甲胎蛋白与热休克蛋白70基因融合载体的构建及表达

目的：构建分泌性小鼠甲胎蛋白(α—Fetoprotein,AFP)与结核杆菌热休克蛋白70(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,Mt．HSP70)基因融合载体,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法：以pSecTag2B为基本单位构建AFP及与HSP70的融合表达载体,融合基因以G-S-G-S连接子连接;用脂质体将系列载体导入COS-7细胞,48 h后以免疫化学方法检测其表达,抽提总RNA作RT-PCR测其在转录水平的表达。结果：构建的AFP和HSP70的单独及融合表达载体导入COS-7细胞48h后经细胞免疫化学染色为阳性,RT-PCR可扩增出特异性条带。结论：AFP和HSP70的单独及融合表达载体构建成功,能在真核细胞中表达。     

构建人肝细胞癌相关抗原HCA661和mtHSP70刺激表位的融合基因疫苗

目的：构建人肝细胞癌相关抗原661（HCA661）与牛型结核分枝杆菌热休克蛋白70 （mtHSP70）刺激表位的融合基因疫苗。方法：通过PCR技术扩增HCA661基因,定向克隆至真核表达质粒pCI-neo后测序。通过PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增包含mtHSP70刺激表位的DNA片段,亚克隆至pGEM-T easy后测序。将该刺激表位片段插入pCI-HCA661中HCA6 61下游,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒pCI-HCA661-mtHSP70E。结果：HCA661 PCR扩增产物为1 040 bp,mtHSP70表位PCR产物为312 bp,测序结果均分别与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果表明,构建的重组真核表达质粒 pCI-HCA661-mtHSP70刺激表位中含有正确编码的融合基因片段。结论：成功构建含有人肝细胞癌相关抗原HCA661-mtHSP70刺激表位的融合基因疫苗。     

热休克蛋白70在肝细胞癌中的表达意义

肝细胞癌(HCC)起病隐匿,致死率高,提高HCC早期诊断率对延长患者生存期非常重要.热休克蛋白70(HSP70)是广泛存在于生物体内的一种多肽蛋白,具有多种重要的生物学功能,近年来,随着对HSP70的研究,发现HCC组织中存在不同程度的HSP70表达,且其表达水平与HCC的治疗和转归也有着密切关联,利用HSP70的生物学功能及在不同组织中差异性表达的特性,能否为HCC的早期诊断、鉴别诊断、治疗及转归等方面提供帮助已成为研究热点.     

热休克蛋白70疫苗治疗喉癌的应用前景

<正>近年来的研究发现,热休克蛋白70(HSP70)与不同肿瘤抗原肽结合,形成HSP70-多肽复合物,具有特异性肿瘤免疫原性,可激活机体特异性和非特异性免疫反应。且无需免疫佐剂即可激发有效、持续的抗肿瘤免疫效应,这对克服肿瘤的异质性、对抗肿瘤逃逸和治疗转移癌有明显帮助,也为肿瘤免疫治疗开辟了一条新途径。本文就HSP70疫苗治疗喉癌     

热休克蛋白70与肝细胞肝癌的研究进展

热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一组广泛存在于微生物和动、植物体内的生物进化中高度保守的多肽蛋白.它主要作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、积聚、装配、运输和降解,在细胞的生长发育、代谢分化、基因转录、维持组织细胞的自稳和环境适应性方面有很重要的作用.     

NY-ESO-1和热休克蛋白70融合基因的构建和原核表达

目的 构建热休克蛋白(HSP)70和肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1融合基因,并在大肠杆菌中诱导表达. 方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株HepG2扩增HSP70基因,测序后插入pGEX-ESO1质粒中,构建NY-ESO-1与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-ESO1-HSP70,IPTG诱导含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)表达目的蛋白,Western blot 鉴定蛋白的特异性. 结果 扩增得到长度为1 917 bp的人HSP70全长基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致;获得pGEX-ESO1-HSP70融合基因原核表达质粒,经IPTG诱导,在BL21(DE3)中表达分子量约106 kD的融合蛋白(包括GST 26 kD,NY-ESO1 10 kD,HSP70 70 kD),Western blot检测该蛋白可与HSP70特异性结合. 结论 成功构建pGEX-ESO1-HSP70重组表达质粒,并获得高效表达的ESO1-HSP70融合蛋白,为HSP70-多肽疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础.     

热休克蛋白70在肿瘤中的作用研究进展

热休克蛋白(HSP)是一类广泛存在于生物体中、具有高度保守性的蛋白。当细胞受到外界不利因素刺激时可诱导HSP的产生,其对维持应激状态下细胞内环境的稳定具有重要意义。HSP70在肿瘤细胞中表达升高,与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。本文就HSP70的结构和功能及其在肿瘤发生、发展及靶向治疗中的作用等方面的研究进展进行综述。     

热休克蛋白70和热休克蛋白27在宫颈鳞癌中的表达及其意义

目的探讨热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白27(HSP27)在宫颈鳞癌中的表达及其相关性。方法应用免疫组织化学方法检测HSP70、HSP27在60例宫颈鳞癌,18例宫颈上皮内瘤变(C IN),7例正常宫颈组织中的表达。结果宫颈鳞癌组织中HSP70,HSP27阳性表达率与正常宫颈组织相比差异有统计学意义(P<0.05);宫颈鳞癌中HSP70的阳性表达与病理分级、临床分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05),HSP27的阳性表达与病理分级密切相关(P<0.05);HSP70与HSP27在宫颈鳞癌中的表达无相关关系(P>0.05)。结论HSP70、HSP27均在宫颈鳞癌发生和发展中起重要作用,HSP70可能作为判断宫颈癌预后的重要指标。     

CEA串连表位-HSP70融合基因疫苗诱导小鼠的表位特异性免疫应答

目的：观察癌胚抗原(CEA)串联表位-HSP70融合基因疫苗诱导的免疫应答，为开发新型肿瘤特异性基因疫苗奠定基础。方法：在已经构建含有变异热休克蛋白(HSP)序列的基础上，插入重组CEA串联表位的编码片段获得CEA串联表位-HSP融合基因疫苗。3次肌肉注射免疫Balb/c小鼠，设立注射生理盐水的阴性对照组、注射氢氧化铝佐剂混悬CEA串联表位的阳性对照组及注射pCITriCEA_625-667-mtHSP70的实验组。FCM分析脾脏T细胞亚群；体外培养脾细胞，ELISA检测培养上清中干扰素γ(IFNγ)的相对含量；同时测定小鼠血清CEA特异性抗体的滴度。结果：阴性对照组脾细胞中CD3⁺和CD4⁺T细胞分别为55.1%±6.1%和30.2%±4.1%；实验组脾细胞中CD3⁺和CD4⁺T细胞分别为78.7%±9.2%和48.9%±4.7%，两组比较差异有显著性(P<0.01)。其体外特异性抗原肽诱导的IFNγ分泌处于本底水平，可视为生理性参数，体外非特异性和特异性的IFNγ分泌分别增加3和6倍(P<0.01)。血清中CEA表位特异性抗体滴度阴性对照组为0，阳性对照组＜1∶500,而融合基因疫苗免疫组达到1∶4 000。结论：CEA串联表位-HSP融合基因疫苗在体内诱导以激发辅助性T细胞为特征的免疫应答。     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.     

Construction, Expression and Identification of a Recombinant BCG Vaccine Encoding Human Mycobacterium Tuberculosis Heat Shock Protein 65

Heat shock protein 65 (HSP65) is one of the most important protective immunogens against the tuberculosis infection. The signal sequence of antigen 85B and the whole HSP65 DNA se-quence of human Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) were amplified from BCG genome and plasmid pCMV-MTHSP65 respectively by polymerase chain reactions (PCR). These two se-quences were cloned into the plasmid pBCG-2100 under the control of the promoter of heat shock protein 70 (HSP70) from human M. tuberculosis, yielding the prokaryotic shuttle expression plas-mid pBCG-SP-HSP65. Results of restriction endonuclease analysis, PCR detection and DNA se-quencing analysis showed that the two cloned DNA sequences were consistent with those previously reported, and the direction of their inserting into the recombinant was correct and the reading frame had been maintained. The recombinants were electroporated into BCG to construct the recombinant BCG vaccine and induced by heating. The induced expression detected by SDS-PAGE showed that the content of 65 kD protein expressed in recombinant BCG was 35.69% in total bacterial protein and 74.09% in the cell lysate supernatants, suggesting that the recombinant HSP65 gene could express in BCG with high efficiency and the expressed proteins were mainly soluble. Western-blot showed that the secretive recombinant proteins could specifically combine with antibody against M.tuberculosis HSP65, indicating that the recombinant proteins possess the biological activity of HSP65.     

人结核分支杆菌HSP70的原核表达质粒的构建及诱导表达

目的　构建编码人结核分支杆菌 (TB)热休克蛋白 70 (HSP70 )的Dnak基因的重组原核表达质粒 ,并研究其表达动力学。方法　质粒pMT70用限制性内切酶消化、核酸体外扩增 (PCR)及末端修饰后可获得Dnak基因全长 ,与大肠杆菌质粒 pRSET连接重组 ,阳性克隆经酶切分析鉴定后即为质粒 pMT70 3,转入受体菌BL2 1DE3中 ,经诱导剂异丙基硫代 - β -D-半乳糖 (IPTG)诱导 ,由SDS -PAGE、Western -blot鉴定 ,并以薄层扫描分析。结果　重组表达质粒 pMT70 3构建成功 ,可在大肠杆菌中高效表达 ,诱导后 1h即开始表达 ,16h达高峰期。表达量占菌体总蛋白的 6 5 % ,可溶性产物占总表达量的 90 %。结论　pMT70 3质粒不仅构建成功且更有利于对分支杆菌HSP70蛋白的纯化 ,方便对其抗结核、抗肿瘤的研究     

Expression of Foreign Gene in Mycobacterium Regulated by Human Mycobacterium Tuberculosis Heat Shock Protein 70 Promoter

CHENGJizhong,male,bornin1968,LecturerThisprojectwassupportedbyPrimaryFoundationofChina(No.94-Y-19),ChineseNationalNaturalScienceFoundation(No.39480022),andChineseHealthMinistryFoundation(No.94-1-144).Heatsh0ckproteinrepresentsahighlyconservedgr0up0fproteinsinb0thprokary0ticandeukaryoticcelltypeswhichisstronglyupregulatedinresponsetoava-rietyofdifferentstressconditi0ns,suchasheat,irradiation,andthepresenceofoxida-tiveandt0xicagents-Theyp1ayanimpor-tantroleintrans-membranetransferandcor…     

mtHSP70/HSV-tk重组沙门菌抗小鼠黑色素瘤的作用

目的研究携带结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)、人单纯疱疹病毒一胸苷激酶(HSV-TK)双基因的重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效应。方法构建重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK,建立小鼠黑色素瘤动物模型,瘤内注射重组沙门菌观察其抑瘤效应、荷瘤鼠的生存期并进行安全性评估。结果瘤内注射重组沙门菌,实验组抑瘤率显著高于对照组,延长荷瘤鼠生存期,重组菌治疗后荷瘤小鼠的生存状态良好,无腹泻,治疗期间体质量无明显改变。结论减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒瘤内注射对B16肿瘤细胞具有显著抑制作用。     

结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

目的 利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP.方法 根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列.将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD 18 T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒.将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒.Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Western blot检测mtHSP70蛋白表达情况. 结果 酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达.结论 含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础.     

结核分枝杆菌higA基因的扩增及生物信息学分析

目的 对结核分枝杆菌的higA基因进行扩增,同时利用生物信息学方法分析其编码蛋白的结构和功能.方法 从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增higA基因,对扩增产物进行测序.利用生物信息学网站和软件分析higA蛋白的理化性质、信号肽、空间结构、抗原表位等.结果 higA基因扩增产物与预期一致,大小为450 bp.higA蛋白共149个氨基酸,理论等电点7.93,脂溶性系数94.30,不稳定系数36.57,预测该蛋白为稳定蛋白.higA蛋白无信号肽,含10个磷酸化位点和多个潜在的抗原表位.结论 成功扩增出结核分枝杆菌higA基因.     

结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

目的：构建结核分支杆菌HSP70原核表达载体并诱导其表达和纯化及鉴定目的蛋白。方法：利用PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增出Mtb HSP70 DNA序列，构建重组质粒pGEM-Mtb HSP70，经酶切、PCR和测序鉴定后，将Mtb HSP70基因亚克隆到原核表达质粒PQE30，构建重组表达质粒PQE30-Mtb HSP70，在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析的方法纯化目的蛋白，Western blotting杂交鉴定纯化蛋白。结果：经测序证实，获得的目的基因与GenBank中公布的结核杆菌Mtb HSP70基因序列一致。构建的原核表达载体PQE30-Mtb HSP70在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1 IPTG诱导后表达出相对分子质量约为70 400的蛋白，镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Western blotting,在相对分子质量约70 400处可见特异性着色带。结论：成功构建原核表达载体PQE30-Mtb HSP70，并成功诱导Mtb HSP70蛋白的 表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的Mtb HSP70蛋白。     

The regulatory effect of memantine on expression and synthesis of heat shock protein 70 gene in neonatal rat models with cerebral hypoxic ischemia

Objective To evaluate the neuroprotective effect of memantine, a non-competitive antagonist at the N-methyI-D-aspartate receptor, against hypoxic ischemia (HI) by exploring its regulation on the expression and synthesis of heat shock protein 70 (HSP70) gene in neonatal rat models with cerebralHI.Methods Memantine was intraperitoneally injected at a dose of 20 mg/kg in neonatal rat models either before (PRE group) or after (POST group) induction of HI. The expression and synthesis of the HSFr70 gene and its corresponding product were determined by rapid competitive PCR and immunohistochemistry, respectively.Results There was an increase in the expression of HSP70 mRNA two hours after induction of HI,which reached its peak at 48 hours, then decreased gradually. The same expression occurred at relatively low levels in the control group. Also, HSP70 synthesis was detected as early as 2h after HI,reached its peak between 48 and 72 hours, then declined over time. After memantine administration,the expression of the gene and its synthesis of the corresponding product decreased significantly during the time intervals 24 -72 h for the gene and 48 -72 h for the product compared to the HI group.Conclusion It was shown that HI is very sensitive to the expression of the HSP70 gene and synthesis of its corresponding product, which could be regulated by memantine. The latter may have the ability to reduce brain damage; thus decreased HSP70 mRNA expression could be a marker for HI. It is suggested that memantine can be a promising agent for neuroprotection against HI, although an overall and objective assessment of memantine is required to see if it can be used on neonates clinically later on.     

HSP-70与细胞保护的研究进展

热休克蛋白70（HSP-70）是生物体产生的一种有高度保守性的应激蛋白,可以增强细胞对损害的耐受程度,维持细胞的正常代谢功能,提高细胞的生存率。在中枢神经系统、心肌、肝脏、肺等组织器官损伤中具有保护作用。