肺表面活性物质相关蛋白C原核表达载体的构建、表达及纯化

背景:研究表明肺表面活性物质蛋白基因缺陷导致肺表面活性物质蛋白的结构发生变化。早期检测肺表面活性物质的含量对于预测肺部疾病的发生意义重大。目的:克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(surfactant associated protein C,SP-C)基因,构建原核表达载体PET-28a/SP-C,并纯化SP-C蛋白。方法:提取正常人肺组织总RNA,RT-PCR技术获得SP-C cDNA序列,纯化后的SP-C基因插入至中间载体PMD-18T,得到重组质粒PMD-18T-SP-C,重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的SP-C cDNA,将质粒PET-28a同样经过双酶切后纯化回收得到与SP-C cDNA具有相同黏性末端的质粒片段,将具有黏性末端的SP-C cDNA与PET-28a定向连接后得到重组质粒PET-28a/SP-C。然后将鉴定正确的PET-28a/SP-C重组质粒转入BL21中诱导表达。结果与结论:酶切鉴定及核苷酸序列测序证实扩增的SP-C cDNA及其重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,在5000～7500bp和250～1000bp处可检测到2条条带。核苷酸序列测序结果证实,质粒中插入基因长597bp,为一开放阅读框架,与GeneBank中公布的人SP-C cDNA序列相符。Western-blot检测结果显示,纯化后的SP-C蛋白在相对分子质量约27000处出现1条新生条带,与预期的大小一致。结果证实,实验成功克隆人SP-C基因并插入至质粒PET-28a中,构建了PET-28a/SP-C重组质粒,将其体外转化至BL21后可以表达SP-C蛋白。     

人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达

目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达。方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况。结果:RT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGNcDNA全长897bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株。激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达。     

S100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达

目的 克隆S100A4 cDNA,构建pcDNA3.1-S100A4重组表达载体,转染胃癌细胞系MKN1,观察S100A4在胃癌细胞中的表达情况。方法 Trizol法提取人胃上皮细胞GES-1的总RNA,逆转录反应获得含S100A4基因的cDNA。聚合酶链反应GenBank获得S100A4基因序列,并设计引物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出分子量为327 bp的产物。构建pMD18-T simple-S100A4重组质粒,转化JM109菌。菌液测序成功后,提取质粒,进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切,酶切产物回收纯化,连接表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-S100A4真核表达载体。利用脂质体介导转染方法将纯化的表达载体转染到胃癌细胞系MKN1中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后MKN1细胞中S100A4 mRNA表达水平。结果 PCR产物连接克隆载体的测序结果与GenBank公布的无突变序列一致,HindⅢ/BamHⅠ双酶切可以成功构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4;在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcD...     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

人紧密连接蛋白claudin-6真核表达载体的构建

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因全长序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结论获得了人claudin-6基因的全长cDNA片段,构建了claudin-6原核克隆载体和真核表达载体。实验中发现,中国人claudin-6基因的461位点碱基为A,而GeneBank中西班牙人claudin-6基因的461位点碱基为G,说明claudin-6基因461位点可能存在多态性。     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

锌指转录因子snai1高表达质粒构建和稳定株的筛选

背景:研究表明Snai1和E-钙黏素在肿瘤组织中有负向表达关系,且与Snai1与CDH1启动子区box盒结合,抑制CDH1基因转录.目的:构建针对snai1的高表达载体,建立稳定转染的细胞株.方法:根据GenBank中snai1的基因序列人工合成snai1全序列,将合成好的序列装入Pmd-18T载体并转化感受态细胞DH5α,进行阳性克隆筛选.测序验证重组克隆中基因序列正确后,用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切Pmd-18T/snai1质粒,将所得的snai1全基因片段转入pcDNA3.1(+)空质粒,构建pcDNA(+)/snai1真核表达质粒,同时构建阴性对照质粒,并分别对结肠腺癌细胞HT-29进行转染,最后利用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT-PCR和Western bl0t鉴定宿主细胞内snai1基因的表达情况.结果与结论:成功构建了真核表达质粒pcDNA(+),snai1,顺利转染结肠癌细胞HT-29后于600 mg/L G418浓度时筛选21 d得到snai1基因稳定表达株,构建的snai1基因正义表达质粒pCDNA3.1(+)/snai1转染宿主细胞后可促进snai1基因的表达.     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景:阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于(-淀粉样多肽的异常.目的:构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达.结果与结论:人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株.     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

有利于创伤修复愈合的人血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的真核表达质粒pcDNA3-VEGF.方法采用PCR技术和DNA重组技术,将编码人VEGF的cDNA序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)上,挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.结果从HepG2细胞中克隆出VEGF121基因的cDNA片段,该序列由Kozak序列,翻译起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.DNA测序表明,VEGF121基因的cDNA序列正向插入到pcDNA3.1(+)的多克隆位点上.结论本研究获得了VEGF121基因的真核达质粒pcDNA3-VEGF,为进一步研究VEGF的转基因治疗奠定基础.     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。     

MYCT-1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MYCT-1(myc target)基因真核表达载体,观察其转染胃粘膜GES-1细胞系后的表达。方法用RT-PCR法合成MYCT-1 cDNA,克隆至表达载体pcDNA3.1上,测序验证无突变发生。将表达载体转染GES-1细胞,用RT-PCR和Western blot检测MYCT-1基因的表达。结果限制性内切酶酶切和DNA测序证实成功克隆了MYCT-1 cD-NA全长并正确插入了表达载体,在GES-1细胞中检测到MYCT-1 mRNA和蛋白。结论成功构建了MYCT-1真核表达载体,可在GES-1细胞中稳定表达。     

人TLR4胞外段真核表达质粒的构建及其在HEK293 细胞中的表达

目的 构建人Toll—like receptor 4（TLR4）胞外段真核表达质粒并观察其表达。方法 通过PCR扩增人TLR4胞外段基因，将其克隆入真核表达质粒pcDNA3．1（＋），重组质粒peDNA3．1（＋）-eTLR4转染入人胚肾293细胞（HEK293 细胞）中，RT-PCR检测TLR4胞外段的表达。结果 测序结果表明，成功构建人TLR4胞外段真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-eTLR4，并在HEK293细胞中获得表达。结论 TLR4胞外段能在HEK293细胞中获得正确表达，为TLR4信号通路的进一步研究打下了基础。     

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体，并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PcR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2／ E cDNA，与真核表达载体pcDNA3．1( )重组，构建成HLA—E真核表达载体pcDNA3．1( )／A2E，然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测，以观察HLA—E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示，HLA-E分子在经pcDNA3．1( )／A2E转染的靶细胞表面获得表达(27．76％)，而经空载体pcDNA3．1( )转染的靶细胞则未获得表达。结论：成功构建了pcDNA3．1( )／A2E真核表达载体，并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达，为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。     

反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的　构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF- 7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性。方法　应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF -7,观察转染前后MCF 7的VEGF165表达及细胞生长周期。结果　成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF -7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低。结论　VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF- 7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索。     

LIF真核表达载体的构建及其在MSCs中的稳定表达

目的在人骨髓间充质干细胞内大量稳定的表达人白血病抑制因子（human Leukemia Inhibitory Factor,hLIF）。方法应用RT-PCR方法从人蜕膜组织中扩增出白血病抑制因子,并将其构建于pcDNA3．1真核表达载体上。利用脂质体进行基因骨髓间充质干细胞的转染。利用G418进行基因的稳定表达筛选。通过RT-PCR和Westernblot方法进行基因表达的检测。结果成功扩增出人白血病抑制因子基因,成功构建hLIF-pcDNA3．1真核表达载体。转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞经G418筛选,存活十代以上。经RT-PCR及Westernblot方法检测发现转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞表达白血病抑制因子明显高于未转染的骨髓间充质干细胞。结论成功构建LIF-pcDNA3．1的真核表达载体并使其在骨髓间充质干细胞得到稳定表达。