人血小板源性生长因子A基因发夹结构小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：血小板源性生长因子对诱发视网膜色素上皮细胞移行、最终导致增生性玻璃体视网膜病变起到了重要作用。构建人血小板源性生长因子A具有发夹结构小干扰RNA（shRNA）表达质粒，以观察其对人血小板源性生长因子A基因表达的沉默效果。 方法：实验于2007—04／2007—07在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成。根据血小板源性生长因子A基因mRNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列，克隆到空载体pGPU6／GFP／Neo中，构建重组质粒，同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。 结果：经重组质粒筛选，重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同，均证实重组质粒构建成功。 结论：利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向人血小板源性生长因子A的发夹结构小干扰RNA表达载体。     

MMP-26基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建基质金属蛋白酶-26（MMP-26）小干扰RNA（siRNA）表达质粒,以研究其对人肿瘤细胞MMP-26基因表达的沉默效果,探索肿瘤基因治疗的新途径.方法 根据MMP-26基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pSUPERIOR.puro中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对GFP和β-actin的干扰质粒作为阴性对照和阳性对照,并进行酶切鉴定和测序分析.结果 酶切及测序证实重组质粒构建成功.结论 利用RNA干扰（RNAi）技术可成功构建siRNA表达载体.     

靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体的构建

目的:利用pGenesil-1质粒构建靶向survivin基因的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体。方法:设计2对shRNA,GC比在40%～55%之间,进而应用BLAST软件进行同源性剔除,保证所得shRNA序列靶向survivin基因,分别克隆至带有U6启动子的质粒pGenesil-1中,构建质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。双酶切重组质粒进行酶切鉴定。结果:成功构建靶向survivin基因的2个shRNA质粒表达载体,经双酶切鉴定及质粒测序结果完全符合设计要求。结论:经鉴定设计的2条shRNA已成功连接于质粒上,可以应用于进一步RNA干扰试验。     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建靶向survivin的siRNA表达载体。方法 设计合成靶向Survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6．1／Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-sur-vivin。脂质体法将pRNAT-U6．1／Neo-survivin导入膀胱癌T24细胞株,实时定量PCR法检测对T24细胞survivin基因表达的抑制情况。结果 PCR、酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰T24细胞survivin基因的表达,并具有新霉素抗性。能够用G-418筛选稳定转化的细胞株。结论 成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pR-NAT-U6．1／Neo-survivin。并转染膀胱癌细胞株,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

靶向人血管紧张素原小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景:RNA干扰技术通过将具有一定结构特点、长19～25 bp的双链小干扰RNA导入哺乳动物细胞,特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子,导致目的基因表达抑制.目的:拟构建针对人血管紧张素原mRNA的小干扰RNA表达载体,从而抑制肾素基因在脂肪细胞的表达.方法:从NCBI中查找人血管紧张素原基因全长mRNA序列(NM000029),利用GeneScript公司提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,自行设计靶向血管紧张素原的两条shRNA的DNA模板单链,合成靶向血管紧张素原基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的psiRNAT-U6.1/Neo质粒连接,在TOP10菌株中扩增,并测序鉴定.结果与结论:将含有血管紧张素原-mRNA目标序列19 bp的双链DNA插入片段,连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒形成重组质粒.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,空载体得到351 bp小片段,而人重组质粒得到397 bp小片段,与预期相符.EcoRI和Kpv Ⅰ双酶切后,空载体得到1条345 bp小片段,而人重组载体没有得到小片段条带,与预期相符.测序结果表明psiRNAT-U6.1/Neo质粒已经插入人脂肪细胞的干扰合成片段,无碱基突变,成功构建了靶向血管紧张素原-小干扰RNA表达载体.     

mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定

目的构建mTORsiRNA重组表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础．方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6／GFP／Neo中构建重组表达载体,转化DH5c~菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染人巨噬细胞RAW264．7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Westernblot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTORsiRNA重组表达载体。Westernblot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约4l％。结论mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选,该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。     

大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景：长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta阿片受体密度上调有关。目的：设计及构建大鼠delta阿片受体短发卡RNA真核表达载体并鉴定。方法：根据大鼠delta阿片受体mRNA序列设计并体外合成短发卡RNA寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定。结果与结论：酶切证明delta阿片受体-短发卡RNA已经插入到质粒载体pGenesil-1里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta阿片受体基因的短发卡RNA真核表达载体构建成功。     

大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景:长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta 阿片受体密度上调有关.目的:设计及构建大鼠delta 阿片受体短发卡RNA 真核表达载体并鉴定.方法:根据大鼠delta 阿片受体mRNA 序列设计并体外合成短发卡RNA 寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定.结果与结论:酶切证明delta 阿片受体-短发卡RNA 已经插入到质粒载体pGenesil-1 里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta 阿片受体基因的短发卡RNA 真核表达载体构建成功.     

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的 利用PCR 产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3 质粒为模板,PCR 扩增VP3 基因的366 bp 片段,应用靶向克隆酶,将VP3 基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳可见366 bp 特征性的VP3 片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440 bp 的特征性PEP-1-VP3 片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA 编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank 中VP3 cDNA 序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3 基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3 融合蛋白奠定基础.     

靶向STAT5的RNAi重组质粒的构建与鉴定

摘要:目的：构建靶向信号转导及转录激活因子5（STAT5）的RNAi重组质粒并进行鉴定。 方法：设计针对STAT5编码区的有短发夹结构的3对DNA序列,克隆到质粒载体Pgenesil-1中构建重组质粒,再对其进行酶切鉴定、DNA 测序分析。脂质体法转染重组质粒至SMMC7721细胞株中,westernblot、RT-PCR检测STAT5基因表达。 结果：酶切鉴定和测序分析提示,靶向STAT5的RNAi重组质粒构建成功,3条靶向STAT5的序列特异性小发夹状RNA（shRNA）可有效抑制SMMC7721细胞STAT5表达,mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,蛋白质表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%(P<0.05)。其中以Pgenesil-1-STAT5A1抑制效应最强。 结论：成功构建靶向STAT5的RNAi重组质粒,为进一步用该重组干扰载体进行体内肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。     

抑制骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达的有效序列

背景:雌激素受体β是否参与介导骨髓间充质干细胞的增殖与分化需进一步实验论证。目的:以RNAi技术寻找和验证对大鼠骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达抑制的有效序列。方法:根据GeneBank数据库提供的SD大鼠雌激素受体β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列。再在两条互补碱基序列的5’端分别加上BamHⅠ(GATCC)和HindⅢ(AGCTT)酶的酶切位点,最后形成两条互补的克隆入pSilencer3.1-H1载体的发夹状siRNA模板序列,进行重组载体的碱基序列测定。结果与结论:重组质粒碱基序列鉴定后,证实真核表达载构建正确。雌激素受体β特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

抑制骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达的有效序列

背景：雌激素受体β是否参与介导骨髓间充质干细胞的增殖与分化需进一步实验论证。目的：以RNAi技术寻找和验证对大鼠骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达抑制的有效序列。方法：根据GeneBank数据库提供的SD大鼠雌激素受体β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA（Small hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列。再在两条互补碱基序列的5＇端分别加上BamHⅠ（GATCC）和HindⅢ（AGCTT）酶的酶切位点,最后形成两条互补的克隆入pSilencer3.1-H1载体的发夹状siRNA模板序列,进行重组载体的碱基序列测定。结果与结论：重组质粒碱基序列鉴定后,证实真核表达载构建正确。雌激素受体β特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

脊髓源星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白表达抑制最佳短发夹样RNA分子筛选及真核表达载体构建

背景:哺乳动物脊髓损伤后胶质瘢痕形成是神经再生的物理和化学屏障,减轻或延缓胶质瘢痕形成给损伤脊髓再生创造了有利条件。目的:设计筛选并构建大鼠胶质原纤维酸性蛋白短发夹样RNA真核表达载体。设计:观察性动物实验。单位:南方医科大学附属深圳医院脊柱外科。材料:选用Wistar大鼠25只,雌雄不拘,清洁级,体质量20～25g。DMEM/F12、lipofectamine2000、Trizol RNA分离试剂盒;胎牛血清(Hyclone);BamHⅠ、HindⅢ、PstI、SalI、T4连接酶;质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒;第一链cDNA合成试剂盒;兔抗鼠GFAP一抗。方法:实验于2005-10/2006-06在南方医科大学附属深圳医院完成。针对GFAP基因全编码序列设计并合成3对9bp茎环结构19bp干扰序列特异性shRNA模板,体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体;通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型,脂质体介导RNA干扰分子转染,由实时荧光定量RT-PCR及western blot技术,观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果,筛选最佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体。主要观察指标:①序列特异性干扰shRNA模板合成;②构建特异性重组质粒真核表达载体;③体外大鼠脊髓源星形胶质细胞培养;④实时荧光定量RT-PCR;⑤RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果。结果:序列测定证实GFAP-shRNA重组质粒真核表达载体构建成功,通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术筛选出最佳GFAP-shRNA效应表达载体,在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81%、63%、56%。结论:构建并筛选成功的GFAP-shRNA效应真核表达载体,在大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP-基因表达,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗研究策略的应用奠定前期基础。     

平滑肌细胞纯化载体构建及在小鼠胚胎干细胞中的表达

背景:胚胎干细胞是平滑肌细胞重要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞.目的:为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟在体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉素抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性.设计、时间及地点:基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.材料:小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011~(TM).pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、pSuper.basic载体购自Invitrogen公司.方法:用聚合酶链反应方法从pSM22α-EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP.再从pSM2C中用HindⅢ/Cla Ⅰ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到pSuper.basic中,构建pSuper-PAC.最后BgⅢ/Acc Ⅰ双酶切pSuper-PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α-IRES2-EGFP,构建成pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆.诱导胚胎干细胞阳性克隆分化,RT-PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆.对分化细胞行平滑肌细胞标志物SMα-actin免疫荧光染色.主要观察指标:①pSM22α-PAC-IRES2-EGFP测序结果.②pac基因扩增.③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SMα-actin染色情况.结果:HindⅢ/Cla Ⅰ双酶切得到261 bp,664 bp,5 000 bp 3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α-PAC-IRES2-EGFP构建成功.Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功.转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SMα-actin染色呈阳性.结论:实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.成功转染这一载体的胚胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性.     

人乳头瘤病毒18型E6蛋白真核表达载体的构建及其在子宫颈癌细胞株Hela细胞中的表达

目的构建并鉴定p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体,并转染Hela细胞后,检测其在Hela细胞中的表达。方法用RT-PCR法从Hela细胞中扩增出带HindⅢ、SalⅠ酶切位点的HPV18E6基因片段,将HPV18E6基因片段连接到pMD-18T载体上,通过限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ酶切,T4连接酶连接到含有上述酶切位点的p3×flag-myc-CMV-24真核表达载体上,通过脂质体将p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6转染入Hela细胞48h后,Western-blot检测HPV18E6及3×flag表达情况。结果p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体构建成功,构建的真核表达载体可以被限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ切开,电泳可显示相应条带,经测序其序列与设计的一致,转染到Hela细胞48h后经Western-blot检测可见HPV18E6的高表达及flag的表达。结论p3×flag-myc-CMV-24HPV18E6真核表达载体的成功构建为进一步研究HPV18E6的致癌机制奠定了基础。     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景：血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。目的：构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG）和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）融合的真核表达质粒。方法：根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果与结论：经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。     

Small Interfering RNA Targeting M2 Gene Induces Effective and Long Term Inhibition of Influenza A Virus Replication

RNA interference (RNAi) provides a powerful new means to inhibit viral infection specifically. However, the selection of siRNA-resistant viruses is a major concern in the use of RNAi as antiviral therapeutics. In this study, we conducted a lentiviral vector with a H1-short hairpin RNA (shRNA) expression cassette to deliver small interfering RNAs (siRNAs) into mammalian cells. Using this vector that also expresses enhanced green fluorescence protein (EGFP) as surrogate marker, stable shRNA-expressing cell lines were successfully established and the inhibition efficiencies of rationally designed siRNAs targeting to conserved regions of influenza A virus genome were assessed. The results showed that a siRNA targeting influenza M2 gene (siM2) potently inhibited viral replication. The siM2 was not only effective for H1N1 virus but also for highly pathogenic avian influenza virus H5N1. In addition to its M2 inhibition, the siM2 also inhibited NP mRNA accumulation and protein expression. A long term inhibition effect of the siM2 was demonstrated and the emergence of siRNA-resistant mutants in influenza quasispecies was not observed. Taken together, our study suggested that M2 gene might be an optimal RNAi target for antiviral therapy. These findings provide useful information for the development of RNAi-based prophylaxis and therapy for human influenza virus infection.     

Rac1基NRNAi慢病毒载体的构建与鉴定

背景：Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达。目的：构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率。方法：应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达。针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-Time PCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞。荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果与结论：成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%。成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌（Tca8113）提供了有效的siRNA靶序列。     

sHLA-G1重链分子、β_2m的体外表达及纯化研究

目的获得sHLA-G1重链分子及轻链β2微球蛋白(β2m)基因体外表达并纯化的相关蛋白质。方法RT-PCR扩增可溶性HLA-G1重链分子及人β2m轻链的cDNA序列,构建表达载体pET28a(+)/sHLA-G1及pET28a(+)/β2m,导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导sHLA-G1及β2m蛋白表达,并以Ni-NTA亲和层析和CM-FF弱阳离子柱分别纯化,透析后浓缩保存。SDS-PAGE,Western-Blot鉴定目的蛋白的表达和纯化。结果成功克隆了sHLA-G1及2βm基因并构建了pET28a(+)-sHLA-G1、pET28a(+)-β2m原核高效表达载体;表达产物以可溶性形式存在,表达量>30%,纯化后产物纯度达到95%。结论成功表达并纯化出的sHLA-G1重链分子及轻链β2m有助于阐明可溶性HLA-G1的功能。