应用转基因技术体外培养表达人碱性成纤维细胞生长因子的视网膜色素上皮细胞

目的 探讨应用转基因技术体外培养稳定表达人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的可行性。方法 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为标记基因的人bFGF真核表达载体pcFG。应用脂质体介导法转染人RPE细胞,以G418筛选出表达bFGF的RPE细胞,并进行细胞克隆,传代培养4周。于荧光显微镜下观察GFP的表达情况,用原位杂交和免疫组织化学染色法检测bFGF在RPE细胞的表达情况。结果 酶切结果证实含有GFP的真核表达载体pcFG构建正确。在荧光显微镜下可见RPE细胞表达绿色荧光蛋白。经原位杂交和免疫组织化学染色证实,转染pcFG后的RPE细胞内有大量bFGF—mRNA的转录蛋白表达。结论 应用转基因技术可体外培养稳定表达bFGF的RPE细胞。     

绿色荧光蛋白逆转录病毒及其介导的视网膜色素上皮细胞基因转移研究

目的 制备携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)基因的逆转录病毒,感染原代与建株的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE)细胞,评价逆转录病毒对人RPE细胞的感染能力,为视网膜病变的基因治疗奠定基础。方法 分离编码GFP的cDNA片段并插入逆转录病毒载体pLNCX,借助脂质体将重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转入单嗜性及双嗜性包装细胞,G418筛选抗性克隆,分离GFP表达水平最高的克隆;收集含病毒颗粒的上清液感染NIH3T3及体外培养的人原代与建株的RPE细胞。结果 重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染各种包装细胞后,可产生GFP逆转录病毒。由双嗜性包装细胞产生的GFP逆转病毒能够感染原代与建株的人RPE细胞,GFP基因可持续在RPE细胞内表达。结论 逆转录病毒能够简便、快速、稳定将目的基因转入RPE细胞,可作为眼底病变基因治疗介导目的基因转移的重要工具。     

脂质体介导色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白质粒转染大鼠视网膜细胞及其转染途径的实验研究

目的观察表达质粒色素上皮衍生因子（PEDF）-绿色荧光蛋白（GFP）以脂质体介导转染入BN大鼠视网膜组织的表达及定位,探索合适的基因治疗给药方法。方法将脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP分别经玻璃体注射和视网膜下注射的途径转染至BN大鼠眼内,于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况,用RT—PCR方法检测PEDF表达情况。结果（1）BN大鼠视网膜下注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后1d即可见在荧光显微镜下观察到在注射点周围明显的绿色荧光蛋白分布于视网膜全层包括RPE细胞层,第2、3周荧光强度比第1周增强,荧光范围也有所扩大,可以持续表达4周。RT—PCR结果证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。（2）经玻璃体腔注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后第1天BN大鼠的视网膜和RPE细胞亦可见绿色荧光蛋白表达,且分布更均匀,范围更广。第1、2周表达明显增强,到第4周仍有表达。RT—PCR结果也证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。结论阳离子脂质体可以成功介导PEDF—GFP基因转染至BN大鼠的视网膜组织、RPE细胞中,并能够持续表达。视网膜下注射和玻璃体腔注射均为有效的转染途径。本研究为视网膜,脉络膜新生血管性疾病的基因治疗奠定了基础。     

逆转录病毒载体携带报告基因在色素上皮细胞的转染与表达

目的 观察逆转录病毒载体携带报告基因在视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的表达情况,以探讨基因疗法用于抑制增生性玻璃体视网膜病变的可行性.方法 选第3～4代培养的已长满融合的RPE细胞,以1:3的分种率分种传代.随机分为对照组与实验组,每组12孔.实验组用绿色荧光蛋白基因作为报告基因,以逆转录病毒载体携带来转染RPE细胞,重组合绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒上清液浓度为1.2×109 cfu·L-1.对照组RPE细胞以同样方法直接转染绿色荧光蛋白基因质粒DNA.观察绿色荧光蛋白基因在2组RPE细胞的表达情况.结果 基因转染后可见实验组RPE细胞的绿色荧光蛋白基因表达率可达56%～72%,对照组未见有任何表达.结论 逆转录病毒载体可以携带目的基因转染于RPE细胞,并达到较高的转染率.     

PEDF-GFP基因转染大鼠视网膜的实验研究

目的将重组表达质粒色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白(pigment epitheliumderived growthfactor-greenfluorescent protein,PEDF-GFP)以脂质体介导转染BN大鼠视网膜组织,观察其表达及定位。方法以脂质体介导的方法将重组表达质粒PEDF-GFP注射到BN大鼠视网膜下,于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况,用RT-PCR方法检测PEDF表达情况。结果在荧光显微镜下观察GFP表达情况,第1d即可见明显的绿色荧光分布于视网膜全层包括RPE细胞层,第2、3周荧光强度比第1周增强,荧光范围也有所扩大,可以持续表达4周。RT-PCR方法结果类似,转染后第1d即有PEDF mRNA表达,第1、2周表达明显增强,到第4周治疗眼的视网膜组织中PEDF mR-NA仍有较高水平的表达。结论阳离子脂质体可有效将PEDF-GFP基因转染视网膜组织、RPE细胞并得到持续表达,可望用于视网膜、脉络膜疾病的基因治疗。     

逆转录病毒及睫状神经营养因子联合诱导成人视网膜色素上皮细胞转分化成为神经细胞

目的 观察逆转录病毒及睫状神经营养因子(CNTF)诱导的成人视网膜色素上皮（RPE）细胞转分化过程中的形态特征与标志物变化。 方法 成人RPE细胞经携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒感染后，进一步用脂质体介导CNTF 表达质粒进行转染.倒置荧光显微镜观察细胞形态变化,酶联免疫吸附实验、免疫组织化学染色及Western blotting方法检测细胞产生和分泌CNTF的能力、CNTF受体(CNTFR)、多种神经细胞标志物及信号传导分子一类蛋白酪氨酸激酶（JAK）的表达水平。 结果 体外培养的成人RPE细胞经GFP逆转录病毒感染后，RPE细胞的形态无明显变化，但开始表达神经元和胶质细胞的某些标志物，如神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)；经CNTF表达质粒转染后，持续高水平表达CNTF的RPE细胞出现明显的神经细胞分化,CNTFR的表达量虽无明显变化，但其分布发生改变，主要分布在细胞膜上; 此外，信号传导分子JAK表达明显上调。 结论 体外培养的成人RPE细胞在逆转录病毒及CNTF的影响下可出现明显的神经细胞形态分化，转分化与CNTF-CNTFR-JAK信号传导通路有关。 (中华眼底病杂志，2006，22：400-403）     

基因治疗对Leber先天性黑矇视功能的影响

RPE65基因突变引起的早发性、严重视网膜营养不良常合并先天弱视和成年初期视力完全丧失,该基因的编码蛋白是一种相对分子质量为65 KD的视网膜上皮特异蛋白。我们在3例年轻患者视网膜下注射重组腺病毒载体2/2,载体可在人视网膜RPE65基因启动子控制下表达RPE65反转录DNA(cDNA)。     

病毒载体介导的视网膜基因转移研究进展

用病毒作为载体携带功能基因转染视网膜以达治疗目的，这种基因治疗方法为某些遗传性视网膜病如视网膜色素变性的治疗开辟了新途径。应用腺病毒或腺相关病毒载体，经视网膜下间隙或玻璃体注射，可使报告基因在视网膜细胞中有效表达。腺病毒介导的基因表达起效早，持续时间短，腺相关病毒介导的基因表达起效晚，持续时间长。病毒载体中所含启动子的不同，其基因导致人的靶组织也不同。含茂细胞病毒启动子的病毒载体可将基因转移至视网膜色素上皮细胞，应用视紫红质启动子则转移至视细胞。     

骨髓间充质干细胞在碘酸钠注射大鼠视网膜下的分化

目的 研究骨髓间充质干细胞(BMMSCs)在视网膜色素上皮(RPE)受损的大鼠模型眼中的分化情况.方法 体外培养Wistar大鼠的BMMSCs,用病毒上清液转染EGFP,移植到经静脉注射NaIO3破坏RPE细胞的大鼠的视网膜下腔,用免疫荧光标记的方法 对BMMSCs进行追踪并观察术后5周的分化情况.结果 BMMSCs的EGFP转染比例可达到76.9%,术后第5周可见BMMSCs位于视网膜下区域,未整合入神经视网膜层,并表达角蛋白(CK)、视紫红质(rhodopsin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结论 BMMSCs植入RPE受损伤的大鼠视网膜下腔后可存活,并表达RPE细胞、光感受器细胞和星形胶质细胞的特异性标志.     

小鼠视网膜体外电转化及Transwell体外培养的方法

目的　介绍小鼠视网膜体外电转化及体外培养的方法,并对其关键技术步骤进行探讨。方法　将新生小鼠处死后,取出眼球分离视网膜,利用电转化仪将携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）报告基因的质粒转入视网膜细胞,然后在Transwell小室中铺片培养,利用免疫荧光方法检测Rhodopsin基因的表达。结果　视网膜体外培养10 d,Rhodopsin和DAPI染色显示视网膜形态完整。通过电转化方法将GFP质粒导入视网膜细胞,进行体外培养5~10 d后可检测GFP报告基因的表达。结论　视网膜体外电转化结合体外培养方法是一种快速、高效研究视网膜相关基因的方法,可以应用于视网膜疾病、视网膜发育及相关基因功能等研究,具有独特的优势。     

角膜曲率的分析

目的：探讨我国人角膜曲率半径的正常值及不同性别、不同年龄的角膜曲率半径差异。方法：对10998只眼的角膜曲率进行检测，并按男、女10岁一组进行统计分析。结果：（1）K1为7.65mm,K2为7.71mm，平均K值为7.67mm。较眼科学正常值K:7.77mm短0.1mm。（2）K的平均值男性较女性的长0.1155mm。且女性各年龄段角膜曲率半径均男性的有不同程度的减短。（3）男女均随年龄的增长，角膜曲率半径大致呈递减趋势，即：角膜曲率半径与年龄成反比关系。（４）男女K1,K2之比，均随年龄增长而增长，即K1逐渐增长而增长，即　K1值逐渐增长，K2逐渐减短。结论：本文测定的角膜曲率较眼科文献中的提供的正常值短0.1mm，并且存在着年龄、性别上的差异。     

艾滋病眼部并发症的资料分析

目的:通过调查分析,了解艾滋病眼部并发症的临床表现、治疗及预后。方法:收集赞比亚卡布韦总医院眼科2008-08/2009-08就诊患者。结果:艾滋病眼部并发症症状重,病程长,致盲率高。结论:充分认识、掌握艾滋病眼部并发症的临床表现,提高艾滋病的检出率,早发现、早治疗,提高艾滋病患者的生活质量。同时应强调预防是降低艾滋病发生率的关键。     

亟待新型早产儿视网膜病变动物模型的问世

早产儿视网膜病变（ROP）病因和发病机制尚不完全清楚,制约了其有效防治和相关研究的深入开展。尽管氧诱导视网膜病变动物模型为探索ROP复杂的病因和发病机制发挥了重要作用,但特异性较差,与人类ROP临床本质存在一定差异。因此,有必要对现有动物模型进行改良或建立新动物模型。通过更新观念、在多学科交叉中寻求突破,融合更多ROP危险因素,并结合新兴的转基因技术以及完善模型评价系统,建立科学的实验研究平台,为更好地开展ROP防治研究奠定基础。     

泪囊鼻腔吻合术后复发的原因分析和再次手术探讨

目的分析泪囊鼻腔吻合术术后复发的原因并探讨再次手术的可行性。方法对11例泪囊鼻腔吻合术术后复发的患者予以再手术治疗,随访半年至一年。结果复发原因：泪囊未完全切开2例,骨孔过小或位置错误4例,吻合腔或骨孔内肉芽组织增生堵塞5例;10例术后流泪消失,泪道冲洗通畅,占90.91%,1例流泪减轻,泪道冲洗基本畅通,占9.09%。结论泪囊鼻腔吻合术术后复发患者可以通过再次手术重建泪道,是治疗泪囊鼻腔吻合术术后复发的有效方法之一。     

早产儿视网膜病变阈值病变的相关因素分析

目的 对早产儿视网膜病变(ROP)不同转归一自然退行与阈值病变各相关因素进行分析,以探讨与ROP阈值病变有关的因素.方法 回顾性分析2008年5月至2009年7月在吉林大学第一医院新生儿科收治的83例确诊ROP的早产儿相关临床数据,并进行统计学分析.结果 在83例不同程度ROP患儿中(166只眼),自然退行51例(102只眼,占ROP患儿61.45％),阈值病变32例(64只眼,占ROP患儿38.55％).使用t检验和logistic回归分析,结果表明ROP阈值病变组的胎龄较ROP自然退行组小,产次较ROP自然退行组次数多,差异均有统计学意义(P＜0.05);排除其他因素干扰后,男性、机械呼吸及发生败血症与ROP阈值病变有关,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 小胎龄、多产次,男性、使用机械呼吸、发生败血症与ROP不能自然退行有关.     

多排螺旋CT三维重建对视神经管骨折的诊断价值

目的探讨多排螺旋CT对视神经管骨折的诊断价值。方法对58例眼部外伤的病人行螺旋CT扫描，并进行三维重建。结果58例病人中，均伴不同程度的眼眶骨折，合并视经管骨折8例，其中视神经管内壁骨折4例，内壁为蝶窦壁3例，筛窦壁1例，外壁骨折3例，上壁骨折1例，通过三维重建可清晰地显示骨折线，骨重建显示准确，多平面重建定位好，3D重建显示骨折直观、立体。结论多排螺旋CT三维重建对视神经管骨折显示清晰，定位准确，对临床论断及治疗提供充分的依据。     

早产儿视网膜病变筛查和阈值期治疗的研究

目的研究早产儿视网膜病变(ROP)的发生率,评估ROP阈值期治疗效果。方法使用双目间接检眼镜对108例早产儿进行ROP筛查,将筛查结果进行统计学分析,达到阈值病变的患儿及时进行视网膜激光光凝或经巩膜、视网膜冷凝术。结果筛查108例早产儿,发现ROP23例,发生率为21.3%。在所有ROP患儿中,ROP1期13例,占56.5%;ROP2期3例,占13.0%;ROP3期7例,占30.4%。其中ROP3期患儿均伴有附加病变,达到阈值病变标准。ROP患儿出生体重为(1.43±0.25)kg(t=4.059,P<0.001);孕周为(31.0±2.3)周(t=2.637,P=0.013);吸氧时间为1~49d,平均17d(n=23,Z=-3.630,P<0.001);需要机械辅助呼吸患儿18例(χ2=12.009,P=0.001);上述指标与非ROP患儿比较,差异均有统计学意义;而与是否多胎的差异无统计学意义(χ2=1.013,P=0.314)。Logistic回归分析:出生体重低(β=-2.542,OR=0.079,P=0.032)和使用机械辅助呼吸(β=1.341,OR=3.823,P=0.025)的患儿是发生ROP的相关高危因素。7例阈值期病变患儿中,6例进行激光光凝或冷凝治疗。术后随访2个月至2年,手术眼的结构和视功能未见异常。1例阈值期病变患儿未予治疗,于1个月后出现视网膜脱离。结论出生体重轻、孕周少、吸氧时间长、需要机械辅助呼吸的早产儿发生ROP的风险较高。对阈值期病变患儿应及时进行激光光凝或冷凝治疗。     

玻璃体内注射康柏西普治疗早产儿视网膜病变的血管化过程

目的：评价玻璃体内注射康柏西普在治疗I型(阈值期和阈值前期)和A-ROP(急进性ROP)的早产儿视网膜病变(ROP)的一系列病例中引起的视网膜血管化过程。方法：回顾性研究2017-07/2020-03在厦门市儿童医院眼科通过玻璃体腔注射康柏西普(IVC)治疗的ROP患者34例67眼。再活化是指急性期特征的复发，发生在疾病的任何阶段，无论是否存在其他疾病。结果：患儿34例的平均胎龄为28.82±2.32wk。平均出生体质量为1155.18±398.22g。19例37眼的病变区域为Ⅰ区。10例20眼的病变位于Ⅱ区，5例10眼的病变位于Ⅱ区后部。一次IVC治疗的ROP患儿疾病控制总有效率为73.1%(49/67)，且Ⅱ区血管化均完成。患者在Ⅲ区的血管化完成率出现差异。在接受过一次治疗且未再复发的患者中，Ⅰ型ROP血管化时间平均为9.11±2.49wk，A-ROP为13.40±4.04wk。A-ROP的血管化完成时间明显比Ⅰ型ROP的时间长，且结果有统计学差异。结论：IVC治疗后的病变为Ⅱ区的患儿均具有较高的血管完成率。     

眼睑分裂痣的手术方式探讨

目的 探讨不同部位和大小眼睑分裂痣的手术方式及效果.方法 回顾性系列病例研究.收集本中心1997年7月至2006年11月的眼睑分裂痣病例共30例(30只眼),按不同部位,侵犯范围的大小分别采取了不同的手术方法.包括:分裂痣切除后直接缝合3例;分裂痣切除后Ⅰ期行游离皮肤移植术5例;分裂痣切除后皮瓣转移术,手术分两期进行,Ⅰ期行上睑或下睑手术,3个月后Ⅱ期行另一眼睑手术,共22例,其中对侵及泪小点的分裂痣将色素痣和受侵犯的泪小点一起切除后行泪小管口再造和睑成形术8例.结果 30例患者随访2～11年,平均随访时间60个月.有1例术后2年复发,随诊5年再次手术,术后病理发现有恶变,经再次行Mohs眼睑恶性肿瘤组织学控制性切除术,术后未见复发.其余病例未见复发和恶变.结论 眼睑分裂痣切除术采用分期手术转移皮瓣法修复眼睑比游离植皮法疗效更满意.对分裂痣切除术后的病例需密切观察,以便早期发现恶变.     

玻璃体腔注射康柏西普治疗早产儿视网膜病变的临床疗效

目的：观察玻璃体腔注射康柏西普治疗早产儿视网膜病变（ROP）的安全性和有效性。方法：回顾性病例研究。选择2015年2月至2016年5月郑州市第二人民医院和登封市妇幼保健院ROP筛查并诊断为 急进性后极部早产儿视网膜病变（AP-ROP）、阈值期ROP或阈值前期1型ROP的患儿26例（52眼）。其中Ⅰ区病变17例,Ⅱ区病变9例。所有患儿在确诊后24 h内玻璃体腔注射10 mg/ml康柏西普0.025 ml （含康柏西普0.25 mg）。随访时间为21～49（31.2±12.5）周。病情复发或对康柏西普治疗无反应者,给予重复康柏西普注射或激光光凝治疗。随访期间观察患儿视网膜血管变化情况以及眼部或全身不良反应发生情况。结果：52眼中,经单次康柏西普治疗有效为46眼（88%）,病变完全消退,视网膜血管发育至Ⅲ区。重复康柏西普注射治疗2眼,占4%;经补充激光光凝治疗4眼,占8%,其中3眼病变复发行玻璃体切割术,占所有患眼的6%,纤维增生膜持续加重,发生视网膜脱离,2眼术后视网膜完全复位,1眼术后视网膜部分复位,包括AP-ROP 1眼,阈值期ROP 2眼,均为Ⅱ区病变,复发时间为10～17（13.2±1.8）周。所有患儿随访期间均未发生局部及全身不良反应。结论：康柏西普注射治疗ROP患儿安全有效。部分治疗无反应者,需手术联合激光光凝治疗。