应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg结合蛋白1反式激活基因

目的筛选与克隆HBeAg结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索。方法应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因。以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减库。库扩增后得到85个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,包括14种已知基因和1种未知基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBEBP1可能存在的调控机制的线索。     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因

目的应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减库,克隆XTP3反式激活相关基因。方法以XTP3表达质粒pcDNA3．1(-)XTP转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果库扩增后得到30个白色克隆,经菌落PCR分析,得到23个200～1000bp插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,共得到20种已知基因序列和2种未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因。结论成功构建了乙型肝炎病毒xTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础。     

应用基因表达谱芯片筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式调节基因

应用基因表达谱芯片技术对HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3.1(－）-core转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测。基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均与GenBank中登录的基因，HCV核心表达质粒转染的细胞有95条差异表达基因，其中45条基因表达增强，50条基因表达降低。这些核心蛋白反式调节基因与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导及免疫调节密切相关。本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白致病（癌）的分子生物学机制提供了理论依据。     

肝炎病毒蛋白反式激活作用的研究策略

具有反式激活作用的肝炎病毒蛋白有多种,目前研究主要集中在HBV的羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)、HBx-Ag,以及HCV的核心蛋白、非结构蛋白3(NS3)、非结构蛋白5A(NSSA)等。研究肝炎病毒蛋白反式激活作用的分子生物学技术包括抑制性消减杂交(SSH)、基因表达谱芯片技术等。肝炎病毒蛋白在极少数情况下通过与启动子DNA结合影响肝细胞的基因表达谱,但更主要的是通过影响细胞信号转导的途径,包括NF-κB、STAT3、MAPK、Nur77、P13K等。关于肝炎病毒蛋白对肝细胞基因表达谱的影响及其机制的研究,对于阐明肝炎病毒感染引起的慢性肝病的分子生物学机制具有重要意义。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒 X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的重组表达质粒pcDNA3.1(－）-NS3和表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(－）-X，分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，用免疫印记（Western blotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT 3-promoter共转染HepG2细胞，检测报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达水平，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子功能的影响。结果显示，两个重组表达载体pcDNA3.1(－）-NS3及pcDNA3.1（－）-X在HepG2细胞均以瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3.1(－）-X组的CAT的表达分别是对照的3．6倍和4．4倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的8．5倍；表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明，HepG2细胞中表达的HCV NS3蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染pcDNA3．1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果该新基因的编码序列全长为2001nt,编码产物由667aa组成,并测序证实,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册,注册号为AY038359。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白不同区段在HEK293T细胞内的定位

目的：为进一步探讨HCV核心蛋白致癌机制，观察了HCV核心蛋白不同区段在HEK293T细胞内的定位情况。方法：构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和不同长度核心蛋白区段融合表达的pEGFP-C1系列重组载体，对HEK293T细胞进行瞬时转染，并在激光扫描共聚焦显微镜下观察核心蛋白不同区段在细胞内的定位。结果：全长核心蛋白定位于细胞质；核心蛋白1-59aa区段完全定位于细胞核；50～140aa区段和1-140aa区段在细胞核和细胞质中均存在；130～191aa区段完全存在于细胞质中。结论：核心蛋白不同区段在细胞内的定位不同，将导致其参与细胞调节的途径和功能的不同。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

应用抑制消减杂交克隆内皮细胞内毒素刺激后相关基因

提取人脐静脉内皮细胞经内毒素刺激6h后的mRNA并合成cDNA，与对照组进行抑制消减杂交，经菌落斑点杂交筛选出阳性克隆，进行测序和同源性分析，并采用Northern杂交验证新的cDNA序列，共获得25条差异表达基因，涉及与编码炎症介质、胞内信号传导、细胞骨架、细胞凋亡和能量代谢相关的基因，其中3条为新基因序列。结果表明，抑制消减杂交技术有效地克隆了内皮细胞内毒素刺激后相关基因，有助于阐明内毒素激活血管内皮细胞的机制，并为临床防治内毒素损害寻找新的作用靶点提供了根据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5B结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

目前认为丙型肝炎病毒 (HCV)的非结构蛋白 5B(NS5B)是病毒复制酶 ,但是对其生物学特性还不十分清楚 ,我们应用酵母双杂交系统 3,构建NS5B诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合 ,于涂有X α gal营养缺陷型培养基(SD/ Trp Leu His Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆 ,筛选出 33个与NS5B特异性相互作用的克隆 ,其中有 31个已知功能基因及 2个未知功能基因。所克隆到的基因对以后研究NS5B的功能有一定的提示作用 ,并为研究这些能与NS5B相互作用的基因在肝细胞中的生理功能奠定了基础。     

骨髓和动员外周血中CD34+细胞基因表达差异的研究

为探讨骨髓的造血干细胞和动员的外周血造血干细胞在基因表达水平是否有差别，作者以CD34抗原作为造血干细胞的标记，筛选出同一个供者的静息散骨髓和经G－CSF（granulocyte colony-stimulating factor）动员后的外周血CD34^ 细胞，用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术检测两种来源的CD34^ 细胞的基因表达差异。结果发现，动员外周血CD34^ 细胞有１１个高表达基因，主要涉及的基因有核蛋白、转录调节因子、锌指蛋白和干扰素相关的分析。提示动员外周血CD34^ 细胞与静息期骨髓CD34^ 细胞基因表达谱并不完全相同，从而导致其生物学行为的差异。因此，进一步的研究可能对造血干细胞的迁移、归巢过程有更深的了解，对如何加速造血干细胞移植后造血功能的恢复具有一定的意义。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

报道两种长度的ＨＣＶ核心基因片段在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达结果。从ＨＣＶ感染者的血清扩增出核心区基因，利用表达质粒ｐＱＥ－３０，构建了两组重组质粒，其插入片段分别为ＨＣＶ的全长核心区基因（ｃ５７３）和“截断型”基因（ｃ３７５）。经ＩＰＴＧ诱导，含两种质粒的菌株都表达了目的蛋白，ｃ５７３表达的蛋白子分量为２２ｋＤ，表达量占菌体蛋白的８．７％；ｃ３７５表达的蛋白分子量为１９ｋＤ，表达量占菌体蛋白的３９．９     

丙型肝炎病毒E2蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

HCV的包膜蛋白E2 (E2 )的生物学特性与HCV感染的慢性化和抗病毒免疫关系极为密切。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 76个与E2特异性结合的阳性克隆 ,包括人类肝细胞癌相关抗原、硒结合蛋白、核苷传送系统、果糖磷酸激酶等 2 6种已知功能蛋白质基因和 14个未知功能基因。本研究结果为阐明E2在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。     

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白－蛋白的结合是丙型肝炎病毒（HCV）与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白5A（NS5A）被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子，参与HCV的复制、转录和信号传导等过程，但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系，作者采用酵母双杂交系统3，在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选，得到35个与NS5A特异性结合的阳性克隆，包括载脂蛋白、线粒体单体型基因，磷脂酸酸性磷酸酶等11种已知功能蛋白质基因和3个未知功能基因。本研究结果为阐明NS5A在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。     

HCV包膜蛋白E2的表达及其抗原性的检测

为研究丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2在原核细胞和真核细胞中的表达，并对表达蛋白的抗原性进行检测。将HCV E2区N端的一段基因分别克隆入原核表达载体pQE30和真核表达载体pEF1/HisC中进行E2蛋白的表达，采用ELISA和WB对表达蛋白的抗原性进行检测。结果在原核细胞和真核细胞中均表达了预期大小的蛋白，能同HCV感染者血清发生特异性反应。提示该段E2基因在原核表达系统和真核表达系统均能表达出具有抗原活性的蛋白，其中真核细胞表达的蛋白可被糖基化。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗－HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落。随机挑选60个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定。获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV核心蛋白特异性抗－Id scFv的编码序列进行测定分析。结果经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，在随机挑选的60个克隆中，有20株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应后，确定了其中有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆，提取质粒，进行DNA序列测定，DNA大小为768bp。本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗－HCV核心蛋白的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治慢性丙型肝炎的研究创造了条件。