牙龈卟啉单胞菌FtsZ的C末端和N末端氨基酸残基缺失对其GTPase活性的影响

目的：探讨牙龈卟啉单胞菌（Pg）丝状温度敏感蛋白质（FtsZ）的C末端和N末端氨基酸残基缺失对其GTPase活性的影响,阐明PgFtsZ GTPase的功能区域,为牙周病的防治提供实验依据。方法：将质粒pEZ1(Wt PgFtsZ,含野生型PgFtsZ的基因)、pYW1（ZΔC01,从PgFtsZ的C末端去除73个氨基酸残基的变异型）、pYW2（ZΔC02,从PgFtsZ的C末端去除128个氨基酸残基的变异型）、pYWN1（ZΔN01,从PgFtsZ的N末端去除43个氨基酸残基的变异型）和pYWN2（ZΔN02,从PgFtsZ的N末端去除205个氨基酸残基的变异型）分别导入E.coli BL21(DE3)pLysS中表达目的蛋白,然后分离和纯化WtPgFtsZ、ZΔC01、ZΔC02、ZΔN01和ZΔN02,将pET3a 载体导入E.coli BL21(DE3)pLysS中作为空白对照。采用Malachite green assay法检测Wt PgFtsZ、ZΔC01、ZΔC02、ZΔN01和ZΔN02的GTPase活性,沉淀法检测体外聚合功能,光学显微镜下观察Wt PgFtsZ和各种变异型PgFtsZs过表达时E.coli细胞形态变化。结果：除ZΔN01外,ZΔC01、ZΔC02和ZΔN02的GTPase的活性值均较Wt PgFtsZ降低（P<0.05）,10 mmol•L^-1 CaCl2可使Wt PgFtsZ和各种变异型PgFtsZs的活性下降（P<0.05）;除ZΔN02以外,10 mmol?L-1 CaCl2均可诱导Wt PgFtsZ、ZΔC01、ZΔC02和ZΔN01的体外聚合反应。Wt PgFtsZ、ZΔC01和ZΔC02在E.coli细胞中过表达时,细胞呈细长丝状,与仅含有pET3a载体作为空白对照的E.coli相比细胞明显变长;ZΔN01和ZΔN02在E.coli中过表达时,E.coli细胞形态与仅含有pET3a载体作为空白对照的E.coli细胞形态相似。结论：PgFtsZ N末端的ZΔN01和ZΔN02之间的162个氨基酸残基及C末端的128个氨基酸残基与PgFtsZ 的GTPase活性有关,二价阳离子Ca2+能抑制PgFtsZ的GTPase活性,促进其体外聚合的功能。     

Ca2+和Mg2+对野生型和变异型牙龈卟啉单胞菌FtsZs的GTPase活性的影响

目的: 探讨Ca²+和Mg²+对野生型和变异型牙龈卟啉单胞菌FtsZs的GTPase活性的影响。 方法: 将质粒pEZ1(野生型PgFtsZ, Wt PgFtsZ)、pYW1(PgFtsZ的C末端缺失73个氨基酸残基的变异型,ZΔC01)和pYW2 (PgFtsZ的N末端缺失43个氨基酸残基的变异型,ZΔN01)导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达,分离和纯化这些目的蛋白。应用Malachite green 检测法检测10 mmol•L^-1的Ca²+、Mg²+对Wt PgFtsZ、ZΔC01和 ZΔN01的GTPase活性的作用。 结果: 在没有10 mmol•L^-1 Ca²+或Mg²+的条件下,Wt PgFtsZ、ZΔC01和 ZΔN01的GTPase值分别为8.25±0.22、7.43±0.23和8.00±0.18;在10 mmol•L^-1 Mg²+存在的条件下,Wt PgFtsZ、ZΔC01和ZΔN01 的GTPase值分别为8.30±0.15、7.51±0.22和7.85±0.17,同没有离子存在的条件下相比GTPase活性差异均无显著性（P>0.05）;在10 mmol•L^-1 Ca²+存在的条件下,Wt PgFtsZ、 ZΔC01和ZΔN01的GTPase值分别为5.84±0.20、5.25±0.18和5.73±0.13,同没有离子存在的条件下比较GTPase活性均有明显降低（P<0.01）。结论: 10 mmol•L^-1 的Mg²+对Wt PgFtsZ、ZΔC01 和ZΔN01的GTPase活性无影响,10 mmol•L^-1 的Ca²+则对GTPase具有抑制作用。     

常用抗厌氧菌药物对牙龈卟啉单胞菌的体外抗菌活性研究

目的 研究口腔临床常用抗菌药物对牙周炎主要病原菌牙龈卟啉单胞菌（Pg)的抗菌活性。方法 用从成人牙周炎患者龈下菌斑中分离的、通过PCR鉴定的106株Pg临床分离株,采用琼脂稀释法测定了甲硝唑、克林霉素和替硝唑对三种不同浓度Pg菌液的最小抑菌浓度（MIC）。结果 上述药物对Pg的MIC范围依次是≤0.25-8mg/L,≤0.06-8mg/L和≤0.06-4mg/L,MIC90依次为8mg/L,8mg/L,4mg/L.10^5CPU/ml,10^6CFU/ml和10^8CPU/ml三种菌液浓度对实验结果无明显影响。结论 Pg对这三种药都非常敏感,敏感性大小依次为替硝唑、克林霉素和甲硝唑。     

牙龈卟啉单胞菌FtsZ降解试验模型-clpP基因缺失株的构建

目的 建立牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZ （FtsZPg）体内降解试验模型,即构建蛋白酶编码基因clpP缺失的E.coli MG1655.方法 将一段两端含靶基因同源臂的PCR产物电转入L-阿拉伯糖诱导后表达λ噬菌体重组蛋白、具有较强重组能力、含质粒pKD46的菌株E.coli MG1655感受态细胞,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因.结果 利用氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,得到E.coli MG1655的ClpP蛋白酶基因敲除突变株.通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序最终鉴定阳性clpP基因缺失株.结论 本试验成功构建了E.coli MG1655 clpP敲除株;该敲除株有望在探讨重要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZPg与蛋白酶clpP的关系中发挥一定作用.     

牙龈卟啉单胞菌牙龈素在牙周炎发病信号通路的研究进展

牙周炎是口腔临床实践中最为常见的疾病之一。革兰阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌与牙周炎密切相关,牙龈卟啉单胞菌表面的牙龈素（gingipains）和脂多糖被认为是其最重要的毒力因子,是近年来牙周炎机制研究热点,引起研究者的广泛关注。本文结合近年来的研究进展,就牙龈卟啉单胞菌牙龈素引起牙周炎症的机制和所涉及的信号通路作一综述。     

牙龈卟啉单胞菌与非口腔疾病关系的研究进展

牙龈卟啉单胞菌是常见的牙周致病菌。近来,大量证据表明牙龈卟啉单胞菌不仅是口腔中常见致病菌,而且与非口腔疾病密切相关,包括炎症性肠炎、癌症、心血管疾病、阿尔茨海默病、类风湿关节炎、糖尿病、早产及非酒精性肝炎等。本文就近年来关于牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌与非口腔疾病关系的研究进展进行综述,有助于判别牙龈卟啉单胞菌是否可作为这些非口腔疾病的辅助诊断标记和潜在治疗靶标,进而有利于开发相关疾病的治疗策略。     

牙龈卟啉单胞菌特异性单克隆抗体的制备

目的 制备特异性识别牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。方法 ①采用杂交瘤的方法制备m Ab,用P.g重组血凝素2(recombinant Hemagglutinin 2,r HA2)免疫BALB/c小鼠,间接ELISA筛选特异性识别P.g的杂交瘤细胞株;②间接ELISA检测mAb的效价及识别P.g的特异性、敏感性。结果 筛选到5株特异性识别P.g的m Abs,C10、F3、F3-2、G3和G3-2。其中,C10、G3和G3-2免疫球蛋白亚类为IgG2a型;F3和F3-2免疫球蛋白亚类为IgG1型。mAb C10、G3、F3和F3-2识别P.g的效价均1∶128 000;mAb G3-2识别P.g的效价1∶16 000;5株mAb识别r HA2的效价均1∶128 000。5株mAb均特异性识别5×105cfu/mL的P.g ATCC33277。结论 制备了5株特异性识别P.g的mAb,可用于各种免疫学技术,为开发P.g检测工具提供了条件,对牙周病的诊断和治疗有一定的意义。     

牙龈卟啉单胞菌促进动脉粥样硬化的机制研究

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)加速载脂蛋白E基因敲除(ApoE^-/-)小鼠动脉粥样硬化(AS)形成的分子生物学机制。 方法 ApoE^-/-小鼠分为对照组和P. gingivalis感染组,每周通过尾静脉注射磷酸盐缓冲液或P. gingivalis活菌1次,共10次。末次注射后24 h,检测血液中炎症细胞因子水平; 测量主动脉粥样斑块面积,分析主动脉血管壁的炎症因子、Toll样受体-2(TLR-2)和TLR-4表达水平以及核因子-κB(NF-κB)的活化水平。 结果 与对照组比较,P. gingivalis感染组主动脉粥样斑块面积增加; P. gingivalis感染后,血液中肿瘤坏死因子(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-1β(IL-1β)的水平显著增加; 免疫组织化学显示,P. gingivalis感染后主动脉组织TNF-α和MCP-1表达水平显著增加; 免疫印迹显示,P. gingivalis感染导致主动脉组织TLR-2和TLR-4表达增加; EMSA显示,P. gingivalis感染后血管壁NF-κB信号活性增加。 结论 P. gingivalis通过TLRs/NF-κB信号通路,促进血管壁局部和全身炎症反应,加速ApoE^-/-小鼠AS形成。     

羧甲基壳聚糖银对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用

目的：研究羧甲基壳聚糖银 (CMCT-Ag⁺) 对牙龈卟啉单胞菌 (Pg) 的抑制作用,为研制高效无毒的抗牙周病药物提供实验依据。方法：将壳聚糖经碱化、氯乙酸修饰和离子交换制成 CMCT-Ag⁺。采用琼脂扩散和固体平板二倍稀释法观察抑菌环直径和菌 斑数,测定 CMCT-Ag⁺ 对 Pg的抑制作用。结果：获得了粉红色的 CMCT-Ag⁺ 粉末,收率为 89.4%,取代度为 0.98,银离子含量为10.21%。在抑菌环实验中,当CMCT-Ag⁺的浓度大于 0.3125 g•L^-1 时,其抑菌环直径随浓度的增加而增大,其中 40 g•L^-1CMCT-Ag⁺ 抑菌环直径可达 9.5 mm,与 0.005 g•L^-1 替硝唑相当;当 CMCT-Ag⁺ 浓度大于 40 g•L-1 时,抑菌环直径明显下降,表明 CMCT-Ag⁺ 的抑菌范围为大于 0.3125 g•L^-1。在菌斑实验中,当 CMCT-Ag⁺ 浓度大于 0.3125 g•L^-1 时,培养基表面 Pg 的生长明显受到抑制;而当浓度大于 1.25 g•L^-1 时,培养基表面无 Pg 生长,表明 CMCT-Ag⁺ 最低抑菌浓度为1.25 g•L^-1。结论：CMCT-Ag⁺ 对 Pg 的生长有明显抑制作用,可用于进一步研制治疗牙周炎药物。     

蜂胶对牙龈卟啉单胞菌及牙龈成纤维细胞的影响

目的了解蜂胶对牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingival，Pg）生长的抑制作用及对人牙龈成纤维细胞的毒性作用。方法采用液体稀释法测定蜂胶对Pg的最小杀菌浓度（MBC），用MTT法测定不同浓度蜂胶作用24h后牙龈成纤维细胞的细胞相对增殖率（RGR），了解蜂胶作用24h后细胞连续7d的增殖回复情况。结果蜂胶对取的MBC为1．56g／L，相当于0．125～0．25mg／L的奥硝唑。蜂胶浓度为MBC时RGR达到70％以上；4g／L蜂胶组的RGR为52．1％，作用细胞24h后，连续7d细胞数持续增加，吸光度逐渐接近阴性对照组。结论蜂胶对Pg的生长有显著抑制作用，且细胞毒性较小，毒性作用可逆。     

生长停滞特异性蛋白6在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导内皮细胞黏附因子及趋化因子表达中的作用

目的：探讨维生素K依赖的生长停滞特异性蛋白6（growth-arrest-specific protein 6,Gas6,一种维生素K依赖性蛋白,参与细胞增殖、存活、黏附和迁移,也在炎症反应中起重要作用）在牙龈卟琳单胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,P.g-LPS）诱导血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）表达黏附因子和趋化因子过程中的作用。方法：在血管内皮细胞中过表达和敲低Gas6基因后,用1 mg/L P.g-LPS刺激血管内皮细胞3 h和24 h,利用实时定量荧光聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction, real-time PCR）检测细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM 1）和E选择素（E-selectin）,以及趋化因子白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1）的表达。过表达或敲低Gas6基因后,细胞划痕实验检验内皮细胞迁移的生物学功能表型的变化。结果：P.g LPS刺激3 h后,敲低Gas6组的黏附因子及趋化因子的表达情况与对照组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,过表达Gas6组的黏附因子及趋化因子与对照组相比显著降低（E-selectin、ICAM-1、IL-8和MCP-1分别下降81%±0%、47%±3%、76%±3%和26%±6%,P<0.01）;P.g LPS刺激24 h后,敲低组的黏附因子及趋化因子表达情况与对照组相比显著升高（E selectin、ICAM-1、IL-8和MCP-1上调的倍数分别是2.06±0.07、1.99±0.11、3.14±0.15和1.84±0.03）, 过表达组的黏附因子及趋化因子与对照组相比显著降低（E-selectin、ICAM-1、IL-8和MCP-1分别下降29 %±1 %、62 %±3%、69 %±1%和41 %±2 %）, 实验组与对照组黏附分子及趋化分子表达差异具有统计学意义（P<0.01）。细胞划痕实验结果显示,敲低Gas6组细胞迁移能力与对照组相比增强,过表达组细胞迁移能力较对照组弱,与real time PCR检测结果趋势一致。结论：下调Gas6基因后,P.g-LPS促进ICAM-1、E-selectin、IL-8和MCP-1表达作用增强,上调Gas6基因后,P.g-LPS促进ICAM-1、E-selectin、IL-8和MCP-1表达作用减弱,各细胞因子表达量与Gas6表达趋势相反,提示Gas6在内皮细胞炎症状态下的黏附过程中可能发挥抑制作用。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛相关外膜蛋白pgmA基因的克隆和表达

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)pgmA基因,构建pgmA基因表达载体,鉴定其表达产物的免疫性.方法:采用高保真PCR分别从牙龈卟啉菌ATCC 33277和47A-1菌株中扩增pgmA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的pgmA表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用兔抗融合蛋白血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,采用ELISA 检测65株临床分离牙龈卟啉单胞菌与PgmA融合蛋白抗血清的反应情况.结果:所克隆的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277与47A-1菌株pgmA基因的核苷酸序列同源性为100%,与报道的相应核苷酸序列同源性为98.98%,氨基酸序列同源性高达99.18%.pET32a-pgmA-BL21DE3系统的PgmA融合蛋白表达量为细菌总蛋白的50%左右.PgmA融合蛋白免疫家兔能获得相应抗体并与PgmA蛋白发生结合反应.ELISA结果证实92.3%的牙龈卟啉菌临床菌株(60/65)能与PgmA融合蛋白抗血清发生结合反应.结论:本研究成功地构建了Pg pgmA高效表达系统,所表达的PgmA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Pg检测试剂盒和Pg疫苗的候选抗原.     

前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70羧基端结构域的融合表达及纯化

目的构建前列腺干细胞抗原fprostatestemcellantigen,PSCA）及热休克蛋白70（heat-shockprotein,HSP70）羧基端结构域的重组表达质粒,对重组融合蛋白进行诱导、表达及纯化,为肿瘤疫苗的研究奠定基础。方法克隆人HSP70羧基端基因及PSCA基因,构建重组表达载体pET21一PSCA-HSPC,重组融合蛋白经（isopropyl-B-D-thiogalactoside,IPTG）进行诱导表达,利用单克隆抗体进行Westernblot鉴定,最后进行蛋白纯化。结果成功构建了重组表达质粒pET21-PSCA-HSPC;SDS-PAGE结果显示目的蛋白以可溶性形式存在,经镍柱亲和层析、苯基柱疏水及凝胶过滤柱纯化后,重组融合蛋白纯度在95％以上。结论该研究成功实现了PSCA与HSP70羧基端结构域的可溶性表达。     

西帕依固龈液对牙龈卟啉单胞菌体外抑菌作用的研究

目的 比较西帕依固龈液、氢氧化钙和次氯酸钠在体外对牙龈卟啉单胞菌的抑菌杀菌作用,为临床推广使用西帕依固龈液提供实验依据.方法 ①采用液体稀释法药敏实验检测西帕依固龈液对牙龈卟啉单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC).②采用液体扩散法比较观察西帕依固龈液、氢氧化钙和次氯酸钠对牙龈卟啉单胞菌抑菌圈大小.结果 ①西帕依固龈液对牙龈卟啉单胞菌的MIC和MBC分别为5mg/mL和10 mg/mL.②比较5mg/mL和10 mg/mL西帕依固龈液与5mg/mL次氯酸钠对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用,差异有统计学意义(P＜0 05).5 mg/mL西帕依固龈液与3mg/mL氢氧化钙、20 mg/nL的西帕依固龈液与5 mg/mL次氯酸钠对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用,差异无统计学意义(P＞0.0)5).结论 在体外抑菌实验中,选择合适的浓度,西帕依固龈液对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用可以与氢氧化钙和次氯酸钠相当.     

细胞毒药物下调细胞外调节蛋白激酶与抑制肝癌SMF7721细胞增殖

目的　研究三种细胞毒药物 (三尖杉酯碱 ,长春新碱 ,足叶已甙 )抑制肝癌 SMF772 1细胞增殖、阻滞细胞周期过程中 ,细胞外调节蛋白激酶 (extracelluar regulated proteinkinases ERK1/2 )磷酸化蛋白表达水平的变化 .探讨细胞毒药物杀伤肝癌 SMF772 1的作用机制 .方法　采用 MTT法测定增殖抑制率 ,应用流式细胞术检测细胞周期 ,应用 Westernblot方法观察 ERK1/2磷酸化蛋白表达水平的变化 .结果　三种细胞毒药物 (三尖杉酯碱 ,长春新碱 ,足叶已甙 )均能不同程度的抑制 SMF772 1细胞增殖 ,抑制率分别为 (2 8±8) % ,(2 5± 16 ) %和 (2 4± 11) % ;三尖杉酯碱可使 SMF772 1细胞周期阻滞于 G1期 ,长春新碱可使其阻抑于 S期和 G2 /M期 ,Vp16则使之受抑于 G2 /M期 .受这三种细胞毒药物作用后 ,肝癌 SMF772 1细胞内处于活化状态的磷酸化 ERK1/2蛋白表达水平下降 . ERK1分别为对照组的 4 3% ,32 % ,72 % ,ERK2分别为对照组的 2 9% ,2 0 % ,6 1% .结论　 ERK通路可能是细胞毒药物杀伤肝癌细胞 SMF772 1的作用机制之一     

Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0 mmol•L^-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。 结果：0.5和1.0 mmol•L^-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温（22℃）诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。 结论：低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。     

人心肌营养素在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定

目的利用大肠杆菌高效表达可溶性具有生物学活性的重组huCT-1蛋白。方法采用PCR及T-A克隆将huCT-1开放阅读框基因克隆到pMD-18T载体上,再构建原核表达载体pGEX2T-huCT1。在不同温度不同时问,通过IPTG诱导pGEX2T—huCT1在DH5a大肠杆菌中表达,SDS-PAGE分析表达量和可溶性蛋白比例。GST亲和柱纯化huCT-1融合蛋白,凝血酶酶切融合蛋白并纯化。坐骨神经切断模型观察重组huCT-1对脊髓前角神经元的存活作用,结果构建了huCT-1的融合表达载体pGEX2T-huCT1。通过IPTG诱导,发现29℃诱导4h,目的蛋白表达量占全菌的1／5,可溶性蛋白与包涵体比为2／5。对其进行亲和柱纯化,GST/huCT-1融合蛋白纯度达到85％以上。融合蛋白酶切后,重组huCT-1蛋白纯度达到80％以上。发现原核表达重组huCT-1蛋白能挽救55％成年大鼠脊髓运动神经元的存活。结论成功地获取了具有生物活性的huCT-1的原核重组蛋白。     

17β-雌二醇对神经干细胞分裂分化作用的观察

目的　探讨雌激素对神经干细胞分裂分化的作用。方法　大鼠神经干细胞培养模型加入剂量为 10mg/L 17β 雌二醇和 10mmol/LBrdU ,分别在培养 4、12h取出细胞 ,进行免疫细胞化学标记。结果　培养 4h ,雌二醇组单位面积细胞总数和BrdU标记细胞与对照组比较差别无显著性 (P=0 2 5 9,P =0 0 6 7) ,培养 12h ,雌二醇组细胞BrdU胞核着色变浅 ,胞浆有着色 ,有 4 0 %的细胞可见明显突起 ,单位面积的细胞总数较对照组无显著性改变 (P =0 0 6 ) ,BrdU标记细胞数目减少 (P =0 0 0 3) ,提示分裂细胞减少。另一方面 ,培养 12h时的雌二醇处理组BrdU免疫荧光阳性细胞的光密度 (OD)显著高于对照组 (P <0 0 1)。结论　 17β 雌二醇可以抑制大鼠神经干细胞分裂 ,促进神经干细胞分化。