丹参酮诱导间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

神经干细胞的发现和研究,改变了以往神经细胞不可再生的传统观念.目的:研究丹参酮在体外诱导间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的作用.方法:用Ficoll-Paque液将成人骨髓细胞进行密度梯度离心和贴壁筛选分离出MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达和进行细胞周期测定.采用含丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞,并探讨丹参酮不同浓度对MSC诱导分化为神经元样细胞的影响.以免疫组化方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:MSC原代可获得(6-8)×105、第5代可获得(2-3)×108个细胞.流式细胞仪检测结果CD29、CD44、CD166表达阳性,CD14、CD34、CD45、HLA-DR为阴性;扩增后的各代MSC表面抗原表达无显著差别;90%以上MSC都处在G0/G1期.丹参酮诱导后,MSC形态上转变为典型的神经元样细胞,免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性.结论:采用的细胞培养条件适于MSC的纯化和扩增,培养细胞为MSC;丹参酮可以在体外诱导MSC分化为神经元样细胞,其诱导转化率与丹参酮的浓度有关.     

隐丹参酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：观察隐丹参酮体外定向诱导成人骨髓间质干细胞（MSC）分化为神经元样细胞。方法：采用Ficoll-Paque液分离成人MSC，体外扩增，FACScan流式细胞仪检测表面抗原表达，采用含隐丹参酮的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF－M，NF－H）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、巢蛋白（Nestin)的表达。结果：成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10^6个细胞，15代可获得（2－3）×10^12个细胞，流式细胞仪检测显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。加入隐丹参酮诱导后，MSC胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF－M，NF－H、Nestin表达阳性，GFAP阴性。结论：隐丹参酮在体外可诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：探讨天麻对体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的影响：方法：通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养。中药天麻定向诱导分化为类神经元样细胞光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志物神经原烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)。结果：大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。天麻诱导2h后大部分可分化为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论：大鼠MSC可诱导分化为神经元样细胞。     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞前后基因表达的研究

目的:探讨成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞前后基因表达的变化.方法:从成人骨髓分离MSC,培养扩增.用参芪液诱导hMSC分化为神经元,并用免疫组化法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达来鉴定是否为神经元样细胞.采用半定量RT-PCR方法检测10个基因(包括内胚层基因Ceruloplasmin;中胚层基因SM 22;外胚层基因Amyloid precursor protein、syntaxin;生殖系基因protamine;神经元特异性基因NeuroD、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化前后的变化.结果:hMSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞.免疫组化结果显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性,GFAP阴性.hMSC在分化前表达内胚层、中胚层、外胚层和生殖系基因,随着分化时间的延长,生殖系基因不表达,内胚层和中胚层基因表达减弱,外胚层基因表达基本不变.而在分化过程中外胚层基因和神经元特异性标记基因表达明显增强.结论:hMSC分化为神经元样细胞的过程并不是简单的神经特异性基因的"开"和"关",而是与神经细胞分化成熟过程中相关基因表达的量相关.     

黄芩甙诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的　黄芩甙体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法　通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞 ,体外扩增培养。中药黄芩甙定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶 (NSE)、巢蛋白 (Nestin)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果　大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄芩甙诱导 5h后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性 ,GFAP阴性。结论黄芩甙可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的探讨益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.方法采用密度梯度离心法分离获取SD大鼠骨髓单个核细胞层,将细胞经过传代培养使细胞得到扩增和纯化,用流式细胞仪鉴别.用益气活血方联合二甲亚砜(DMSO)、丁羟茴醚(BHA)和β-巯基乙醇(BME)等对碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导的MSCs诱导向神经细胞定向分化.用免疫细胞化学方法检测诱导1 h、3 h后巢蛋白(nestin)的表达,诱导5 h后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,鉴定分化细胞的类型,并计数MSCs分化的各种细胞的阳性率.结果益气活血方体外诱导MSCs 1h、3 h后分化为nestin免疫细胞阳性率为45.5%±3.4%和38.3%±1.8%,诱导5 h后NSE和GFAP免疫细胞阳性率为82.3%±2.4%、12.1%±1.6%,与对照组相比有极显著性差异(P＜0.01).结论成年大鼠骨髓MSCs可以在体外培养扩增,益气活血方有体外定向诱导骨髓问充质干细胞向神经细胞分化的作用.     

三七总皂苷在骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的调解作用研究

目的:探讨三七总皂苷在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的调解作用。方法:①实验材料:成年健康Wister大鼠(雌雄不限),SRF级,体质量(150±30)g;②实验方法:无菌的条件下从大鼠的股骨中分离并继代培养MSCs细胞,当传至第5代时,先用完全培养液[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]进行预诱导,再更换无血清培养液(含三七总皂苷0.25g/L)进行诱导,采用免疫组织化学SABC法检测神经丝蛋白(NF-M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:①采用三七总皂苷诱导后,大多数MSCs呈神经元样细胞分化。经免疫组织化学鉴定,上述细胞表现为NSE、MAP-2和NF染色阳性,呈棕黄色,而GFAP染色阴性。②采用三七总皂苷进行诱导时,MSCs的胞体逐渐增大,并伸出细长的突起,在突起的末端出现分支,有些相邻细胞的突起还成网状连接。③三七总皂苷诱导MSCs转变为类似于神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质,而GFAP染色均为阴性。SABC法显示NSE和MAP-2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)%和(73.5±2.17)%。结论:三七总皂苷在体外能使MSCs向神经元样细胞转化,且具有神经元样细胞的特性,这为MSCs治疗相关疾病提供了理论基础。     

三七总皂苷对人骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响

目的 研究三七总皂苷（tPNS）与bFGF联合在人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）分化为神经元样细胞过程中的诱导作用及作用剂量.方法 全骨髓贴壁法分离、培养、扩增、纯化hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表面CD29、CD44、CD105、CD34分子,测定周期.取第三代hBMSCs,含20%胎牛血清的1 mmol/Lβ-巯基乙醇（BME）预诱导24 h,继而用bFGF（20 ng/mL）标准组、tPNS（1 mg/mL）药物组、20 ng/mL bFGF＋低、中、高剂量tPNS（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL）诱导液诱导,设立空白对照组.采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋-2（MAP-2）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达.MTT法检测各组诱导后不同时间点对神经元样细胞活力的影响.结果 成功分离培养hBMSCs,经诱导后大部分hBMSCs分化为神经元样细胞,联合诱导组细胞生长状态及活力较好,阳性细胞NSE、MAP-2比例高于对照组（P〈0.05）,GFAP表达阴性.结论 tPNS与bFGF联合在体外能有效诱导hBMSCs分化为神经元样细胞,表达神经细胞特异性抗原,保持较好的活力、延长存活时间.     

地黄多糖对大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化作用的研究

目的:探讨地黄多糖体外对大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为神经样细胞的诱导作用.方法:以大鼠BMSCs为研究对象,采用流式细胞仪检测BMSCs表面标志,MTT法检测细胞生长曲线,当第3代细胞爬片达到80％以上汇合时,分为对照组、化学方法诱导组(5 mmol·L -1,β-mercap toethanol)、脑源性神经生长因子(10 μg·L-1,BDNF)组和地黄多糖组(200 mg·L-1)进行诱导,6h后应用免疫细胞化学染色法检测各实验组神经元巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,RT-PCR检测nestin,NSE,βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)和GFAP mRNA的表达情况.结果:经分离鉴定培养5代以内大鼠BMSCs增殖旺盛、具有较好的细胞活力;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后有特异性神经细胞标志物表达.其中地黄多糖组Nestin,NSE阳性细胞率分别为( 56.74±1.36)％,(73.37±1.27)％,高于化学诱导组(28.21±2.43)％,(2.31±2.72)％和神经生长因子组(31.3±1.61)％,(28.87±1.65)％,(P＜0.05);GFAP阳性细胞率(20.17±1.27)％低于化学诱导组和神经生长因子组,差异具有统计学意义(P＜0.05);化学诱导组Nestin,NSE和GFAP阳性细胞率与生长因子组比较,差异无统计学意义.结论:地黄多糖具有诱导BMSCs向神经样细胞分化的作用,主要向神经元样细胞方向诱导.     

电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的：研究电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，MSCs用含10％健康大鼠电针血清、10％脑梗塞大鼠血清、10％脑梗塞大鼠电针血清和含10％丹参注射液的L-DMEM诱导MSCs，光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可以通过贴壁法成功分离，并可在体外大量扩增，健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清诱导48小时之后未见神经元样细胞出现，免疫细胞化学染色NSE、Nestin阴性。丹参诱导4小时后，大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin染色呈阳性。结论：健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清不能诱导MSCs体外分化；丹参注射液可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞。     

香丹注射液定向诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:研究香丹注射液对成年SD大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)的诱导分化作用.方法:rMSCs取自大鼠的下肢骨,贴壁筛选法和营养缺陷培养基(α-MEM完全培养液)分离纯化.加碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导第5代的rMSCs 24 h,换无血清培养液(D/F12 N2 bFGF)和香丹注射液(1%～5%)诱导6～8 h,观察细胞形态变化;细胞免疫化学和反转录-PCR法鉴定神经元标记物(神经元特异性烯醇化酶NSE、神经丝蛋白NF-200、微管相关蛋白MAP-2及胶质纤维酸性蛋白GFAP)的表达及相对表达量,并得到相应的诱导率.结果:诱导3 h,rMSCs出现神经元样的形态学变化,诱导6～8h,神经元的诱导率达83.5%±3.8%;诱导组中,神经元样细胞NSE、NF和GFAP的阳性率分别为82.9%±2.98%、84.1%±4.45%、3.49%±1.67%;对照组细胞和诱导组未变化细胞上述染色均呈阴性;RT-PCR法示:只有诱导组有NSE、MAP-2(HWM)、GFAP的表达且前两者的表达量均分别高于后者(P＜0.01).结论:1%～5%香丹注射液在体外能定向诱导rMSCs分化为神经元样细胞.     

川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞长期诱导效应的研究

目的 探讨川芎嗪提取液体对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的长期诱导效应.方法 分离培养大鼠骨髓MSCs,用1.50g/L川芎嗪提取液对MSCs进行诱导,倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化,并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞浆内Nestin和NSE蛋白表达.结果 川芎嗪诱导培养8h后即可见细胞形态发生变化,24 h后表现为典型的神经元细胞形态,Nestin和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达,3d后诱导效果最好,6d后,有些细胞突起变长,出现分叉,并且有些细胞出现衰老死亡.结论 川芎嗪早期诱导BMSCs向神经元样细胞分化的效果较好,长期诱导的特异性不明显.但可促进细胞突起的生长,并且促进神经细胞的成熟和死亡.     

参芪扶正注射液诱导成人间质干细胞治疗脑梗塞的实验研究

目的观察参芪扶正注射液(简称参芪液)诱导成人间质干细胞(hMSCs)在脑梗塞大鼠脑内的分化及其对模型大鼠神经功能的影响。方法建立左大脑中动脉梗塞模型大鼠,将在体外扩增的hMSCs经参芪液诱导0．5h后注入模型大鼠脑内。观察hMSCs在大鼠脑内的存活、分化及对模型大鼠神经功能的改变。结果hMSCs移植排斥反应低,可在大鼠脑内存活6周以上;移植前后脑梗塞面积无明显变化;免疫组化表明hMSCs在大鼠脑内表达人神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP);模型大鼠的肢体运动功能和触觉功能均有改善。结论参芪液可诱导hMSCs在体内分化为神经元,hMSCs有可能成为治疗脑梗塞的理想的种子细胞。