PluronicF127混合形成细胞-生物材料复合物,并注射到6只裸鼠皮下,每只在其背部皮下分别接种2个点,分别在术后2,4周取材,每个时间点有标本6例。另取裸鼠18只,同样设计,分别以未转基因的软骨细胞-材料复合物、单独注射的软骨细胞、或单独注射的F127支架作为对照组,每组6只。③实验评估:标本行苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色,并对4周标本行X-gal染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:纳入BALB/c裸鼠24只,均进入结果分析。①50pfu/细胞可以获得80%的转染效率。②2周时细胞-材料复合物形成了不成熟的软骨样组织,苏木精-伊红染色显示外周呈纤维样组织包裹,中部大部分为不成熟的软骨细胞;4周实验组中央部位出现少量稍成熟的软骨,阿利新蓝染色显示该部位为深蓝色的巢状软骨,部分细胞有Ⅱ型胶原阳性表达。冰冻切片X-gal染色提示细胞来自于植入的软骨-材料复合物。对照组未转基因的软骨细胞-材料复合物,其组织学及Ⅱ型胶原免疫组织化学表现与实验组没有明显差别,而X-gal染色为阴性。单独注射软骨细胞或单独注射F127支架,在4周内则均未见到软骨形成。结论:腺病毒载体可向软骨细胞高效转移目的基因,F127支架材料是软骨再生较为理想的支架材料。     

胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景:软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复.目的:观察胰岛素样生长因子1 与转化生长因子β2 联合应用对组织工程软骨形成的影响.方法:用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×109 L-1 的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200 μg/L 胰岛素样生长因子1 和(或)1 μg/L 转化生长因子β2 进行立体培养.于培养的第3,5,7,9,1,13 天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况.培养2 周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色(AB-PAS)及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.结果与结论:细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1 和转化生长因子β2 均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1 的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2 的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用.     

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用,为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法:利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的真核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组),RT-PCR、Northern-Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF-β1调节体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原表达的变化。结果:TGF-β1基因转染软骨细胞后,其Ⅱ型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且随着TGF-β1蛋白表达的丧失,其对软骨细胞Ⅱ型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论:TGF-β1可以上调体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原的表达。     

软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞微团培养成软骨

背景：滑膜间充质干细胞在体外具有多向分化的能力,有望成为软骨组织工程中治疗软骨缺损的种子细胞,在其向软骨细胞分化过程中,合适的生长因子起了重要作用。 目的：利用富含生长因子的软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化,并对其鉴定。 方法：采用消化法分别获得 SD 大鼠滑膜间充质干细胞、软骨细胞。收集软骨细胞上清液离心、过滤冻存备用。培养滑膜间充质干细胞至第3代后离心成微团,并用软骨细胞上清液进行成软骨诱导分化,通过形态学观察、免疫组织化学法、RT-PCR检测进行鉴定。 结果与结论：滑膜间充质干细胞使用软骨细胞上清液成软骨诱导21 d后,微团可见似软骨样组织。免疫组化法进行Ⅱ型胶原鉴定,基质能被Ⅱ型胶原染色,细胞染色呈现棕黄色。RT-PCR 结果显示诱导后的微团表达软骨特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。证实软骨细胞分泌的可溶性因子可以诱导大鼠滑膜间充质干细胞向软骨方向分化。     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.     

转基因同种异体组织工程软骨修复兔膝关节全层缺损

目的:观察转人胰岛素样生长因子I基因同种异体组织工程软骨对兔膝关节软骨全层缺损的修复作用。方法:实验于2004-08/2005-08在军事兽医研究所病毒室及长春生物制品研究所实验室完成。①取出生28d新西兰白兔的关节软骨,采用机械分离及Ⅱ型胶原酶消化法获得分离的兔软骨细胞,用单层培养扩增。②用脂质体法使胰岛素样生长因子I基因转染兔关节软骨细胞。③以经过转染的兔关节软骨细胞作为种子细胞,牛Ⅰ型胶原作为支架,体外构建转基因同种异体组织工程软骨。④5个月龄的新西兰白兔80只制备关节软骨缺损模型,分别移植入不同组别的移植物:空白对照组、单纯支架组、单纯软骨细胞附和支架组、经过转染的软骨细胞附和支架组、自体软骨移植组,分别于术后4,8,16,24周处死各组动物4只取材,观察兔膝关节软骨全层缺损的修复情况。结果:①G418培养液筛选结果:通过G418对于兔关节软骨细胞的最小致死剂量的测定得出,G418对软骨细胞的最小致死剂量为0.4g/L。转染后软骨细胞经0.4g/LG418筛选,2周后得到抗G418的阳性细胞克隆,而未转染细胞在含G418的培养液中逐渐全部死亡,初步证明人胰岛素样生长因子I基因的转染成功。②原位杂交检测结果:转染软骨细胞胞浆中有氯化镍紫蓝色颗粒阳性杂交信号说明有人胰岛素样生长因子ImRNA的表达;未转染细胞则未见阳性信号。③免疫组织化学检测结果:在转染的软骨细胞胞浆中有棕黄色颗粒样阳性信号,说明有Ⅱ型胶原蛋白表达,证明稳定表达人胰岛素样生长因子I的转染软骨细胞保持Ⅱ型胶原的表达。④软骨缺损修复后的组织学评价结果:在试验所观察的24周内,软骨基本稳定,而且转胰岛素样生长因子I基因组织工程软骨显示出强烈的软骨基质分泌能力。转胰岛素样生长因子I基因的同种异体组织工程软骨对软骨缺损的修复效果明显优于空白对照组和单纯软骨细胞附和支架组犤空白对照组、单纯支架组、单纯软骨细胞附和支架组、经过转染的软骨细胞附和支架组、自体软骨移植组修复软骨的组织学评分:术后4周为(12.00±0.79),(11.00±0.81),(8.10±0.90),(5.80±1.03),(5.20±0.46)分;术后8周为(10.20±0.96),(10.10±1.19),(7.10±1.34),(4.90±1.15),(4.00±0.58)分;术后16周为(8.00±1.24),(8.50±1.79),(5.20±1.88),(4.00±1.82),(2.00±1.96)分;术后24周为(7.00±0.90),(6.50±2.13),(4.30±2.00),(3.00±2.13),(1.20±0.78)分,P<0.05犦。结论:人胰岛素样生长因子I基因转染兔关节软骨细胞后可以在细胞中表达,而且转胰岛素样生长因子I基因的同种异体组织工程软骨对兔关节软骨全层缺损的修复效果明显。为进一步转基因组织工程软骨实验提供了依据。     

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的：研究转化生长因子β(TGF—β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用，为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法：利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的其核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组)，RT—PCR、Nonhem—Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF—β1调节体外培养软骨细胞II型胶原表达的变化。结果：TGF-β1基因转染软骨细胞后，其II型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强，且随着TGF—β1蛋白表达的丧失，其对软骨细胞II型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论：TGF—β1可以上调体外培养软骨细胞II型胶原的表达。     

胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景：软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复。目的：观察胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2联合应用对组织工程软骨形成的影响。方法：用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×109L-1的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200μg/L胰岛素样生长因子1和（或）1μg/L转化生长因子β2进行立体培养。于培养的第3,5,7,9,11,13天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况。培养2周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色（AB-PAS）及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。结果与结论：细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1和转化生长因子β2均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用。     

转腺病毒-人骨形态发生蛋白7软骨细胞分泌的透明质酸和Ⅱ型胶原

背景:软骨细胞自身分裂能力不强和去分化现象限制了其在组织工程中的应用。目的:观察腺病毒-骨形态发生蛋白7转染兔软骨细胞后骨形态发生蛋白7的表达及其对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸功能的影响。方法:包装骨形态发生蛋白7腺病毒载体,将其转染至兔第2代软骨细胞。检测骨形态发生蛋白7mRNA及蛋白的表达;检测软骨细胞中Ⅱ型胶原和透明质酸的变化。结果与结论:转染腺病毒-骨形态发生蛋白7后48,72h,RT-PCR和Western blot方法显示软骨细胞表达的骨形态发生蛋白7mRNA和蛋白均明显增加,RT-PCR和ELISA显示软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原和透明质酸也显著增加。说明应用腺病毒可成功将骨形态发生蛋白7转染至兔软骨细胞,并能促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸。     

转腺病毒-人骨形态发生蛋白7软骨细胞分泌的透明质酸和Ⅱ型胶原

背景：软骨细胞自身分裂能力不强和去分化现象限制了其在组织工程中的应用。目的：观察腺病毒-骨形态发生蛋白7转染兔软骨细胞后骨形态发生蛋白7的表达及其对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸功能的影响。方法：包装骨形态发生蛋白7腺病毒载体,将其转染至兔第2代软骨细胞。检测骨形态发生蛋白7mRNA及蛋白的表达;检测软骨细胞中Ⅱ型胶原和透明质酸的变化。结果与结论：转染腺病毒-骨形态发生蛋白7后48,72h,RT-PCR和Western blot方法显示软骨细胞表达的骨形态发生蛋白7mRNA和蛋白均明显增加,RT-PCR和ELISA显示软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原和透明质酸也显著增加。说明应用腺病毒可成功将骨形态发生蛋白7转染至兔软骨细胞,并能促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸。     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型的分化

背景：内源性诱导软骨分为就是通过一定的载体将目的基因整合入干细胞内,使其自行分泌诱导因子诱导自身进行分化。目的：观察将转化生长因子β3通过腺相关病毒载体转染诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨表型转化的能力。方法：取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行重组腺相关病毒转染,将转染后3,6,9,12d细胞裂解提取蛋白进行酶联免疫检测目的蛋白转化生长因子β3的体外表达。RT-PCR,免疫印迹westernblot分别从基因和蛋白水平上检测1,2周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测1,2周蛋白多糖的表达。结果与结论：重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白转化生长因子β3,并且转染成功的骨髓间充质干细胞较阴性对照组能够更好的向软骨表型转化。证实转化生长因子β3可以腺相关病毒为载体转染骨髓间充质干细胞并诱导其向软骨表型分化。     

诱导转化人关节软骨细胞Ⅱ型胶原表型的有效方式

背景诱导去分化软骨细胞重新表达Ⅱ型胶原主要基于软琼脂悬浮培养法.目的用离心管聚集体培养(aggregate culture)诱导去分化转化人关节细胞的Ⅱ型胶原.设计非随机非对照实验研究.地点和对象实验在第三军医大学西南医院骨科完成,对象为转化人关节软骨细胞,美国Hyclone公司产品.干预将体外长期培养的第30,40,50代去分化转化软骨细胞消化后进行离心管培养,比较细胞在单层培养、离心管聚集体培养,以及在普通培养基,BAI诱导培养基下[2型骨形态发生蛋白(BMP-2)+抗坏血酸盐+胰岛素],Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型胶原的表达和胞外基质产生情况.主要观察指标Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型胶原的免疫组化染色,Ⅱ型胶原的m RNA表达.结果在单层培养条件下,去分化转化软骨细胞只表达Ⅰ型胶原,而在BAI诱导培养基及离心管聚集体培养下该转化软骨细胞表达丰富的Ⅱ型胶原和大量胞外基质.结论离心管聚集体培养和BAI诱导培养基是诱导去分化转化软骨细胞Ⅱ型胶原的有效方式.     

生长激素对大鼠胫骨生长板软骨细胞胶原Ⅱ表达的影响

目的探讨生长激素（growth hormone,GH）对离体培养的大鼠胫骨生长板的软骨细胞Ⅱ型胶原（collagenⅡ,colⅡ）表达的影响。方法采用两步酶消化法分离培养5～8只三周龄大鼠生长板的软骨细胞,用RT—PCR和免疫组化的方法分别检测不同浓度GH对软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达。结果GH能促进软骨细胞ColⅡ的表达并呈浓度依赖性,GH在10～500ng/ml之间能促进ColⅡ的表达,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）,并且以100ng／ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000ng／ml与对照组比较无差异（P〉0．05）。结论GH通过促进软骨细胞ColⅡ的表达能维持软骨细胞的表型,GH在使用过程中不会导致骨龄的增加。     

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用.目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+),生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成.材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.生长分化因子5真核表达质粒pCDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备.方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染.设立3组:转染组采用Lipofectamine<'TM>2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染窄质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同.主要观察指标:转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果:转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色.转染组町检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色.阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色.结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化.     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果.目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果.设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成.对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取.方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9.分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM.②转染窄载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体.③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体.④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体.⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合.主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达.结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<0.01).反转录-聚合酶链反应和Westem blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多:软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多.结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9.     

胰岛素样生长因子Ⅰ与转化生长因子β2对兔软骨细胞立体三维培养的作用

目的 检测胰岛素样生长因子Ⅰ （IGF-Ⅰ）、转化生长因子β2 （TGF-β2）单独及联合应用对立体培养软骨细胞增殖速度、细胞形态和表型、黏多糖含量及Ⅱ型胶原含量的影响.方法 取兔第二代软骨细胞于藻酸钙凝珠中,分别加入IGF-Ⅰ、TGF-β2及IGF-Ⅰ＋TGF F-β2进行立体培养.HE、甲苯胺蓝染色测软骨细胞形态、胞外基质变化;阿尔新蓝法测黏多糖;免疫组化法测Ⅱ型胶原及表型;Woessner法测Ⅱ型胶原含量.结果 细胞形态及表型的维持、增殖速度、黏多糖及Ⅱ型胶原含量,IGF-Ⅰ＋TGF-β2组明显优于其他组,各组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 IGF-Ⅰ与TGF-β2联合应用起协同作用,能够显著促进黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,促进软骨细胞外基质分泌及软骨细胞形态及表型的维持.     

自组装短肽水凝胶体外三维培养兔关节软骨细胞

背景:自组装短肽是人工设计合成的一类新型纳米生物材料,与软骨细胞复合培养后如能促进细胞基质的分泌,细胞分裂增殖及细胞表型的维持,将有可能成为一种较理想的细胞支架应用在软骨组织工程中。目的:观察兔关节软骨细胞在纳米自组装短肽KLD-12水凝胶中三维培养的生物学特性。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-04在四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所实验室完成。材料:纳米短肽KLD-12序列为:Ac-KLDLKLDLKLDL-CONH2,由上海波泰生物公司合成。方法:取新西兰兔关节软骨,通过酶消化法获取软骨细胞,体外培养2代后以5×109L-1的密度接种于4g/L的自组装短肽KLD-12溶液中,用磷酸盐缓冲液诱导成胶后进行三维培养。主要观察指标:①通过倒置相差显微镜观察软骨细胞在纳米短肽水凝胶中的形态。②用甲苯胺蓝染色,免疫组化检测细胞外基质分泌情况。③反转录-聚合酶链反应检测软骨细胞黏多糖、前Ⅱ型胶原、前Ⅰ型胶原基因的表达情况。结果:①兔关节软骨消化分离的软骨细胞成活率达95%以上。②软骨细胞在纳米短肽水凝胶中体外培养时,细胞生长旺盛、增殖活跃,细胞为圆形聚集成团状或岛状,细胞团周围有类似的软骨陷窝形成。③甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性,细胞基质中黏多糖、Ⅱ型胶原含量随培养时间延长逐渐增加。④反转录-聚合酶链反应结果显示软骨细胞在纳米短肽水凝胶经过3周体外培养一直保持了分泌黏多糖及表达Ⅱ型胶原的能力。结论:自组装短肽KLD-12三维水凝胶能较好维持软骨细胞正常形态、功能和增殖能力。     

应用液态及凝胶态生物载体材料负载同种异体软骨细胞修复全厚关节软骨缺损

背景:应用固态载体作为细胞支架,修复关节软骨缺损,已有成功经验。尝试将液态载体或凝胶态载体材料复合细胞后注入动物体内,观察该方法的可行性。目的:探讨液态载体或凝胶态载体材料氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载同种异体软骨细胞修复全厚关节软骨的可行性。设计:对照实验。单位:威海市立医院骨科,山东省创伤骨科研究所。材料:实验于2001-11/2003-09在山东省创伤骨科研究所实验室进行。健康成年新西兰大白兔36只,体质量2.5～4.5kg,雌雄不限。编号后根据缺损处注入物质的成分随机数字法分成4组,即氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2软骨细胞组、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2组、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组、空白对照组,每组9只。方法:36只大白兔分组后造关节软骨缺损模型,取同种新西兰大白兔关节软骨细胞,体外培养扩增后与20%氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2混合,移植到缺损处进行修复。各移植组缺损处分别注入氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组。空白对照组:缺损处不做任何处理。移植后4,8,12周对缺损的修复情况进行大体、光镜组织学评估和电镜观察。据Wakitani评分标准,采用盲法对修复质量作出评价。主要观察指标:①软骨缺损修复程度。②软骨细胞的性质形态,基质中胶原性质、数量及排列方式。结果:①移植的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞中的软骨细胞能很好地生长,4周时,缺损区完全填充。8,12周再生组织与周围正常软骨组织外观相似,界限模糊。组织学检查:形成透明软骨,缺损处被修复。②电镜下:8,12周,修复组织中可见多数成熟的透明软骨细胞及其周围排列不规则的、纤细的、均匀的和无周期性的Ⅱ型胶原。空白对照组仅见纤维修复,再生组织缺乏弹性,表面粗糙,不规则。③修复质量评分:氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞组和各组相比在各个时期差异均存在显著性,氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2组和氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组与对照组相比在各个时期差异均存在显著性[4周:(3.93±1.91),(4.56±1.07),(4.78±1.09),(8.44±1.13)分;8周:(2.80±1.45),(3.24±1.00),(3.33±1.00),(8.44±1.13)分;12周:(2.22±1.10),(3.01±0.69),(3.00±0.71),(9.00±0.87)分,P<0.001],但两组之间在各个时期无显著的差异(P>0.05)。结论:氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载同种异体软骨细胞移植能以透明软骨的方式成功修复兔膝股骨髁软骨缺损,并优于单纯的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物负载重组人骨形态蛋白2或单纯的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞的移植。