大鼠坐骨神经损伤后ATP对背根节神经元兴奋性的影响

目的　应用膜片钳全细胞记录技术 ,探讨ATP对坐骨神经损伤所引起的背根节神经元兴奋性的影响。方法　Wistar大鼠分为对照组和损伤组 ,损伤组建立大鼠坐骨神经离断模型 ,采用酶加机械分离方法急性分离背根节神经元 ,应用膜片钳全细胞记录技术测定神经元被动膜电特性 ,观察坐骨神经损伤后背根节神经元兴奋性的变化及ATP对其作用的影响。结果　与对照组比较 ,坐骨神经损伤后 1、10、10 0 μmol LATP引起神经元产生动作电位的去极化反应上升幅度比率分别为 45 8%、187%、75 %(P <0 0 1)。结论　坐骨神经损伤后背根节神经元兴奋性提高 ,ATP受体对ATP反应敏感性增强     

糖尿病神经痛中大鼠背根神经节细胞电生理特性的改变

目的通过观察背根神经节细胞的动作电位特征在糖尿病大鼠周围神经病变中的变化,以探讨糖尿病大鼠周围神经病变引起痛觉过敏的发生机制。方法运用全细胞电流钳技术对糖尿病周围神经痛觉过敏大鼠背根神经节细胞进行电生理记录,与正常大鼠比较静息电位水平、动作电位峰值、动作电时程变化、基强度、动作电位爆发阈值。结果与正常组比较,糖尿病神经痛大鼠背根神经节细胞静息电位水平和动作电位峰值无显著差异;大、中、小直径神经元动作电位与正常大鼠比较爆发阈值下降,动作电时程变宽,基强度显著降低。结论糖尿病大鼠周围神经病变引起初级感觉神经元背根神经节细胞的兴奋性增强,这可能是引起糖尿病大鼠周围神经痛觉过敏原因之一。     

一种适合膜片钳试验的新生大鼠背根神经节细胞的培养方法

目的建立一种适合膜片钳实验的大鼠乳鼠背根神经节细胞的培养方法。方法在显微镜及显微外科手术器械的辅助下,分离并培养新生大鼠的背根神经元（Dorsal Root Ganglion,DRG）,观察培养细胞的形态,膜片钳记录细胞静息电位水平。结果 DRG神经元细胞形态结构完整,静息电位水平正常,可记录到动作电位及钠电流。结论培养的新生大鼠DRG细胞适合膜片钳试验。     

一氧化氮对体外培养脊髓及背根神经节细胞的作用

研究一氧氧化氮对体外培养脊髓及背根神经节细胞的作用。     

摘取鸡胚背根神经节的方法

近几年来，在神经生物学领域中有愈来愈多的实验结果证实：脊椎动物神经系统中的某些细胞在个体发生的过程中经历过自然死亡阶段。神经营养因子（neurotrophlcfactors）可维持和促进这些细胞的生存、生长和分化，在损伤情况下促进其再全”。为深入研究神经营养因子的作用，必须对神经营养因子进行活性鉴定。要解决好这个问题，首要的就是如何摘取和收集背根神经节。这一问题迄今在国内有关文献报道中很少涉及。我们在参考国外有关文献的p’基础上，在实践中探索，比较顺利地解决了这一问题。现以摘取鸡胚背根神经节为例介绍如下。回材料与方…     

胚胎大鼠背根神经节神经元的原代培养

目的 原代培养胚胎大鼠背根神经节神经元(DRGn),并观察其生长特性。方法 取E15 SD胎鼠的背根神经节,用胰蛋白酶消化法分离成单细胞,通过密度梯度离心法和差速贴壁法进行分离纯化,在无血清培养基中培养,用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体鉴定神经元。结果 纯化培养神经元生长状态良好,纯度可达93%左右。结论 该方法具有较好的可操作性和可重复性,用于DRGn的相关实验研究。     

神经生长因子及抑制因子对鸡胚背根神经节轴突生长的影响

研究神经生长因子和神经生长抑制因子鸡胚背根神经节轴突生长的影响。方法分离培养鸡胚ＤＲＧ,加入ＮＧＦ、ＮＧＩ并观察它们对轴突生长的影响。结果ＤＲＧ轴突在含ＮＧＦ的培养液中迅速生长,加入ＮＧＩ后这种生长被抑制。结论ＮＧＦ可促进ＤＲＧ轴突的生长,而ＮＧＩ抑制它的生长。     

一种适合膜片钳记录的成年大鼠背根神经节细胞培养方法

目的建立一种适合膜片钳研究的成年大鼠背根神经节（D0rsal root ganglion,DRG）细胞培养方法。方法分离并培养成年大鼠DRG神经元,显微镜下观察培养神经元的形态,膜片钳技术记录培养神经元的基本膜电生理特性及ATP激活电流。结果培养的DRG神经元形态结构完整;其静息膜电位在正常范围内,可记录到诱发动作电位及钠电流;在膜片钳全细胞记录模式下,能稳定地记录到ATP诱发电流。结论培养的成年大鼠DRG神经元适合膜片钳试验。     

背根神经节摘取方法的研究

目的 探讨有效摘取新生大鼠背根神经节(DRG)的方法,为实验取材奠定基础.方法 新生第1天Wistar大鼠,分别采取单独摘取和连同脊髓同时摘取的方法提取DRG神经元,比较两种取材方法获取DRG所需的时间和摘取数量.结果 用单独摘取的方式获得的DRG神经元数量为(27±1.15)个.耗时(26.85±1.11)min,连同脊髓同时提取的方式获取的DRG神经元数量为(21.29±1.38)个,耗时(19.64±10.3)min,两者比较有显著差异(P《0.01).两种方法获得的神经元均可以用于细胞培养.结论 采用上述两种方法均可以成功获取背根神经节,可以根据不同的实验目的 ,选择合适有效的获取方法.     

近红外线对背根神经节细胞突起生长的影响

目的 离体条件下观察近红外线照射对新生大鼠背根神经节细胞突起生长的影响.方法 分离并在体外原代培养新生大鼠背根神经节细胞,用近红外线分别照射0、5、10、15、20 min后继续培养48 h,MTT法检测背根神经节细胞的活性,用微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP-2)行免疫荧光化学染色,检测近红外线照射后,胞体及突起的生长情况.结果 MTT检测:与0 min组相比,5 min组,10 min组,15 min组细胞活力无明显改变(P＞0.05),但20 min组细胞活力较0 min组明显降低(P＜0.05).近红外线照射后继续培养48 h,0、5、10、15 min组细胞生长旺盛,神经元新生的突起数量增多,增长,以15 min组最为明显.在15 min组,部分新生的突起间彼此连接,形成网络.结论 在体外条件下,近红外线照射具有促进背根神经节细胞突起生长的作用.     

三磷酸腺苷引起大鼠三叉神经节胞内钙离子信号转导机制的研究

目的探讨三磷酸腺苷(ATP)对三叉神经痛大鼠感觉神经元内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响及其信号转导机制。方法 SD大鼠眶下神经缩窄造成三叉神经痛模型,造模后1周处死大鼠,取出三叉神经节(TG),分离出完整的小直径神经元(﹤600μm2)用于钙离子成像,通过使用荧光染料来标记相关激动剂,检测毒胡萝卜内酯(Tg,1μmol/L)、咖啡因(Caff,20 mmol/L)和ATP(100μmol/L)作用下TG小直径神经元内[Ca2+]i变化。结果①在正常外液和无钙外液中,在大鼠TG小直径神经元上分别给予Tg、Caff和ATP均能够引起[Ca2+]i不同程度升高;②在无钙外液中,ATP引起的TG神经元[Ca2+]i升高可被Tg可逆性地抑制(n=8,P<0.01);③在无钙外液中,ATP引起的TG神经元[Ca2+]i升高可被P2受体阻断剂苏拉明(suramin,100μmol/L)明显抑制;④在正常外液中,Tg引起TG神经元[Ca2+]i升高,当升高达到最大后再次给予ATP,仍然能引起[Ca2+]i进一步升高。结论在大鼠TG神经元中同时存在IP3敏感钙库和ryanodine敏感钙库。ATP可通过两种途径引起细胞内[Ca2+]i升高,一种途径是激动P2Y受体引起IP3敏感钙库的Ca2+释放,另一种途径是激动P2X受体引起细胞外Ca2+内流。在无钙外液中,ATP引起的TG神经元[Ca2+]i升高是通过IP3敏感钙库释放引起的。     

芍药苷对大鼠背根神经元细胞内Ca2+的影响

摘要：目的：建立一种评价中药活性成分对大鼠背根神经节(DRG)神经元细胞内游离Ca2 浓度影响的方法。方法：显微解剖获取大鼠背根神经节,通过胰蛋白酶消化,过筛,用DF-12和抗有丝分裂培养液交替培养纯化,获得原代大鼠DRG神经元细胞,并采用细胞免疫荧光技术测定DRG神经元细胞纯度;采用激光共聚焦显微成像技术（LSCM）,观察细胞内Ca2 荧光强度的变化,并对Ca2 荧光强度变化率进行分析,探讨芍药苷对DRG细胞内游离钙离子浓度及辣椒素受体的影响。结果：采用上述方法分离得到的DRG细胞纯度可高达95%以上,辣椒平可通过阻断辣椒素激活的瞬时受体电位通道（TRPV1）的作用而抑制细胞内Ca2 的增加。芍药苷表现出与CAP类似的作用,可以阻断细胞外Ca2 内流。结论：芍药苷可能是通过作用于TRPV1通道,而抑制DRG细胞内Ca2 大量增加,本方法可以用于评价药物对大鼠DRG细胞内Ca2 浓度的影响。     

辣椒素对背根神经节神经元钙离子浓度和线粒体膜电位的影响

目的探讨辣椒素对体外原代培养的胎鼠背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）神经元钙离子浓度（［Ca²⁺］_i）和线粒体膜电位（mitochondiral membrane potential,MMP）的影响作用。方法分散培养的胎鼠DRG神经元用不同浓度的辣椒素（0.001μmol/L, 0.01μmol/L, 0.1μmol/L, 1μmol/L, 10μmol/L）孵育1min,用共聚焦激光扫描显微镜检测神经元［［Ca²⁺］_i的改变。对于能引起［Ca²⁺］_i升高的浓度组,在辣椒素孵育1min时,用流式细胞术检测神经元MMP的变化;并且在移去辣椒素后10min,重新检测神经元［Ca²⁺］_i的变化。结果0.001μmol/L、0.01μmol/L辣椒素孵育1min,神经元胞内［［Ca²⁺］_i没有变化;0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L辣椒素孵育1min,神经元胞内［Ca²⁺］_i升高,移去辣椒素后10min,0.1μmol/L、1μmol/L辣椒素孵育的DRG神经元胞内［Ca²⁺］_i恢复到基础水平,10μmol/L辣椒素孵育的标本升高的［Ca²⁺］_i没有明显改变。辣椒素孵育时用无钙溶液,则神经元胞内［Ca²⁺］_i不升高。10?μmol/L辣椒素孵育1min的DRG神经元MMP降低,0.1μmol/L和1μmol/L辣椒素孵育的标本MMP无明显变化。结论一定浓度的辣椒素可使原代培养的DRG神经元胞内［Ca²⁺］_i升高,MMP降低。低浓度辣椒素引起的［Ca²⁺］_i的升高在10min内可以恢复到基础水平,而高浓度辣椒素引起的［Ca²⁺］_i的升高在10min内则不能恢复。辣椒素所致的胞内［Ca²⁺］_i升高可能是由于胞外钙离子内流引起的。     

背根节初级感觉神经元的温度敏感性

目的:观察大鼠背根节 (DRG) 中型神经元的温度敏感性. 方法:在新鲜分散的大鼠背根节中型神经元运用全细胞膜片钳技术,观察给予不同温度梯度刺激下引起细胞放电的特征. 结果:根据大鼠背根节中型神经元在不同温度梯度刺激下的放电特征可将它们区分为两类温度敏感神经元. Ⅰ类神经元的温度敏感性与冷温度变化密切相关,随着温度的升高而引发的逐渐增强的膜电位超级化可引发频率由高到低的动作电位. 随着温度的降低神经元又表现出频率由低到高的动作电位变化. 动作电位的幅值一致,符合"全或无"定律. 该类神经元具有电压依赖性. Ⅱ类神经元的兴奋性与温度变化的关系不明显,随着温度升高或降低,神经元只出现一个动作电位,其频率没有变化,仅仅表现在随温度升高,动作电位的幅值降低,温度降低后,其幅值又恢复. 结论:大鼠DRG两类神经元在温度变化一致的情况下各具不同的冷温度敏感性.     

低频刺激抑制GABA介导背根神经节神经元膜去极化反应

目的:探讨低频率电刺激对GABA介导的背根神经节神经元膜电位去极化反应的影响.方法:新鲜分离的大鼠DRG坐骨神经干标本,通过细胞内微电极记录技术,应用波宽5 ms,强度2 V,频率分别为2 Hz和10 Hz的脉冲波作用于大鼠坐骨神经远端,观察刺激前后GABA(3×10-4mol/L)介导的DRG神经元膜电位去极化反应幅值的变化.结果:低频电刺激(2 Hz、10 Hz)对GABA介导的DRG神经元膜电位去极化反应均有抑制作用,10 Hz时抑制作用达到最大,反应幅值从17.00±3.39mV降至12.00±2.45mV(P<0.05).刺激频率增加,电刺激对GABA介导DRG神经元膜去极化反应抑制作用持续时间也逐渐延长,10 Hz时作用持续时间达到最长(>72 min).结论:电刺激可抑制DRG神经元膜GABA去极化反应,从而易化伤害性信息的传入,导致疼痛.     

加巴喷丁对SNL模型大鼠损伤DRG神经元细胞内[Ca2+]i的影响

目的:探讨加巴喷丁对脊神经结扎(SNL)模型大鼠损伤背根神经节神经元胞内游离钙浓度的影响?方法:SD大鼠,雄性35只,4~6周龄,采用左侧L5 SNL术制备大鼠神经病理性疼痛模型?于结扎后15 d采用酶消化法急性分离损伤同侧L5背根神经节神经元(SNL组)和假手术组L5背根神经节神经元(Sham组)?采用流式细胞仪检测10?100和300 μmol/L浓度加巴喷丁对损伤侧L5背根神经节神经元基础及高K+激发胞内游离钙浓度的影响?结果:加巴喷丁剂量依赖性地抑制高钾激发的胞内游离钙浓度的增加(P < 0.05或P < 0.01),但对静息钙无作用?结论:加巴喷丁对神经病理性疼痛大鼠损伤背根神经节神经元高钾激发的钙内流的抑制作用,可能与其抗伤害作用的外周机制相关?     

大鼠背根神经节神经元P2Y嘌呤受体的表达

目的探讨P2Y1和P2Y4亚基在大鼠背根神经节(DRG)神经元的表达.方法应用组织水平和多细胞水平RT-PCR方法从不同角度检测了P2Y1受体的表达情况.结果两种RT-PCR扩增结果均显示:P2Y1亚型有特异性表达阳性条带出现,而P2Y4亚型则无特异性表达条带出现.结论大鼠DRG的大、中、小细胞中均有P2Y1亚型表达,而无P2Y4亚型的表达.     

PKA参与ATP对大鼠背根神经节神经元电压门控性钙通道的抑制

目的 探讨ATP对大鼠背根神经节(DRG)神经元的电压门控性钙通道(VGCC)的抑制效应及其信号转导途径.方法 在急性分离的大鼠DRG神经元上应用全细胞膜片钳技术记录ATP诱导的电流以及VGCC电流;应用钙离子成像技术检测胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化.结果 ATP能够可逆性地抑制DRG神经元的VGCC电流和VGCC介导的[Ca2+]i升高.用PKA抑制剂H-89预处理DRG神经元,ATP对VGCC电流及其介导的[Ca2+]i升高的抑制被反转;而用PKC抑制剂bisindolylmaleimide(Bis)预处理DRG神经元,ATP对VGCC介导的[Ca2+]i升高的抑制效应则无影响.结论 在大鼠DRG神经元中,PKA参与了ATP对该神经元VGCC的抑制.     

加巴喷丁对大鼠背根神经节神经元高电压激活钙电流的影响

目的 探讨加巴喷丁对正常大鼠与神经病理性痛大鼠不同损伤部位的背根神经节神经元高电压激活(HVA)钙电流的影响及其原因.方法 雄性SD大鼠,周龄4～6周,采用左侧L5脊神经结扎(SNL)术制备大鼠神经病理性痛模型.于结扎后第14天时采用酶消化法急性分离结扎侧L4背根神经节神经元(SNL-L4组)、L5背根神经节神经元(SNL-L5组),另取正常大鼠L4,5背根神经节神经元作为对照组.采用全细胞膜片钳技术记录加巴喷丁对3组神经元HVA钙电流的作用.结果 在10、100、300 μmol/L浓度下,加巴喷丁对SNL-L5组峰值钙电流的抑制率[(18.5±1.7)%、(32.0±2.6)%、(32.7±2.8)%]高于SNL-L4组[(16.0±1.9)%、(26.9±2.0)%、(27.4±2.3)%]和对照组(均P<0.05).加巴喷丁作用后,SNL-L5组钙通道稳态失活曲线向超级化方向移动幅度较其他两组明显.与其他两组比较,SNL-L5组加巴喷丁敏感性钙电流中N型钙电流比例升高(均P<0.05).结论 加巴喷丁对神经病理性痛大鼠L5背根神经节神经元HVA钙电流的抑制作用增强,其可能与神经损伤后钙通道激活特性的改变以及N型钙电流比例的升高有关.

Abstract：

Objective To compare the effects of gabapentin on high-voltage-activated calcium (HVA) current in dorsal root ganglion (DRG) neurons in normal and nerve-injured rats and understand the reasons of their differences. Methods Pathogen-free male SD rats(weight 180-220 mg)aged 4-6 weeks were used. The animals were anesthetized with intraperitoneal pentobarbital sodium 50 mg/kg. L5 spinal nerve was ligated between DRG and sciatic nerve and cut distal to the ligature. The animals were decapitated at Day 14 post-operation. L5 (SNL-L5 group) and L4 DRGs (SNL-L4 group) were respectively isolated and the ganglionic neurons enzymatically dissociated. The control group of rats was not operated. The lumbar DRG neurons of normal rats were treated similarly. The HVA-Ca2+ current was recorded by the technique of whole cell patch clamp. Results Compared with the SNL-L4 group [(16.0±1.9)%, (26.9±2.0)%, (27.4±2.3)%] and the control group, gabapentin inhibited the peak calcium current highlier at 10, 100 and 300 μmol/L in the SNL-L5 group [(18.5±1.7)%, (32.0±2.6)%, (32.7±2.8)%] (P<0.05). The steady-state inactivation curves shifted to more hyperpolarized potentials in the SNL-L5 group. The N-type relative contribution to the gabapentin-sensitive HVA-Ca2+ current was markedly elevated in the SNL-L5 group compared with that in other two groups (P<0.05). Conclusion Gabapentin enhances the inhibition of HVA-Ca2+ current in injured DRG neurons following spinal nerve ligation in rats. The alteration in the activation of electrophysiological properties and the increase of N-type relative contribution to the total HVA-Ca2+ current may be involved in the mechanism.     

地昔帕明对大鼠背根神经节神经元钠电流的影响

目的:研究地昔帕明(desipramine,DMI)对大鼠背根神经节神经元电压依赖性钠电流的影响。方法:分离单个大鼠背根神经节,应用全细胞膜片钳技术观察地昔帕明对内向钠电流(INa)的影响。结果:地昔帕明浓度依赖性地抑制INa,即分别加入10,50,100μmol/L的DMI可使钠电流的抑制率达(5.56±0.62)%,(54.67±13.39)%和(86.63±16.08)%,并且,50μmol/L的DMI可使INa稳态失活曲线左移,V1/2分别由对照组的-(43.71±0.79)mV降低至-(47.91±1.14)mV,k值无明显变化。结论:DMI浓度依赖性地抑制背根神经节神经元Na+通道,并改变通道的失活,这可能是其影响痛觉传导通路,产生镇痛作用的机制之一。