人牙源性间充质细胞体内立体培养模型的建立--构建组织工程化牙本质和牙髓组织

目的：以陶瓷化骨和Collagraft复合材料为载体建立人牙源性间充质细胞的体内立体培养模型，构建组织工程化牙本质和牙髓组织。方法：将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于陶瓷化骨和Collagraft复合材料上，将细胞/支架复合物移植到裸鼠皮下，建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型。4周和10周后取材，对移植物进行组织学观察和DSP的免疫组化染色。结果：10周的实验组标本中，植入的细胞在支架上形成了不太典型的牙本质和牙髓样组织，新生的牙本质样组织和其内侧出现极化的细胞均表达人DSP。对照组和4周标本中未观察到此现象。结论：用人牙源性间充质细胞和Collagraft或CBB载体在裸鼠体内可成功构建出组织工程化牙本质和牙髓样组织。     

用人牙源性上皮和间充质细胞构建组织工程化牙齿样结构的实验研究

目的：以人牙源性上皮和间充质细胞作为种子细胞在裸鼠体内构建牙齿样结构。方法：将体外培养的人牙源性上皮细胞和经生长因子诱导后的牙源性间充质细胞分层接种于经塑形的陶瓷化骨或Collagraft三维支架上，将形成的细胞/支架复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的体内立体培养模型。14～18周后取材，采用HE染色、改良丽春红三色法、免疫组化和原位杂交方法检测移植物中的组织新生情况。结果：细胞在三维支架上形成了包含釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构。新生的釉质样组织表达人成釉蛋白，其周围残留的牙源性上皮细胞表达人釉原蛋白mRNA。同时，人DSP蛋白在牙本质样组织中呈阳性表达。所有对照组标本中均未观察到该现象。结论：以优选出并经塑形的三维支架为载体，在裸鼠体内建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的立体培养模型，成功构建出组织工程化牙齿样结构。     

猪牙源性间充质与胶原类材料复合移植的实验研究

目的：探讨经体外培养的出生后的猪牙源性间充质细胞成牙能力。方法：将体外培养第4代的猪牙胚细胞接种到胶原凝胶基质中,体外培养3d后进行裸鼠体内移植,6W后取材观察。结果：猪牙胚细胞原代培养过程中可见上皮样细胞与成纤维样细胞混杂存在,传代3次后上皮样细胞消失。细胞胶原基质复合物取材结果显示细胞聚集的区域可见牙本质-牙髓复合体样结构。结论：经体外传代培养后未经体外诱导的牙胚细胞接种到胶原凝胶基质所构建的组织工程牙齿有牙本质-牙髓复合体样结构形成,说明牙胚细胞经体外培养后其所获得的发育信息仍可保持,是研究牙齿发育构建模型及组织工程牙齿的理想的种子细胞。     

大鼠牙源性细胞复合nHAC/PLA支架体内构建牙体组织-骨复合体样结构的研究

目的: 探讨不同组合生长因子诱导的大鼠牙源性上皮细胞(rDECs)、间充质细胞(rDMCs)复合nHAC/PLA支架体内形成牙体组织-骨复合体样结构的能力。方法: 应用酶消化法和差速消化法分离培养rDECs和rDMCs,免疫荧光染色鉴定其来源。将各组细胞-支架复合物移植裸鼠皮下3月、5月后分别取材,检测移植物形成牙体组织-骨复合体样结构能力。结果: 成功分离培养、鉴定大鼠牙源性上皮细胞和间充质细胞。细胞-支架复合物移植后3月,组①、②、③在细胞-支架接触部位均发现类骨质、新生成熟骨和血管形成,并有OCN、OPN的阳性表达。组②促成骨作用最强。对照组④没有新生骨形成,仅有少量胶原纤维和血管。移植后5月,组①、③均形成没有髓腔的牙根样结构,部分区域有DSPP、DMP1、CAP表达。组②形成周边有新生骨、中央有单根牙体样组织,中心为含有牙髓样组织和血管的髓腔样结构,并有DSPP、DMP1、OPN、OCN在髓腔内壁牙本质基质、部分牙髓样组织和血管内的阳性表达,ameloblastin、CAP分别在釉质样、牙骨质样组织中表达阳性。对照组④形成新生骨,OCN强阳性表达,未形成牙体样结构。结论: 经TGF-β1+BMP4诱导的rDECs + rDMCs-nHAC/PLA体内移植物促成骨和成牙作用最强,移植后5月形成牙体组织-骨复合体样结构。     

牙髓干细胞、外胚间充质干细胞裸鼠体内分化的实验研究

目的：将免疫磁珠STRO＋-1的牙髓干细胞（DPSC）和外胚间充质干细胞（EMSC）与支架材料复合,观察在裸鼠体内移植后的分化能力,为干细胞分化能力研究提供依据.方法：收集免疫磁珠STRO＋-1的DPSC和EMSC,将其与陶瓷化骨复合移植入裸鼠背部皮下,8周后移植物组织学切片,HE染色观察及免疫组织化学检测DSP分布.结果：DPSC组移植物中可见新生基质,其相邻的结缔组织细胞部分出现极化,似成牙本质样细胞,局部放大可见类似于不典型的牙本质牙髓复合体.EMSC组有基质形成,结构不典型,有骨样基质形成,也存在有类牙本质牙髓复合体样结构.在移植后8周,DPSC组DSP在沉积的新生基质和部分出现极化的细胞胞浆中呈阳性表达.结论：通过免疫磁珠筛选的STRO＋-1的DPSC具有自我更新的特性,能够在体内继续分化形成牙本质样基质.EMSC组移植到裸鼠皮下,也能够形成基质.但是结构不典型.     

牙齿组织工程无机和复合型支架材料的优选

目的：优选应用于牙齿组织工程的无机和复合型支架材料。方法：将生长因子诱导后的人牙源性间充质细胞与天然珊瑚、陶瓷化骨以及Collagraft复合材料相复合进行体外培养，采用扫描电镜和细胞计数法观察和比较细胞在各种三维支架中的生长、增殖情况。结果：细胞在陶瓷化骨和Collagraft复合材料表面伸展充分，生长良好，增殖活跃，细胞表面可见多数分泌颗粒，而天然珊瑚表面附着细胞很少，伸展不够充分，增殖也不明显。结论：陶瓷化骨和Collagraft复合材料适宜牙源性间充质细胞的生长，可以作为构建组织工程牙齿样结构的支架材料．     

重建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究

目的 采用组织工程学的方法重建牙本质-牙髓复合体样结构。方法以大鼠牙髓干细胞为种子细胞，将羟基磷灰石-磷酸三钙（HA-TCP）复合支架材料接种至裸鼠背部皮下，8周后取材进行组织学及免疫组织化学检测。结果移植物组织学切片可见支架材料孔隙内有3层组织结构，由外向内分别为矿化牙本质、前期牙本质及牙髓组织，其中牙本质小管明显，牙髓组织外层细胞密集，部分出现极化，呈现出成牙本质细胞样细胞特征。免疫组织化学染色证实人牙本质特异性蛋白、DMP1在前期牙本质区及成牙本质细胞样细胞为阳性表达。结论采用牙髓干细胞为种子细胞、HA-TCP为支架材料可成功构建牙本质-牙髓复合体样结构，为进一步进行牙齿组织工程再造奠定基础。     

人牙源性间充质细胞向成牙本质细胞的诱导分化

目的:建立人牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化的体外诱导方案。方法:应用bFGF IGF 1或TGF β1分别对培养早期的人牙源性间充质细胞进行平面定向诱导,观察诱导后细胞的形态学改变,采用免疫荧光染色和RT PCR方法检测成牙本质细胞标志物———DSP蛋白和DSPPmRNA在诱导后细胞中的表达,并通过VonKossa染色检测诱导后细胞的矿化能力。结果:诱导后部分细胞出现单侧较长的细胞突起,表达DSP蛋白和DSPPmRNA,体外连续培养可自发形成矿化结节,出现较典型的成牙本质细胞的形态和功能特征。结论:bFGF IGF 1或TGF β1可促进牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化。     

人牙髓细胞藻酸盐复合物形成牙体样组织的动物体内研究

目的探索藻酸盐支架移植传代培养的人牙髓细胞形成牙体样硬组织的能力。方法体外培养第13代的人牙髓细胞使用藻酸盐支架进行移植,并植入裸鼠背部皮下。并进行免疫组织化学、RT-PCR、组织光镜、共聚激光扫描镜和电镜形态学观察。结果在裸鼠皮下移植六周后,移植物在体内形成了不透射的钙化团块。免疫组织化学和超微结构研究鉴定显示矿化移植物中的Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原和DSP的存在。以及孤立的成牙本质样细胞提示牙体样硬组织的形成,移植物中也可见分散的自体溶解凋亡细胞。结论传代培养的牙髓细胞活跃地分化为成牙本质样细胞,并可在藻酸盐支架中被诱导钙化。     

大鼠牙髓干细胞与牙乳头间充质细胞成牙能力的比较研究

目的:探讨采用牙髓干细胞替代牙乳头间充质细胞进行牙齿再生研究的可行性。方法:分别分离培养6周龄SD大鼠切牙牙髓干细胞(DPSCs)和出生1d的SD仔鼠切牙牙乳头间充质细胞(DPMCs),对上述2种细胞的表面标记、增殖能力、体外矿化能力以及向成牙本质细胞分化能力进行比较。结果:DPSCs与DPMCs均具有较强的增殖能力和矿化能力,体外诱导均有成牙本质细胞特异性标记物DSPP基因表达,体内移植后均能够形成牙本质样结构。结论:DPSCs是一种较为理想的牙胚间充质细胞的替代细胞,在适宜的诱导环境中能够替代DPMCs进行牙齿的再生研究。     

鼠根端乳头条件培养基诱导下的牙周膜细胞膜片与牙本质管和煅烧骨间的牙周膜再生

目的 利用鼠根端乳头条件培养基(APTG-CM)与牙周膜细胞(PDLCs)建立间接共培养体系,探讨牙周组织再生的研究.方法 胶原酶联合组织块法获得人PDLCs,用波形蛋白和角蛋白鉴定PDLCs的来源.APTG-CM诱导PDLCs 28d,通过免疫细胞化学法检测PDLCs中骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)、骨涎蛋...     

人牙囊细胞与胶原凝胶复合煅烧骨三维培养的实验研究

目的:建立人牙囊细胞(dentalfolliclecells,DFCs)的体外三维立体培养模型。方法:取第4代DFCs分别 接种于煅烧骨(sinteredbovinebone,SBB)(A组)、胶原凝胶(B组)、胶原复合煅烧骨三维支架上(C组),并以二维 培养的DFCs(D组)作对照,1周、2周取材,扫描电镜观察细胞形态以及与材料的贴附情况,细胞计数观察细胞在 材料上的增殖情况,组织化学方法检测DFCs的碱性磷酸酶(ALP)活性。结果:扫描电镜见A组、B组和C组细胞 均完全伸展,但C组细胞数量明显增多,细胞外基质分泌增加,优于A组、B组和对照组D组,而对照组细胞在二维 培养条件下复层生长呈膜状结构,膜表面部分细胞脱落死亡,细胞外基质分泌较实验组少。A组与C组的ALP活 性无差异(P>0.05),但显著高于对照组B组和对照组(P<0.05)。1周时3组细胞Ⅰ型胶原合成情况无明显差 异,但2周时C组细胞的Ⅰ型胶原平均灰度值明显高于其他2组(P<0.01)。结论:A、B、C组对DFCs的贴附、增 殖,分化均有影响,但C组作支架最优。胶原凝胶与煅烧骨的复合支架更有利于牙囊细胞的增殖贴附和分化。     

负载骨结合式牙种植体的骨构建实验研究

目的 观察骨结合式牙种植体与骨髓基质成骨细胞(MSO)及松质骨基质(CBM)支架复合人工骨皮下移植后，新骨的形成及与种植体的愈合情况。方法 将骨结合式牙种植体置于圆柱状的CBM中，在其表面及孔洞内接种培养扩增的MSO，形成负载骨结合式牙种植体的骨髓基质成骨细胞-藻酸盐-松质骨基质复合人工骨(MCCAB)，然后植入裸鼠背部皮下组织中，对照组植入负载骨结合式牙种植体的藻酸盐-松质骨基质复合物。植入4、8周取材，通过大体标本观察、X线检查、组织学观察和组织学定量分析评价新骨形成情况。结果 负载骨结合式牙种植体的MCCAB皮下成骨效果明显优于负载骨结合式牙种植体的藻酸盐-松质骨基质复合物组。复合人工骨标本内有大量新骨形成，兼有膜内成骨和软骨内成骨的特点，并以前者为主；种植体与新骨结合。对照组成骨作用不明显，为单纯软骨内成骨，与种植体未见结合。结论 骨结合式牙种植体与复合人工骨复合植入后，在支架材料与种植体表面均有大量新骨形成，并可与种植体结合，表明用组织工程学方法进行颌面部骨修复时，可以同期植入种植体。     

大鼠牙髓干细胞的培养和鉴定

目的：分离培养大鼠牙髓干细胞并对其进行生物学鉴定。方法：采用单细胞克隆的方法进行大鼠牙髓干细胞的分离培养,并将达到一定数量级的牙髓干细胞与HA—TCP支架材料进行复合,移植入裸鼠背部皮下,8周后取材进行组织学鉴定。取鉴定成功的细胞株复苏进行细胞生物学特性研究,同时进行成牙本质细胞诱导并进行DsP、DMP1免疫组织化学染色一结果：单细胞来源的细胞克隆(RDPSC282)移植物组织切片可见牙本质牙髓复合体样结构。复苏细胞形态为梭形,细胞密集时形态多样,为卵圆形或多角形,细胞群体倍增时间为58．3h,克隆形成率为1．33％,免疫组化染色DSP、DMPl均为15月性,经矿化液诱导后部分细胞胞浆DsP及DMP1出现阳性染色。结论：首次成功分离培养出一株大鼠牙髓干细胞。     

大鼠口腔黏膜固有层前体细胞复合不同支架材料的实验研究

目的 探讨口腔黏膜固有层前体细胞(oral mucosal lamina propria progenitor cell,OMLPPC)在不同支架材料上的生物学特性.方法 利用免疫磁珠方法筛选OMLPPC,体外培养分成2组:A组正常培养,B组利用矿化诱导条件培养基诱导.2组细胞分别与陶瓷化骨、胶原-壳聚糖支架材料复合,...     

富血小板血浆支架诱导牙髓再生的体内研究

目的：探讨不同浓度的富血小板血浆（PRP）支架在体内诱导牙髓组织再生的能力。方法将小型猪乳牙牙根段进行化学预备,采用二次离心法制备PRP,根据注入根管中的成分不同将研究分为4组：（1）阴性对照组,即全血组;（2）100％ PRP组;（3）50％ PRP组;（4）空白组,即空的牙根段;每组5个样本,分别植入裸鼠背部皮下,于术后5周处死动物,取出样本进行组织学观察。结果植入5周后,100％ PRP组根管内充满了炎性细胞,50％ PRP组根管内有少量牙髓样的组织生成。结论合适浓度的PRP作为生物支架在体内再生牙髓样的组织是可行的。     

PGA无纺网与PDLCs的3D共培养物在裸鼠体内的生长观察

目的：通过研究人牙周韧带细胞(PDLCs)与聚羟基乙酸(PGA)无纺网共培养物在裸鼠体内的生长，探讨PGA无纺网作为支架应用于牙周组织工程的可能性。方法：将共培养7d的人PDLCs与PGA无纺网复合物接种于BALB／C裸小鼠一侧背部皮下，另一侧植入空白PGA为对照。分别于1、2、3、4周取材进行大体及HE和Masson‘s染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学观察，并进行新生毛细血管记数。结果：随着。PGA无纺网在体内的逐渐降解，PDLCs同步增殖，分泌胞外基质。体内2周时即可见实验侧植入物血管化良好并有胶原束的形成，Ⅰ型胶原表达阳性。结论：PGA无纺网具有良好的生物相容性和生物安全性，并易于新生血管的形成，作为牙周组织工程的细胞支架有良好的应用前景。