雷帕霉素对白血病细胞株的影响

本研究探讨雷帕霉素对白血病细胞株的增殖抑制作用及其对细胞周期的影响,并分析该药作用前后mTOR mRNA表达水平的变化。采用四唑氮蓝比色试验（MTT）观察雷帕霉素对白血病细胞株KG1、K562和U937的体外增殖抑制作用;应用流式细胞术（FCM）检测雷帕霉素干预后的白血病细胞株的细胞周期的阻滞情况;采用实时荧光定量PCR检测白血病细胞株的mTORmRNA表达。结果表明：不同浓度的雷帕霉素作用于KG1细胞株时,20nmol／L为最佳有效浓度,细胞被明显抑制,细胞周期阻滞在G0／G1期,细胞凋亡明显,mTORmRNA的表达水平亦显著降低。与雷帕霉素作用于KG1细胞株相比,雷帕霉素对K562和U937细胞株的作用相对较弱。结论：雷帕霉素与mTOR结合后可以抑制细胞增殖,KG1细胞株对雷帕霉素最为敏感。     

三氧化二砷对白血病细胞株K562的杀伤作用

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对白血病细胞株K562的杀伤作用。方法采用台盼蓝拒染法计数活细胞数，并计算细胞生长率；细胞涂片经Wright—Giemsa染色，光镜下观察细胞的形态。结果As2O3对白血病K562细胞的增殖具有明显的抑制作用。4μmol／L的As2O3能够使K562细胞发生M期阻滞，引起部分细胞发生凋亡。结论As2O3：不但抑制K562细胞的增殖，而且导致K562细胞M期阻滞。     

细胞色素C诱导白血病细胞株HL-60凋亡效应的分析

凋亡是具有独特的细胞形态变化并有重要生物学意义的细胞死亡方式 ,它可使有害细胞或多余细胞从生物体中被清除。目前已证实 ,在哺乳动物细胞凋亡过程中 ,位于线粒体膜内侧的细胞色素Ｃ移位到细胞质 ,从而激活某些蛋白酶 ,导致凋亡的发生[1 ] 。国内已有关于在非细胞体系中研究细胞色素Ｃ诱导细胞凋亡的报道[2 ] ,我们利用细胞色素Ｃ直接作用于髓系白血病细胞株ＨＬ 6 0 ,证实了不同浓度细胞色素Ｃ可诱发ＨＬ 6 0细胞出现增殖、凋亡、坏死三种不同效应。同时还发现细胞色素Ｃ诱导ＨＬ 6 0细胞凋亡伴有细胞浆钙离子浓度的升高。材料和方法1　…     

bcl—2蛋白对T淋巴细胞白血病细胞株CEM程序性死亡的调控作用

为探讨ｂｃｌ－２蛋白对足叶乙甙触发Ｔ淋巴细胞白血病细胞株ＣＥＭ程序性死亡的调控作用，采用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ法，将ｂｃｌ－２基因逆转录病毒载体转入人Ｔ淋巴细胞白血病细胞株ＣＥＭ中，并使其稳定、高效地表达。结果，经足叶乙甙处理后，高表达ｂｃｌ－２蛋白的ＣＥＭ产生梯状ＤＮＡ的量低于对照（Ｐ〈０．０５）。这表明高水平ｂｃｌ－２蛋白对白血病细胞程序性死亡过程可能具有较强的抑制效应。     

骨髓基质细胞对白血病细胞株的保护作用

目的研究原代正常骨髓基质细胞与白血病细胞耐药、抗凋亡的关系。方法应用Percoll分离骨髓基质细胞14份,设实验组体外与白血病细胞共培养组,模拟骨髓微环境功能,另设单独悬浮培养组;同时没自发凋亡组做对照。AnnexinV/PI双标法检测3组白血病细胞凋亡率。结果共培养后骨髓基质细胞抑制药物诱导的白血病细胞凋亡率较对照组显著降低(P<0.005)。结论骨髓基质细胞对白血病细胞有保护作用。     

Wnt5a基因在血液病及白血病细胞株中的表达

本研究观察Wnt5a在部分血液病及白血病细胞株中的表达情况,为进一步研究Wnt5a在血液肿瘤中的作用及其机制打下基础。用人淋巴细胞分离液分离外周血和骨髓单个核细胞,以RT-PCR检测31例病例标本及3种白血病细胞株中Wnt5a的表达。结果表明:5例AML中4例均为阴性或弱阳性,仅1例完全缓解的病例表达呈强阳性。K562、HL-60细胞的Wnt5a表达也为阴性,Jurkat细胞的Wnt5a表达阳性。6例CML的Wnt5a表达均为阴性。4例ALL中3例为表达阳性或弱阳性,1例表达为阴性;2例CLL为阴性表达;2例MM中Wnt5a表达1例为弱阳性,1例为阴性;3例淋巴瘤中有1例为弱阳性,2例为阴性;2例AA、2例IDA、3例ITP、1例ET及PVWnt5a表达均为阳性或弱阳性。结论:在31例血液病标本及髓系白血病细胞株中,除ALL外,有明显的Wnt5a表达缺失或降低,而非恶性血液病例中Wnt5a表达普遍呈阳性,提示Wnt5a的表达下调可能与髓系白血病的发生有关。     

β-连环素在白血病细胞株的异常定位研究

β-连环素是Wnt信号通路关键的信号传递子，其在细胞的异常定位引起下游靶基因的转录是多种实体肿瘤发生的原因之一。由于造血细胞缺少典型的黏着连接（adherens junction，AJ），因此对β-连环素在血液肿瘤的表达及定位并无较多的研究。本研究探讨4种常见的白血病细胞株（Daudi，Jurkat，K562和Thp-1）中β-连环素蛋白的定位及β-连环素基因mRNA的表达水平，了解血液肿瘤中是否有β-连环素蛋白的定位异常，以期发现白血病新的发生机制，为寻找新的特异治疗靶点提供线索。用免疫细胞化学法检测β-连环素在白血病细胞系中的定位，用实时定量RT-PCR法测定β-连环素mRNA表达水平。结果表明：4种白血病细胞株有两种（Jurkat、Thp-1）存在β-连环素的异常定位，且β-连环素mRNA表达增高，但在Jurkat和Thp-1细胞中的β-连环素mRNA低于Daudi和K562细胞。这4种白血病细胞株中β-连环素基因的mRNA表达水平与其异常定位无相关性。结论：β-连环素定位异常可能参与部分血液肿瘤的发生，引起β-连环素定位异常的机制并不是发生在转录水平。     

中药露蜂房蛋白对人红白血病细胞株K562细胞影响的实验研究

目的：研究中药露蜂房中蛋白成份抗白血病作用的机理，为中药露蜂房治疗白血病的临床应用和开发新的抗白血病药物提供实验和理论依据。方法：采用细胞培养和透射电子显微镜技术，观察中药露蜂房蛋白成份对人红白血病细胞（K562细胞）的生长抑制作用和形态结构的影响，采用免疫组织化学方法测定露蜂房蛋白对K562细胞凋亡相关信号转导蛋白NF-κBp65、β-catenin及iNOS表达的影响。结果：（1）与生理盐水对照组比较，露蜂房蛋白处理组白血病细胞生长饱和密度降低，细胞增殖活性减弱（P＜0．05）；（2）露蜂房蛋白处理组白血病细胞呈典型的凋亡形态学改变；（3）与生理盐水对照组比较，露蜂房蛋白处理组白血病细胞中NF-κBp65、β-catenin及iNOS表达减弱，NF—κBp65和β-catenin细胞核内转导减少（P＜0．05）。结论：中药露蜂房蛋白成份有明显抑制K562细胞的作用，其作用机制可能是通过调节凋亡相关信号传导因子NF-κBp65、β-catenin及iNOS的表达，从而诱导白血病细胞凋亡。     

人类红白血病细胞株K562的诱导分化机制

目前，肿瘤细胞的诱导分化是国内外研究的热点之一，有临床应用前景的Ｋ５６２细胞株是研究较多的实验材料，关于Ｋ５６２细胞的诱导分化中各种受体，细胞因子，转录因子，癌基因及其产物，酶所起的作用以及分化中ＤＮＡ，ＲＮＡ的改变有大量的报道。本文将它们作一简述。     

利用基因芯片分析RNA干扰PNAS-2后凋亡相关基因表达的变化

目的:采用基因芯片技术,比较RNA干扰法封闭U937细胞中PNAS-2基因前后,与凋亡有关基因的变化情况,从而了解PNAS-2在凋亡通路中的可能定位。方法:将急性单核细胞白血病细胞株U937分别转染已构建的靶向封闭PNAS-2的干扰质粒组和对照质粒组,合并使用流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,并运用半定量PCR及实时PCR方法验证RNAi效果。采用affymetrix u133A 2.0基因芯片技术比较2组细胞间基因表达的差异。进一步通过半定量RT-PCR对其中的2条上调基因(IER3、CCL2)和6条下调基因(CASP8、CD74、VEGF、DNASE2、PRTN3、TERT)的表达情况进行验证。结果:半定量及实时PCR检测结果表明,合并使用G418及FCM筛选后得到的转染细胞在90%以上,干扰质粒组对PNAS-2的抑制率达到70%以上;基因芯片筛选结果提示共有1651条出现上调,1404条出现下调。其中比值≥2倍的基因共有336条,上调114条,下调222条。根据功能分类初步筛选出与凋亡相关基因共22条,上调基因11条,下调基因11条。RT-PCR检测证实基因芯片结果可靠。结论:抑制PNAS-2表达后促进U937细胞凋亡的机制可能与c-Jun过表达、JNK通路的激活及VEGF基因下调有关。     

抑制凋亡相关基因PNAS-2表达后U937细胞凋亡率的改变

目的:构建并鉴定凋亡相关基因——PNAS-2的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体,将其转染U937细胞,筛选后检测细胞凋亡的变化。方法:shRNA质粒载体pRNAT U6.1/NEO经限制性内切酶BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,连接带有BamHⅠ及HindⅢ黏性末端的shRNA插入片段,转化感受态细菌,并行测序鉴定。将阳性shRNA质粒载体进行细胞转染,合并使用G418及流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,应用半定量PCR鉴定shRNA封闭效果;用Annexin V-APC/7-AAD标记后,使用FCM及激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡。结果:测序鉴定证实,PNAS-2特异的shRNA质粒表达载体构建正确;合并使用G418及FCM分选出GFP阳性细胞后,半定量PCR鉴定示shRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组对PNAS-2的抑制率分别为78.1%、75.4%及51.4%。FCM显示shRNA对照组的细胞凋亡率为(3.52±1.25)%;而shRNAⅠ组为(9.23±1.88)%(P<0.01);shRNAⅡ(8.85±1.80)%(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察显示,shRNA对照组细胞凋亡率为7.3%;shRNAⅠ组为14.7%;shRNAⅡ为13.8%;shRNAⅢ为10.3%。结论:测序结果表明,本研究成功构建了PNAS-2的shRNA质粒表达载体。半定量PCR显示shRNA抑制PNAS-2表达效果佳;抑制PNAS-2后可促使细胞凋亡,提示该基因是抗细胞凋亡基因。     

G-CSF对急性淋巴细胞白血病细胞增殖活性的影响及协同化疗药物杀伤作用的实验研究

我们在临床实践中观察到低剂量的CAG预激方案对难治或复发急性淋巴细胞白血病(ALL)尤其是T-ALL显示出了较好的疗效[1-3].考虑到该方案最初是为髓系白血病设计,且其主要原理是G-CSF通过其受体(G-CSFR)介导,驱动G0期白血病细胞进入增殖周期进而增强化疗药物的杀伤作用.我们推测G-CSF以类似的作用方式对ALL细胞发挥作用.     

白血病细胞系中抑癌基因PTEN启动子区甲基化状态检测及其去甲基化研究

目的 探讨抑癌基因PTEN表达沉默的机制及诱导PTEN表达对白血病细胞的作用.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific PCR,MSP)检测白血病细胞系HL-60、Nalm-6、Raji、KG-1a、U937、NB4、K562中PTEN基因启动子区域甲基化状态;用甲基化转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理白血病细胞,MSP检测甲基化状态的改变、RT-PCR检测PTEN mRNA水平的改变、瑞特染色观察细胞形态学改变、膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)标记染色检测细胞凋亡.结果 检测的白血病细胞系中HL-60、Nalm-6、Raji、KG-1a、U937细胞PTEN基因显示超甲基化状态,而NB4和K562细胞显示低甲基化状态;5-Aza-CdR处理HL-60和Nalm-6细胞后,PTEN基因甲基化降低、mRNA表达水平则逐渐增高,并呈剂量依赖性,细胞出现凋亡现象.结论PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活或沉默,甲基化抑制剂可以诱导PTEN表达,并引起白血病细胞凋亡.     

Tocilizumab has no direct effect on cell lines infected with human T-cell leukemia virus type 1

ObjectiveIt remains unclear whether human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) infection influences therapeutic responses in patients with rheumatic diseases and whether immunosuppressive treatments increase the risk of HTLV-1-related complications in HTLV-1 carriers with rheumatic diseases. We examined the effects of tocilizumab (TCZ), an interleukin (IL)-6 receptor antagonist, on two HTLV-1-infected T-cell lines (HCT-5 and MT-2) in vitro.MethodsWe evaluated production of cytokines and chemokines, expression of HTLV-I associated genes, HTLV-1 proviral load (PVL), expression of HTLV-1 structural proteins, and apoptosis.ResultsThere were no significant differences in cytokine and chemokine levels in the culture supernatants of HCT-5 and MT-2 cells treated with phosphate-buffered saline (PBS) or TCZ. No significant differences were detected in mRNA abundance of Tax or HBZ, PVL, expression of the HTLV-1 structural protein GAG, or apoptosis among HCT-5 and MT-2 cells treated with PBS or TCZ.ConclusionsTCZ had no effect the cytokine profiles, HTLV-1 gene and protein expression, PVL, or apoptosis in HTLV-1-infected T-cell lines. Thus, TCZ treatment has no effect on HTLV-1 infection in vitro.     

Inhibitory effect of chloroquine on concanavalin A internalization into cell monolayer culture

When cultured rat hepatoma cells (R-Y121B) were incubated with insulin in the presence of chloroquine at 25 degrees C, chloroquine increased both insulin binding to the cell surface and its internalization into cells. In addition, in order to elucidate whether or not the effect of chloroquine on insulin receptors is specific, concanavalin A binding to the cells was examined in the presence or absence of chloroquine, since insulin receptors have concanavalin A binding sites. When the cells were incubated with concanavalin A in the presence of chloroquine, this drug decreased concanavalin A internalization in a dose-dependent manner: The inhibitory effect of chloroquine on concanavalin A internalization was evident at a concentration as low as 0.05 mM, and increased up to 0.5 mM. The effect of chloroquine was not related to the degradation of concanavalin A incubated with cells. When the cells were incubated with concanavalin A at 4 degrees C in the presence of chloroquine even at 0.5 mM, the inhibitory effect of chloroquine was not observed. It is concluded that the behavior of insulin receptors in the presence of chloroquine is different from that of concanavalin A receptors, although insulin receptors have concanavalin A binding sites. Chloroquine apparently increases insulin binding to cells in vitro, and this is due to the effect of chloroquine on insulin-receptor recyclization to which lysosome contributes [16, 31, 32]; this drug inhibits the function of lysosome which digests insulin-receptor complexes and eventually insulin bound to its receptors is accumulated in intracellular compartments.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

PNAS-2蛋白单克隆抗体的制备和初步鉴定

本研究制备凋亡相关蛋白PNAS-2的单克隆抗体,并对其进行初步鉴定,为PNAS-2蛋白功能研究提供必需工具。以PNAS-2的合成肽为免疫原,通过动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗PNAS-2蛋白的单克隆抗体,并用Western blot、免疫荧光、ELISA实验对单克隆抗体的特异性、效价、亚型进行了检测。结果表明：获得了稳定的分泌型杂交瘤细胞株S-31-7,属IgG1λ亚型,腹水效价为1：8000;Western blot测得分子量为28kD的单条特异性条带;免疫荧光实验显示胞浆中有阳性反应。结论：制备的单克隆抗体特异性好、效价高,能够作为深入研究PNAS-2蛋白功能的有利工具。     

氨甲喋呤对映体对急性淋巴细胞白血病的不同抑制效应

目的探讨氨甲喋呤单体[L-(+)MTX、D-(-)MTX]及其不同比例对映体混合体[(±)MTX,D∶L=1∶9~9∶1]对急性淋巴细胞白血病细胞系(BALL-1、CCRF-CEM)抑制作用的差异。方法用氨甲喋呤单体及其混合体作用于BALL-1和CCRF-CEM细胞,MTT比色法分析其细胞增殖抑制率;荧光显微镜观察细胞形态学变化;碘化丙啶(PI)单染流式细胞术检测细胞周期;DNA梯度电泳检测其细胞凋亡水平。结果与对照组相比,MTX对映体对BALL-1、CCRF-CEM细胞的抑制生长呈现浓度和时间依赖性,其抑制强度依次为(±)MTX(D∶L=1∶9~2∶8)L-(+)MTXD-(-)MTX;细胞周期出现S期的阻滞,DNA梯度电泳检测出现凋亡条带;亲本BALL-1、L-(+)MTX/BALL-1、D-(-)MTX/BALL-1间差异有统计学意义(P0.01)。亲本CCRF-CEM、L-(+)MTX/CCRF-CEM、D-(-)MTX/CCRF-CEM的细胞周期间差异亦有统计学意义(P0.01)。结论 MTX对映体对BALL-1、CCRF-CEM细胞的增殖抑制作用具有化学结构的立体选择性。     

核受体辅助抑制因子在急性非淋巴细胞白血病细胞株中的表达

目的:明确核受体辅助抑制因子(N-CoR)在急性非淋巴细胞白血病细胞株及细胞分化过程中表达的变化,探讨其在急性白血病中的意义。方法:RT-PCR半定量检测16种急性非淋巴细胞白血病细胞株中N-CoR的基因表达及急性早幼粒细胞白血病细胞株在维A酸作用过程中的变化。结果:N-CoR在所有细胞株中都有表达,在急性早幼粒细胞白血病细胞株中随着细胞的分化表达增加。结论:N-CoR对维持白血病细胞的增殖起重要作用,其表达量的变化和细胞的分化状态相关。     

早幼粒细胞白血病蛋白在髓系白血病细胞中的表达及对细胞增殖的影响

目的 探讨早幼粒细胞白血病(promyelocyte leukemia,PML)蛋白在髓系白血病中的表达及其对人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞增殖的影响.方法 采用实时荧光定量PCR技术检测了30例慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者及24名健康对照者外周血单个核细胞中PML mRNA水平的差异.构建PML的真核表达载体,转染K562细胞后筛选出稳定表达PML的细胞株,以稳定表达空载体的细胞为对照.四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞术分别检测PML过表达对细胞增殖和细胞周期的影响,并进一步用反转录-PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹技术(Westernblot)检测增殖相关因子c-myc和p27kip1(p27) mRNA水平以及蛋白表达水平的改变.最后检测了CML患者及健康对照者外周血单个核细胞中c-myc和p27 mRNA水平的差异.结果 CML患者外周血单个核细胞中PML mRNA表达水平(△Ct=9.02±0.74)明显低于健康对照组(△Ct =7.91 ±0.34),差异有统计学意义(t =5.07,P＜0.001).PML过表达能明显抑制K562细胞增殖,引起细胞周期G0/G1期阻滞.PML稳定表达的K562细胞中,c-myc的mRNA和蛋白表达水平降低,p27的mRNA和蛋白表达水平升高.CML患者外周血单个核细胞中c-myc的mRNA表达水平(△Ct =7.13 ±0.43)显著高于健康对照组(△Ct =9.35 ±0.82),差异有统计学意义(t=6.78,P＜0.001),而p27的mRNA表达水平(△Ct =4.56±0.58)则显著低于健康对照组(△Ct=3.29±0.92),差异有统计学意义(t=2.93,P＜0.01).结论 PML在CML患者中低表达,PML可能通过调节c-myc和p27的表达从而抑制白血病细胞的增殖.