bax加强表达对Raji细胞程序性死亡效应

研究ｂａｘ过量表达对Ｂｕｒｋｉｔｔ淋巴瘤细胞株细胞程序性死亡的效应及其机理。方法；亚克隆构建可以过量表达ｂａｘ ａ的真核表达载体，通过脂 转染法导入Ｒａｊｉ细胞株中。ＰＣＲ及免疫荧光定量鉴定ｂａｘ ａ在Ｒａｊｉ细胞株中的表达；流式细胞仪检测凋亡率。     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体,经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,并检测ｂａｘ基因在转导株的表达．方法：采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ的多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,Ｇ４１８筛选克隆细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达．结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ,将之转入细胞后,经Ｇ４１８筛选３０ｄ获得了稳定的细胞克隆,即ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ－ｂａｘｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实了ｂａｘ基因转导株具有明显的Ｂａｘ蛋白表达．结论：ｂａｘ真核表达载体的构建,为胃癌耐药的临床治疗打下了基础．     

基底细胞癌中p53,bcl-2及bax蛋白的表达

采用免疫组化法,检测了３２例基底细胞癌中ｐ５３蛋白,ｂａｘ蛋白和ｂｃｌ２蛋白的表达。结果显示：ｐ５３蛋白阳性表达１３例（４０６％）,ｂｃｌ２蛋白阳性表达２６例（８１２％）,ｂａｘ蛋白阳性表达９例（２８１％）;ｂａｘ和ｂｃｌ２蛋白两者表达呈负相关（ｒ＝－０．５７２,Ｐ＜０．０１）。提示基底细胞癌的发生、发展可能与细胞凋亡受抑制有关。     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901／V …

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体，经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，并检测ｂａｘ基因在转导株的表达。方法 采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ｃｍｖ的多克隆位点之间，以脂质体倡导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，Ｇ４１８筛选克隆细胞，Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达。结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ，将之转入细胞后，经Ｇ４１８筛选３０ｄ     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株，研究野生型ｐ５３蛋白在诱导瘤细胞凋亡中的作用。方法：用ＤＮＡ转染技术将７重组野生型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ８６０３中，用ＰＣＲ技术监测外源性ｐ５３基因在瘤细胞中存在的稳定性；用免疫组化方法检测在地塞米松的诱导下瘤细胞中ｐ５３的表达情况；用相差显微镜去观察凋亡瘤细胞的形态特点；用细胞凋亡原位检测技术标记并统计凋亡的瘤细胞数。结果：成功地将重组野性型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ８６０３中，在ｇｐｔ选择培养基中培养两周后，分离生长出阳性细胞克隆；经ＰＣＲ证实外源性ｐ５３基因在瘤细胞内稳定存在并可随瘤细胞分裂而传给子代；当向培养液中加入１μｍｏｌ／Ｌ地塞松（Ｄｅｘ）后，８ｈ即可用免疫组化方法检测到ｐ５３蛋白的表达并可观察到瘤细胞出现凋亡的一系列形态学改变，转染后的瘤细胞凋亡率高达９０％。结论：当人骨肉瘤细胞株中重组野生型ｐ５３基因诱导过表达时，瘤细胞呈现凋亡，本实验为骨肉瘤的基因治疗提供了理论依据。     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

谷胱甘肽巯基转移酶pi参与肿瘤细胞耐药性的产生

目的建立携带大鼠谷胱甘肽巯基转移酶ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）ＣＤＮＡ的细胞表达体系。方法用磷酸钙沉淀法将重组质粒ｐＳＶ－ＧＴ和载体质粒ｐＳＶ－ｎｅｏ分别转染ＨｅＬａ细胞,Ｇ４１８筛选得两株转染阳性细胞ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ和ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ;采用细胞原位杂交法,以地高辛标记的ＧＳＴ－ｐｉ　ｃＤＮＡ为探针,检测两细胞株ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的表达水平;用ＭＴＴ法检测不同抗癌药物对细胞株的毒性作用。结果ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ表达明显升高,而ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ和ＨｅＬａ细胞的表达水平很低。阿霉素、丝裂霉素Ｃ和顺铂对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＩＣ５０分别为７０．１３、１０．９５和１６．５２ｕｇ／ｍｌ,对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ的ＩＣ５０分别为１０．３４、７．４８和１３．７０ｕｇ／ｍｌ,长春新碱对两细胞株的毒性无明显差别。结论ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ细胞具有较高的耐药性。ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的大量表达可能是产生多药耐药的原因,此细胞株可作为一个稳定的遗传学系统在ＧＳＴ－ｐｉ与肿瘤细胞耐药的研究中广泛应用。     

腺病毒和腺伴随病毒基因元件提高白细胞介素6在真核细胞中的表达效率

目的：构建高效真核表达载体以提高细胞因子在真核细胞中的表达效率。方法：利用基因克隆技术构建了两个新的白细胞介素６（ＩＬ６）真核表达载体ｐＡｄＣＩＩＬ６和ｐ３３５ＣＩＬ６。将它们瞬时转染ＣＯＳ７细胞后，利用ＩＬ６依赖株７ＴＤ１对上清中的ＩＬ６进行检测。结果：两种新建载体分别能提高ＩＬ６在真核细胞中的表达效率５．５和３．４倍。结论：腺病毒的病毒相关Ⅰ和ⅡＲＮＡ（ｖｉｒｕｓａｓｏｃｉａｔｅｄⅠａｎｄⅡＲＮＡ，ＶＡⅠａｎｄＶＡⅡ）和腺伴随病毒（ａｄｅｎｏａｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）的倒转末端重复序列（ｉｎｖｅｒｔｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）能提高细胞因子在真核细胞中的表达     

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

反义N-ras-1基因对成纤维细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因阻断成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的促增殖作用，为防治以血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖为主要特征的血管损伤后再狭窄等心血管疾病提供进一步探索的途径。方法利用构建的含反义Ｎ－ｒａｓ１基因的逆转录病毒质粒（ｆｐＧｖ１－ＭＴ－ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮ－ｒａｓ１）转染于培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ），ｆｐＧｖ１－ＭＴ逆转录病毒空载质粒及未转染质粒的细胞为对照，观察其对ｂＦＧＦ诱导的ＶＳＭＣ的影响。结果反义Ｎ－ｒａｓ１细胞数为（１６．８±１．３）×１０４（细胞／ｍｌ），空载质粒对照细胞为（３０．１±１．２）×１０４，两者差异有显著意义（Ｐ＜０．００１）；反义Ｎ－ｒａｓ１细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率为７６４３±６７２（ｃｐｍ），空载质粒对照细胞为１５１３１±１３８（ｃｐｍ），两者差异有非常显著意义（Ｐ＜０．００１），同时应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因的细胞ＲａｓｍＲＮＡ表达水平明显降低，其表达蛋白ｐ２１也明显降低。结论反义Ｎ－ｒａｓ１基因对ＶＳＭＣ及ｂＦＧＦ诱导ＶＳＭＣ增殖有抑制作用。     

阻断TGF α-EGFR自泌环对胰腺癌细胞体外生长的影响

目的研究阻断ＴＧＦα－ＥＧＦＲ自泌环对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建了反义ＥＧＦＲ的表达载体ｐＣＭＶ－ＡＳ－ＥＧＦＲ,转染已经反义ＴＧＦα转化的胰腺癌ＰＣ－７细胞,经Ｇ４１８筛选,获得稳定的双重转化细胞系ＰＣ－７／ＡＳ－ＴＧＦα／ＡＳ－ＥＧＦＲ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、１２５Ｉ－ＥＧＦ结合试验分析双重转染细胞系基因的整合及表达。ＤＮＡ凝胶电泳、流式细胞术、原位凋亡检测细胞凋亡。结果双重转染细胞系有外源ＴＧＦα基因的整合及表达,内源性ＥＧＦＲ及ｃｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达下调、细胞表面ＥＧＦＲ受体表达下降,与反义ＴＧＦα单独作用比较,反义ＥＧＦＲ与反义ＴＧＦα的联合作用更强。３Ｈ－ＴｄＲ掺入率由２５％降至１４．５％。生长抑制率由７８．８％提高到８６．０％、软琼脂集落形成能力完全丧失。双重抑制后,细胞更容易发生凋亡。结论对胰腺癌中异常信号传导途径的阻断,能明显地抑制肿瘤恶性生物学行为,使肿瘤细胞恶性表型部分逆转。     

鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤中癌细胞增生凋亡及其相关基因的表达

目的：研究鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１、ＣＮＥ２裸鼠移植瘤中癌细胞增生、凋亡及其与肿瘤生长速度的关系,探讨移植瘤中肿瘤细胞凋亡的机理。方法：将鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１、ＣＮＥ２分别接种于裸鼠皮下,并连续在体内传９代。对每一代肿瘤组织进行ＨＥ染色,ＴＵＮＥＬ法（原位细胞死亡末端标记法）检测原位细胞凋亡及免疫组化法检测ＰＣＮＡ、ｂｃｌ２、ｂａｘ和ｐ５３的表达。结果：ＣＮＥ２移植瘤生长速度快于ＣＮＥ１移植瘤;ＣＮＥ２移植瘤内肿瘤细胞分裂指数和细胞增生指数明显高于ＣＮＥ１移植瘤,而细胞凋亡却相对较少;移植瘤组织中的凋亡主要表现为“皱缩性坏死”和“凋亡小体”的形成;所有移植瘤组织中都有ｐ５３蛋白积聚和ｂａｘ过表达,但却未见ｂｃｌ２的表达。结论：ＣＮＥ１和ＣＮＥ２细胞株移植于裸鼠皮下后,生长速度的差异是由于肿瘤细胞增生凋亡比例不同所致;裸鼠移植瘤组织中瘤细胞的死亡主要表现为凋亡,凋亡的途径可能是不依赖于野生型ｐ５３,而由ｂａｘ所介导的     

野生型p53基因的表达及其对子宫颈癌细胞株的生长抑制作用

构建了可在哺乳动物细胞中表达人ｐ５３蛋白的重组质粒ｐ５３─ｐＳＶ２ｎｅｏ，分别转染猴肾细胞株ＣＶ─１及人子宫颈癌细胞株ＳｉＨａ。用ＰＣＲ法检测出转染细胞中的ｐ５３ｃＤＮＡ；用免疫组化ＡＢＣ法检测出ｐ５３蛋白的表达定位于细胞核内，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测出转染细胞中存在ｐ５３蛋白。结果表明，外源性野生型ｐ５３基因的表达可以使ＳｉＨａ细胞的细胞克隆形成效减少５０％，使细胞生长速度降低，但对ＳｉＨａ细胞的软琼脂克隆形成效无明显影响。提示ｐ５３基因的肿瘤抑制作用与野生型ｐ５３蛋白的量有关，并且是细胞类型特异性的。     

绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达

目的：在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）为标记基因的合适条件。方法用带有ＧＦＰ突变体的质粒转染到表达细胞,观察ＧＦＰ瞬时表达的情况：１．直接测定ＧＦＰ在ＣＯＳ－７细胞中的表达并观察表达的稳定性;２比较不同启动子驱动的ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ和ｐＳＶＫ３－Ｓ６５Ｔ两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率;３用ＬａｃＺ基因与ＧＦＰ基因共转染     

转染p53抑癌基因体外抑制K562细胞克隆的形成

目的：构建ｐ５３表达质粒，研究ｐ５３基因对白血病细胞Ｋ５６２细胞生长的抑制作用。方法：以Ｔ４连接酶把２１６０ｂｐ的ｐ５３ｃＤＮＡ片段插入ｐＲｃ／ＣＭＶ质粒，重组构建ｐＲｃ／ｐ５３表达质粒，以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导ｐＲｃ／ｐ５３质粒转染Ｋ５６２细胞，以甲基纤维素半固体培养方法作Ｋ５６２细胞体外克隆培养，观察转染ｐ５３基因后Ｋ５６２细胞克隆形成改变。结果：ｐ５３ｃＤＮＡ质粒转染的Ｋ５６２细胞，体外培养克隆形成能力明显减低。在接种１×１０４细胞时，未转染的空白对照组及空质粒对照组白血病细胞集落数分别是２７９７±２６４和２７２５±２６１；而ｐ５３质粒转染组细胞集落数是１０６１±１６０；与空质粒转染组及未转染的Ｋ５６２细胞组比较有非常显著性差异（Ｐ＜０００１，ｎ＝１０）。结论：转染ｐ５３基因能抑制Ｋ５６２细胞的生长。     

人野生型p53基因与逆转录病毒载体的构建及转染

应用逆转录病毒为载体构建了含人野生型ｐ５３基因的重组质粒，并成功地转染ψｃｒｉｐ包装细胞。本实验应用ＰＬＸＳＮ为载体，１．８ｋｂ野生型ｐ５３基因作为插入片段，通过Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶进行连接。用〔α—￣（３２）Ｐ〕ｄＣＴＰ标记野生型ｐ５３基因片段（１．８ｋｂ）为探针进行原位杂交。筛选出重组体，将其命名为ＰＬＸＳＮ－５３，然后用该重组体对ψｃｒｉｐ包装细胞进行转染。收集转染后的细胞，准备下一步感染ｐ５３突变细胞株研究之用。该质粒的构建和细胞转染实验为进一步研究野生型ｐ５３基因的抑癌作用及其表达与调控原理奠定了基础。     

大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶I cDNA片段在肝癌及非肝细胞中表达体系的构建

观察０．５８７和０．７１２ｋｂＣＰＳＩｃＤＮＡ片段分别与ｐＳＶ＿２载体的重组质粒ｐＳＶ＿２－ＣＰＳ＿（５０５）和ｐＳＶ＿２－ＣＰＳ＿（５０７）在人肝癌和非肝细胞中的表达情况。结果证实，两种重组的表达质粒转染的７４０２人肝癌细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞均能有效地表达ＣＰＳＩ，ＣＰＳＩ基因的非翻译区顺序与其高度组织特异性无关。这些体系的建立为体外生产ＣＰＳＩ抗原和天然ＣＰＳＩ蛋白提供了细胞模型和实验依据，对深入了解ＣＰＳＩ的表达过程及其癌变和分化的关系具有重要的意义。     

pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

α肿瘤坏死因子（TNFα）基因的分离鉴定及在人肝癌细胞中的表达

应用不连续密度梯度法分离获得人肝癌浸润性单个核细胞（ＴＩＭ），ＲＮＡ斑点杂交提示ＴＩＭ中有明显的ＴＮＦαｍＲＮＡ转录。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增反应分离得到一特异的７００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，ＤＮＡ序列分析证实这一ＤＮＡ片段中包含编码人ＴＮＦα成熟肽所需的的全部ｃＤＮＡ序列。将这一人ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆到真核细胞表达质粒ｐＳＶＫ３，获得真核细胞表达重组ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ，用磷酸钙沉淀法将ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ导入人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１中的细胞培养上清中可检测到ＴＮＦα的一过性表达。结果提示ＴＩＭ可成为获取ＴＮＦα基因的来源，获得的ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ重组质粒为肝癌的基因治疗奠定了基础。