共抑制RAD18和REV1基因显著增加顺铂对肺癌细胞的毒性

目的: 探讨采用基因敲减技术抑制跨损伤合成（translesion synthesis,TLS）通路和范可尼贫血（Fanconi anemia,FA)通路上游的RAD18基因与TLS通路的REV1基因后增加顺铂对人肺腺癌耐药细胞株（A549/DDP）细胞毒性的可行性及其机制。方法: 蛋白质印迹法测定顺铂诱导的A549和A549/DDP细胞RAD18和REV1蛋白表达;应用脂质体转染试剂转染针对RAD18基因的siRNAs (RAD18 siRNA),检测A549/DDP细胞转染前后顺铂诱导的FANCD2和PCNA蛋白单泛素化水平;CCK 8法检测分别转染RAD18 siRNA、REV1 siRNA以及两者共转染前后经顺铂处理的A549/DDP细胞的增殖率;流式细胞术检测转染前后A549/DDP细胞凋亡率和细胞周期。结果： A549/DDP细胞转染RAD18 siRNA和REV1 siRNA后,RAD18和REV1蛋白表达明显降低,表明转染有效,基因敲减成功。转染RAD18 siRNA后顺铂诱导的FANCD2和PCNA蛋白的单泛素化水平明显下降,提示FA通路和TLS通路的激活受到抑制。分别转染RAD18 siRNA或REV1 siRNA均可增强顺铂对A549/DDP的细胞毒性,增加顺铂诱导的细胞凋亡率,并增强细胞周期S/G2期的阻滞效应。共转染RAD18 siRNA和REV1 siRNA后,顺铂对A549/DDP细胞的毒性增强作用较单转染更为显著,顺铂诱导的细胞凋亡进一步增加。 结论： 敲减A549/DDP细胞的RAD18和REV1基因可通过抑制FA通路和TLS通路的DNA损伤修复功能,增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性;RAD18和REV1基因共敲减对顺铂的这一增敏作用更加明显,显示出A549/DDP细胞对顺铂耐药的逆转效应。     

川芎嗪对人非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP的相关ATP结合盒转运体表达水平的影响

目的：观察川芎嗪（四甲基吡嗪）对耐药相关ATP结合盒转运体B1(ABCB1)、C1(ABCC1)和G2(ABCG2)表达水平的影响，揭示其逆转人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP耐药的机制。方法：采用细胞增殖（CCK8）实验，分析人肺腺癌细胞株A549及顺铂耐药株A549/DDP对顺铂的耐受性，计算耐药指数。分析A549/DDP对川芎嗪的耐受性，遴选逆转耐药所需的工作浓度并检测逆转效果。设置空白组接种A549细胞，模型组、实验组和阳性对照组均接种A549/DDP细胞；空白组和模型组均用1640完全培养基孵育，实验组用含工作浓度川芎嗪的1640完全培养基孵育，阳性对照组用含Tariquidar的1640完全培养基孵育。提取各组全部蛋白及mRNA，用免疫印迹法（Western Blot）和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析川芎嗪对ABCB1、ABCC1和ABCG2及其m RNA表达水平的影响。结果：A549细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（28.33±3.19）μM,A549/DDP对顺铂的IC50为（983.43±101.67）μM,A549/DDP的耐药指数为34....     

Bcl2-siRNA提高人肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂敏感性的研究

目的 探讨Bcl2-siRNA 对人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP 对顺铂敏感性的影响.方法 在人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP 细胞中转染bcl2-siRNA,48h 后加入不同浓度(0、3、6、9、12、15μg/ml) 新鲜配置的顺铂溶液,药物作用48h后,用CCK-8 法检测细胞生长抑制率.荧光实时定量PCR(Real time RT-PCR) 检测A549/DDP 细胞转染bcl2-siRNA 后Bcl-2mRNA 的变化,Western Blot 检测A549/DDP 细胞转染bcl2-siRNA 后Bcl-2 蛋白的变化.结果 在A549/DDP 细胞中转染bcl2-siRNA 后,细胞Bcl-2 mRNA 降低92.6%(P<0.05),Bcl-2 蛋白表达也明显降低,同时细胞对顺铂的敏感性增加57.8%(P<0.05).结论 Bcl2-siRNA 能降低A549/DDP 中Bcl-2 mRNA 及蛋白的表达,增加A549/DDP 对顺铂的敏感性.     

CTR1和ATP7B在人肺腺癌细胞A549的表达及其与顺铂耐药的关系

目的  探讨人肺腺癌细胞株A549和肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP对顺铂的耐药机制。方法  利用噻唑蓝法检测顺铂对A549/DDP及其亲代细胞株的细胞毒作用和生长曲线的影响,探讨A549/DDP细胞株凋亡敏感性的变化规律。采用Western blot检测该细胞株铜离子转运蛋白1（CTR1）、铜离子转运磷酸化ATP酶（ATP7B）及聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）剪切蛋白表达,分析A549细胞对顺铂耐药与CTR1、ATP7B及PARP剪切蛋白表达量的相关性。结果  A549/DDP较其亲代细胞株对顺铂引起的细胞毒性和凋亡敏感性下降;较其亲代细胞株A549/DDP中ATP7B表达增加,CTR1表达降低。结论  人肺腺癌细胞株A549对顺铂耐药的产生与细胞凋亡敏感性降低有关,且细胞内ATP7B表达增加,CTR1表达降低,或可作为细胞对顺铂的增敏靶点。

     

CIK对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP杀伤效应及耐药逆转作用

目的探讨CIK细胞对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP体外杀伤效应及逆转作用。方法用MTT法分别检测顺铂、CIK细胞、CIK联合顺铂对人肺腺癌细胞A549及人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的杀伤活性,计算耐药倍数,逆转倍数。结果①顺铂对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP的50%杀伤浓度(IC50)分别为1.823g/mL、6.392 g/mL,差异有统计学意义(P<0.05),人肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂的耐药倍数(IR)为3.506。②CIK对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP均有杀伤作用,其IC50分别7.657×105个细胞/mL、7.955×105个细胞/mL,差异无统计学意义(P>0.05)。③不同浓度的CIK细胞(1×105,2×105and3×105个/mL)与人肺腺癌细胞共培养后,再加顺铂,其IC50值分别降至1.743g/mL、1.336g/mL、0.883g/mL,差异有统计学意义(P<0.05);计算逆转倍数(FR)分别为(2.369、3.091、4.677)。结论①人肺腺癌细胞A549/DDP较A549对顺铂有明显的耐药性。②CIK对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP均有杀伤作用,杀伤效果在两种细胞中无明显差异。③无毒剂量CIK联合顺铂作用于人肺腺癌细胞A549/DDP,可以增加顺铂对耐药细胞的杀伤活性。逆转倍数随着CIK密度的增加而增大,说明CIK细胞能部分逆转耐药细胞A549/DDP对顺铂的耐药性。     

注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP耐药逆转作用研究

目的 探讨注射用黄芪多糖药物血清在体外对耐顺铂（DDP）人肺腺癌A549/DDP细胞株的耐药逆转作用。方法 通过建立小鼠肿瘤模型,运用血清药理学方法,以人肺腺癌敏感细胞A549和耐药细胞A549/DDP为研究对象,采用细胞毒实验（MTT）方法,探讨注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP的耐药逆转作用。结果 注射用黄芪多糖药物血清高、中、低剂量组分别与DDP合用时对A549/DDP细胞的耐药逆转倍数分别为1.24、1.41、1.34;且中、高剂量组与阳性对照DDP组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 注射用黄芪多糖能明显增加A549/DDP耐药细胞对DDP的敏感性,提高细胞死亡率,具有耐药逆转作用。     

长链非编码RNA PAPPA-AS1在人肺腺癌细胞铂类耐药中的作用

目的: 研究长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）PAPPA-AS1在人肺腺癌细胞铂类耐药中的作用,并初步探讨其可能的调控机制。方法: 采用RNA测序（RNA-seq）技术检测人肺腺癌细胞A549及其铂类耐药细胞中lncRNA和mRNA的差异表达谱;qRT-PCR检测lncRNA PAPPA-AS1在A549/DDP和A549/NDP细胞中的表达水平;利用siRNA技术下调铂类耐药人肺癌细胞中PAPPA-AS1的表达,CCK-8实验检测肺腺癌细胞对铂类药物的敏感性;克隆形成实验检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡分布;蛋白质印迹法检测Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白在A549/DDP和A549/NDP细胞中的表达水平。 结果： 与亲代敏感细胞A549相比,lncRNA PAPPA-AS1在A549/DDP和A549/NDP细胞中呈高表达;与对照组比较,si-PAPPA-AS1组的肺腺癌细胞对铂类药物的敏感性增强,细胞增殖活力下降,细胞凋亡率增加（P均<0.05）;与对照组比较,si-PAPPA-AS1组的细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达明显升高,磷酸化PI3K、Akt和mTOR蛋白表达明显降低。结论： 下调PAPPA-AS1可以通过抑制PI3K/Akt信号通路逆转肺腺癌细胞对铂类药物的抵抗性。     

MicroRNA-98对A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨MicroRNA-98（miR-98）对肺腺癌耐顺铂细胞系A549／DDP顺铂耐药性的影响。方法利用MicroRNA（miRNA）芯片及生物信息学筛选出miR-98。将miR-98质粒载体瞬时转染至A549／DDP细胞：M．rr检测细胞药物敏感性的改变。结果在A549／DDP细胞中miR-98表达水平下调。转染miR．98的A549／DDP细胞生长抑制率明显增高。结论miR-98能够增加肺腺癌耐药细胞株A549／DDP对顺铂的药物敏感性。     

RAD18基因敲除增强肺腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的:研究敲除E3泛素连接酶RAD18基因后,人肺腺癌A549细胞株和顺铂耐药A549(A549/DDP)细胞株FA/BRCA途径DNA修复功能的变化及其对顺铂敏感性的改变。方法:合成针对RAD18基因的siRNA(RAD18-siRNA),通过脂质体将其分别转染人A549和A549/DDP细胞株。蛋白质印迹法检测经顺铂处理的两种细胞株转染siRNA前后RAD18蛋白表达及FANCD2单泛素化水平;CCK-8法测定经顺铂处理的两种细胞株转染siRNA前后细胞增殖率的变化;免疫荧光测定胞核内FANCD2核聚小体的形成;Annexin V/PI流式细胞术测定转染前后细胞凋亡率。结果:与转染RAD18-siRNA前相比,转染后经顺铂处理的A549和A549/DDP细胞株RAD18表达均明显降低;FANCD2蛋白单泛素化水平下调和核聚小体形成减少;同时细胞增殖率明显降低,细胞凋亡率则明显增加。结论:应用RNA干扰技术敲除RAD18基因可通过抑制A549和A549/DDP细胞株FA/BRCA途径的DNA损伤修复功能,增加这两种细胞株对顺铂的敏感性。     

注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP耐药逆转作用研究

目的 探讨注射用黄芪多糖药物血清在体外对耐顺铂（DDP）人肺腺癌A549/DDP细胞株的耐药逆转作用。方法 通过建立小鼠肿瘤模型,运用血清药理学方法,以人肺腺癌敏感细胞A549和耐药细胞A549/DDP为研究对象,采用细胞毒实验（MTT）方法,探讨注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP的耐药逆转作用。结果 注射用黄芪多糖药物血清高、中、低剂量组分别与DDP合用时对A549/DDP细胞的耐药逆转倍数分别为1.24、1.41、1.34;且中、高剂量组与阳性对照DDP组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 注射用黄芪多糖能明显增加A549/DDP耐药细胞对DDP的敏感性,提高细胞死亡率,具有耐药逆转作用。     

MT1X siRNA对肺癌A549/DDP细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨金属硫蛋白1X（MT1X）在肺癌耐药细胞株（A549／DDP）顺铂耐药中的作用。方法通过化学合成针对MT1X的siRNA段抑制其在A549／DDP中的表达,实时定量聚合酶链反应（PCR）及WB检测干扰效果,M1Tr及平板克隆形成实验检测干扰前后细胞对顺铂的药物敏感性变化;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果针对MT1X的siRNA片段能在RNA及蛋白水平有效抑制其在A549／DDP中的表达;与对照组相比,MT1X表达被抑制后,肿瘤细胞对顺铂的敏感性明显升高;增殖被抑制,平板克隆形成率明显降低（P〈O．05）,细胞凋亡率显著增高（P〈0．05）。结论针对MT1X的siRNA片段可部分逆转肺癌细胞（A549／DDP）对顺铂的耐受,为提高肺癌的化疗效率提供了一种新方法。     

siRNA沉默FANCD2基因增加肺癌A549/DDP细胞对顺铂化疗的敏感性

目的: 研究siRNA沉默FANCD2基因后人肺腺癌A549/DDP耐药细胞株对顺铂(DDP)耐药性的变化。方法:合成针对FANCD2基因的siRNA(FANCD2 siRNA),采用脂质体将其分别转染肺癌A549细胞株和A549/DDP耐药细胞株。CCK-8法测定经DDP处理的A549和A549/DDP细胞株转染siRNA前后的细胞增殖率变化;免疫印迹法测定2种细胞株转染siRNA前后FANCD2蛋白单泛素化水平;免疫荧光测定胞核中FANCD2蛋白核聚小体的形成。结果：经DDP处理的A549/DDP细胞增殖率,FANCD2蛋白单泛素化水平及核聚小体形成程度明显高于A549细胞。转染FANCD2-siRNA后,A549和A549/DDP细胞的FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体形成明显降低,细胞增殖率显著下降。结论： 应用siRNA转染技术沉默FANCD2基因可抑制FA/BRCA途径的DNA修复功能,从而增加肺癌细胞对DDP的敏感性,部分逆转耐药肺癌细胞株对DDP的耐药性。     

Rh2逆转耐药细胞对顺铂抗性作用的机制

目的 探讨人参单体Rh2逆转肺腺癌耐药A549DDP细胞对顺铂抗性作用的机制.方法 以Rh2单独作用为Rh2组,低效浓度的顺铂单独作用为DDP组,二者联合作用为Rh2+DDP组,不加药物干预为对照组,紫外光分光光度计检测各组细胞的线粒体PTP开放情况,流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度及线粒体跨膜电位的变化及细胞凋亡状况,Western印迹检测细胞色素C及Caspase-3表达;Hoechst33258染色荧光显微镜下观察细胞形态的变化.结果 Rh2组和DDP组细胞内钙离子浓度与对照组的接近,Rh2+DDP组细胞内钙离子浓度升高,与对照组比较,差异有统计学意义(t=22.47,P<0.01).前3组细胞的线粒体吸光度(A540nm)值接近,而Rh2+DDP组A540nm值明显低于对照组(t=8.21,P<0.01).前3组线粒体跨膜电位接近,Rh2+DDP组细胞内线粒体跨膜电位明显低于对照组(X~2=46.01,P<0.01).前3组细胞的胞质中细胞色素C和Caspase-3表达极低,Rh2+DDP组细胞色素C和Caspase-3高表达.荧光显微镜下,前3组细胞核荧光分布均匀;Rh2+DDP组的细胞核数目减少,荧光成团块分布,很多细胞核缩小或变形.前3组凋亡细胞百分率分别为6.32%、7.24%、7.41%,3组间差异无统计学意义,Rh2+DDP组凋亡细胞百分率为21.96%,与对照组差异有统计学意义(t=10.92,P<0.05).结论 无毒浓度的Rh2逆转A549DDP细胞对顺铂的耐药性作用可通过线粒体凋亡通路实现.     

贝伐单抗对荷耐顺铂人肺腺癌A549/DDP裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的 探讨贝伐单抗联合或不联合顺铂对耐顺铂肺腺癌A549/DDP移植瘤生长的抑制作用.方法 建立裸鼠移植瘤模型,随机分成空白对照组(A组)、单药贝伐单抗组(B组)、单药顺铂组(C组)、联合用药组(D组)和联合半剂量组(E组)5组,连续用药4周.观察肿瘤生长情况,计算抑瘤率;免疫组化法检测肿瘤组织微血管密度(MVD);RT-PCR分析各组经治疗后凋亡基因bcl-2及耐药基因(LRP、GST-Π)mRNA表达情况.结果 与空白对照组比较,经贝伐单抗治疗组(B、D、E组)抑瘤率分别为20.96%、51.67%、50.95%,联合用药组(D、E组)效果最佳.经贝伐单抗治疗组微血管密度分别为18.6±1.14、13.6±1.14、14.4±0.55,联合用药组最为显著,而单药顺铂组与对照组在抑瘤率和微血管密度表达上均无差异(P=0.632).经贝伐单抗治疗组bcl-2 mRNA表达较对照组有显著差异(P＜0.001),但三组之间无差异(P＞0.05);五组之间在LRP、GST-Π mRNA表达上无明显差异(P＞0.05).结论 贝伐单抗对荷A549/DDP裸鼠移植瘤有抑制作用,联合顺铂用药有显著协同作用,同时提高A549/DDP耐药细胞对顺铂的敏感性,其作用机制可能与抑制肿瘤微血管形成、诱导细胞凋亡增加有关.