AIB1基因沉默对三阴性乳腺癌细胞生长抑制和凋亡的影响

目的:分析RNAi介导的乳腺癌扩增基因1(amplified in breast cancer 1,AIB1)基因沉默对三阴性乳腺癌细胞生长抑制和凋亡的影响。方法:设计、合成沉默AIB1基因的特异shRNA(短发卡RNA),构建重组表达质粒,转染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,蛋白质印迹法检测转染后AIB1蛋白质表达的变化;MTT法检测细胞的生长抑制情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:本实验成功构建了靶向AIB1基因的RNAi重组表达质粒,并稳定转染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231。蛋白质印迹法结果表明:稳定转染组AIB1基因的蛋白质表达抑制率为70%,与未转染组相比差异有统计学意义(P0.05);AIB1基因沉默三阴性乳腺癌细胞24,48,72 h的OD值分别为24.363±0.501,32.596±0.348及43.408±0.257,凋亡率分别为(8.713±0.106)%,(11.396±0.147)%及(14.110±0.117)%,OD值各组间差异有统计学意义(F=43.436,P0.001);凋亡率各组间差异有统计学意义(F=79.751,P0.001)。结论:AIB1基因沉默可明显抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长和促进凋亡。     

RNA干扰技术沉默黏附斑激酶诱导心脏成纤维细胞失巢凋亡

目的:利用短发夹RNA干扰载体介导的RNA干扰技术沉默成年大鼠心脏成纤维细胞中黏附斑激酶,观察细胞增殖和凋亡的变化。方法:实验于2004-12/2005-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。实验选用10～12周龄清洁级的雄性Wistar大鼠24只,以转染靶向黏附斑激酶的重组RNA干扰质粒的心脏成纤维细胞为干预组,选择未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA的细胞为不同对照组,共4组,各6只。消化法培养大鼠心脏成纤维细胞,设计、构建和鉴定黏附斑激酶RNA干扰载体,westernblot法测量黏附斑激酶的沉默效率,四唑盐比色法检测细胞增殖,DNA缺口末端标记技术检测细胞凋亡,流式细胞仪测定B细胞淋巴瘤2和bax的变化。结果:Wistar大鼠24只,全部进入结果分析。①酶切鉴定和测序鉴定表明黏附斑激酶RNA干扰载体构建成功,转染细胞后,Westernblot结果表明第二个重组黏附斑激酶RNA干扰载体的RNA沉默效率最高,为72.1%,其余分别为66.2%和55.3%。②Pavu6 27-黏附斑激酶2转染组A490值明显低于未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA组(0.179±0.017,0.30±0.002,0.296±0.006,0.281±0.007;t=17.802,16.436,14.993,P<0.01);凋亡率较其余各组则明显升高犤(22.28±2.13)%,(4.72±1.67)%,(6.36±0.92)%,(8.19±1.33)%;t=-19.05,-17.31,-15.16,P<0.01犦。③Pavu6 27-黏附斑激酶2转染组bax上升明显,与正常对照组和空质粒转染组比较,差异十分显著(2.15±058,1.01±0.04,1.12±0.04;t=-4.79,-4.318,P<0.01);与阴性对照组比较,差异显著(1.19±0.31,t=-3.59,P<0.05)。④Pavu6 27-黏附斑激酶2转染组B细胞淋巴瘤-2表达较正常对照组、空质粒转染组、阴性对照组显著上升(1.62±0.15,1.04±0.03,1.09±0.01,1.23±0.04;t=-9.39,-8.701,-6.338,P<0.05)。结论:通过RNA干扰技术沉默心脏成纤维细胞中黏附斑激酶基因的表达,可诱导心脏成纤维细胞凋亡,抑制或降低心脏成纤维细胞中黏附斑激酶表达可能是防治心肌纤维化的一种手段。     

实时荧光定量RT-PCR检测siRNA表达载体抑制人肾癌786-0细胞G250 mRNA的表达

目的评价实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测小干扰RNA（siRNA）表达载体抑制人肾癌786-0细胞G250 mRNA表达的可靠性,以建立稳定的RNAi技术。方法体外合成四条针对G250基因的siRNA,并设计阴性对照和空白对照,转染肾癌786-0细胞株;根据G250 mRNA的序列设计特异性引物,荧光染料SYBR Green Ⅰ法定量RT-PCR测定G250 mRNA的表达情况。结果四条siRNA分别使G250 mRNA表达量降低了35.56%、49.27%、45.88%、65.13%,阴性对照和空白对照组无明显变化。结论实时荧光定量RT-PCR技术可以准确地检测mRNA的表达,可以用来评价siRNA的有效性。     

siRNA特异性抑制HEL细胞evi1基因的实验研究

本研究探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默人红白细胞白血病细胞（HEL）的evi1基因后对细胞evi1基因表达的抑制作用及细胞生物学特征变化及其作用机制。体外合成3条evi1基因特异性的siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）并转染HEL细胞,并设对照。用四甲基偶氮唑蓝法评价细胞增殖抑制情况,半定量逆转录聚合酶链反应（semiquantitative RT-PCR）检测evi1基因mRNA的表达,台盼蓝染色试验测定细胞活性的变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。结果显示,细胞转染24、48、72小时后,以siRNA-1作用最强,转染后48小时抑制作用最明显。siRNA浓度为120nmol/L时,抑制率达到最大。转染48小时后siRNA-1对HEL细胞的增殖抑制率为（72.22±2.80）%,evi1-mRNA相对表达率为（27.31±1.11）%,HEL细胞活率为（26.05±2.49）%,与其他各组相比有显著性差异（p〈0.001）。siRNA可使细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,凋亡率明显增高（p〈0.01）。结论：evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,使evi1-mRNA表达水平降低,细胞活性下降,HEL细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂,促进细胞凋亡。     

沉默核干因子基因表达对HL-60白血病细胞凋亡的影响

本研究探讨靶向沉默白血病细胞的核干因子（nucleostemin,NS）基因对HL-60白血病细胞凋亡的影响。用T7启动子介导体外合成两条短发夹状干扰RNA（NS-shRNA）,以其中沉默NS基因作用强的一条NS-shRNA转染HL-60细胞,同时以与NS基因序列无关小干扰RNA转染HL-60细胞作对照,应用RT-PCR检测被转染的HL-60细胞NS-mRNA抑制效果,倒置显微镜下观察活体细胞形态变化,Wright-Giemsa染色观察细胞胞体和细胞核形态学变化,以流式细胞仪（FCM）和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）测定凋亡细胞数并计算凋亡阳性率。结果表明：HL-60细胞被NS-shRNA转染48小时后NS-inRNA阻断率达到74．94％,凋亡率分别为（25．32±3．06）％和（27．3±3．21）％,对照组仅（3．12±0．38）％和（3．30±1．52）％,转染组与对照组比较差异显著（P〈0．01）。Wright-Giemsa染色显示细胞发生核碎裂并出现“凋亡小体”。结论：靶向沉默NS基因表达可诱发和促进HL-60白血病细胞发生凋亡,为NS基因作为恶性肿瘤治疗的候选靶基因奠定了理论基础。     

FADD—DN基因转染对氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的影响

目的 探讨氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制。方法 将培养瘢痕成纤维细胞随机分为转染组、转染对照组和非转染组，转染组细胞与绿色荧光蛋白（GFP）质粒cDNA、含目的基因片段的表达载体质粒pcDNA3-FADD-DNcDNA共转染，转染对照组细胞与GFP质粒cD-NA、空载体质粒pcDNA3共转染，非转染组细胞没有进行转染，转染后24h分别对各组细胞进行氦氖激光照射（100mW/cm^2照射30min），1次/d，连续照射3d，然后采用TUNEL技术检测细胞凋亡。结果 转染组、转染对照组与非转染组细胞凋亡率分别为9.27%，15.73%和12.87%，转染组细胞凋亡率明显小于转染对照组（q=4.55,P&;lt;0.01）和非转染组（q=4.14,P&;lt;0.05）。结论 FADD-DN基因转染能减少氦氖激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡，FADD可能是氦氖激光激活死亡信号途径的基本元件之一。     

沉默FRAT1基因对结肠癌HT-29细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

目的 探讨沉默FRAT1基因对结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡的影响及其可能分子机制.方法 将成功转染FRAT1基因RNA干扰序列的人结肠癌HT-29细胞扩大培养,MTT比色法检测细胞增殖,双染流式细胞术检测细胞凋亡率,单染流式细胞术分析细胞周期,免疫荧光法激光共聚焦显微镜下观察β-catenin蛋白变化.结果 转染组细胞较对照组细胞生长明显减缓（P＜0.01）,凋亡率明显增加（P＜0.01）,细胞周期出现G0/G1期阻滞,差异显著（P＜0.01）,胞质β-catenin蛋白表达明显下调.结论 FRAT1基因RNA干扰序列可以有效诱导结肠癌HT-29细胞凋亡和细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,其机制可能通过下调β-catenin表达实现.     

地塞米松对紫杉醇诱导人卵巢癌细胞株SKOV-3细胞凋亡的影响

目的：探讨地塞米松预处理对紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡的影响。方法：应用MTT比色法检测地塞米松对紫杉醇抑制细胞增殖的影响,TUNEL法形态学观察细胞凋亡,流式细胞仪PI单染测定地塞米松预处理对紫杉醇诱导人卵巢癌细胞株SKOV-3细胞凋亡及细胞周期的影响。结果：不同浓度地塞米松对紫杉醇抑制SKOV-3细胞增殖有不同程度的拮抗作用,TUNEL分析表明地塞米松预处理后能抑制紫杉醇诱导SKOV-3细胞凋亡,流式细胞仪PI单染法分析表明,用地塞米松预处理后再用紫杉醇组的细胞凋亡率为（5.55±0.53）%,而单用紫杉醇组细胞凋亡率为（13.90±1.62）%,地塞米松进行预处理组细胞凋亡率明显降低（P〈0.01）,且与细胞周期中G2/M期无关。结论：不同浓度地塞米松对紫杉醇抑制SKOV-3细胞增殖有不同程度的保护作用,地塞米松能够拮抗紫杉醇诱导人卵巢癌细胞株SKOV-3细胞凋亡,且与细胞周期中G2/M期无关。     

shRNA沉默GnT-V基因表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（GnT-V）的小片段发夹状RNA（shRNA）表达质粒,研究shRNA表达质粒沉默GnT-V基因后对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对GnT-V基因的小于扰RNA（siRNA）靶序列,构建shRNA表达载体并转染PC-3细胞,通过G418筛选,建立稳定表达GnT-V基因的细胞株,采用RT-PCR和蛋白质印迹检测GnT-VmRNA和蛋白的表达,并通过CCK-8增殖实验、流式细胞仪评价GnT-VshRNA对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建了GnT-VshRNA表达质粒,且该质粒明显下调GnT-V的表达;PC-3细胞GnT-V／1079的tuRNA和蛋白质水平的抑制率分别为76．5％和67．0％,对PC3细胞呈明显抑制效应;CcK-8增殖实验显示,与对照组相比,PC-3GnT-V／1079的增殖受到明显抑制（P〈0．01）,以48h为著;流式细胞仪检测结果表明,PC-3GnT-V／1079的凋亡率明显增加（P〈0．05）。结论shRNAGnT-V能显著降低GnT-V基因的表达水平,从而有效抑制PC-3细胞增殖。并促进细胞凋亡,该GnT-V的siRNA序列可能成为治疗前列腺癌的有效靶点。     

构建两种启动子调控的自杀基因介导的肝癌细胞治疗

目的将外源基因p Survivin-HSV-TK导入质粒PBI-CMV2中,将外源基因p AFP-HSV-TK导入质粒PBI-CMV2中,构建两种特异性表达的质粒,比较两种启动子调停的优越性。方法由阳离子脂质体lipofectamine2000TM,运载两种质粒转染肝癌细胞Hu H-7,流式细胞术测定转染效率,半定量PCR检测TK基因在肝癌细胞中的表达水平。转染肝癌细胞Hu H-7,联合更昔洛韦杀伤细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8检测加药(GCV)后细胞的增殖情况。结果阳离子脂质体lipofectamine2000TM介导Survivin-TK-p BI-CMV2质粒转染的Hu H-7细胞的转染率与介导AFP-TK-p BI-CMV2质粒转染的Hu H-7细胞的转染率分别为(14.43±0.88)%和(12.51±1.74)%(P=0.38),无统计学差异。半定量PCR检测HSVtk在转染的Hu H-7细胞中有表达,且转染Survivin-TK-p BI-CMV2质粒的细胞中TK基因的表达更高(P=0.001),在未转染细胞内未检测到表达。细胞凋亡实验表明GCV对转染的Hu H-7细胞有显著的杀伤作用,且转染Survivin-TK-p BI-CMV2质粒的Hu H-7细胞凋亡作用更明显(P=0.001)。结论肝细胞靶向基因运输载体PBI-CMV2介导的由AFP和Survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对Hu H-7肝癌细胞均具有显著杀伤作用,且Survivin启动子调控作用相对明显,这为肝癌的靶向基因治疗策略的发展提供了新思路。     

MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡，增殖及细胞周期的影响

目的探讨沉默MYCT-1基因对GES-1细胞凋亡、细胞周期及细胞增殖的影响。方法采用siRNA转染GES-1细胞后分别应用AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测siRNA对细胞增殖的作用。结果siRNA转染GES-1细胞后,与对照细胞相比,细胞凋亡率明显增高（P〈0．05）;细胞增殖率降低（P〈0．05）,细胞周期检测表明细胞停滞于S期（P〈0．05）。结论MYCT-1基因维持一定的表达水平对于正常细胞生长调控是必需的,MYCT-1基因对细胞周期的调控主要体现在S期向G1期的转变过程。     

MTDH基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨异黏蛋白(MTDH)基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭能力的影响。方法在B淋巴瘤细胞Raji中转染MTDH siRNA和siRNA对照,分别命名为MTDH siRNA组和siRNA对照组,将没有转染的细胞作为对照组。qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中MTDH表达水平,MTT方法检测细胞增殖和黏附能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测细胞中波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白水平。结果MTDH siRNA细胞中MTDH mRNA和蛋白水平均明显低于对照组和siRNA对照组(P<0.05)。与对照组和siRNA对照组比较,MTDH siRNA细胞增殖和黏附能力降低,细胞凋亡率升高,细胞侵袭和迁移能力也降低,细胞中Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低,Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MTDH基因沉默下调B淋巴瘤细胞增殖能力,抑制B淋巴瘤细胞侵袭和迁移。     

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p0.01和p0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

白藜芦醇对人肾细胞癌786-0细胞PDCD5表达的影响

目的探讨白藜芦醇(Res)对人肾细胞癌786-0细胞中PDCD5蛋白表达的影响及PDCD5蛋白与白藜芦醇抑制人肾细胞癌786-0细胞生长的关系。方法分别采用12.5、25、50、100μmol/L的白藜芦醇(Res)作用于人肾细胞癌786-0细胞系24h.采用免疫细胞化学SP法检测PDCD5蛋白在肾细胞癌786-0细胞中的表达情况;采用流式细胞术检测肾细胞癌786-0细胞的增殖和凋亡情况。结果 Res呈剂量依赖性抑制人肾细胞癌786-0细胞的增殖;人肾细胞癌786-0细胞低水平表达PDCD5,经Res作用以后人肾细胞癌786-0细胞中PDCD5蛋白的表达明显升高,与对照组比较,差异有显著性(P均0.05)。Res各组间比较,12.5μmol/L与25、50及100mol/L比较,差异有显著性(P均0.05);但25μmol/L与50、100μmol/L比较,差异无统计学意义(P0.05)。流式细胞术显示,Res通过阻滞人肾细胞癌786-0细胞于S期而抑制细胞分裂。结论白藜芦醇可以通过上调人肾癌786-0细胞PDCD5蛋白的表达,使786-0细胞阻滞在S期而诱导凋亡,并且这种作用具有浓度依赖性。     

小分子干扰RNA介导的RhoA沉默优化胎肝干细胞培养

背景：细胞移植治疗是目前的研究热点之一,寻找良好的细胞来源并有效扩增,是大量临床应用的基础。目的：通过沉默RhoA基因优化胎肝干细胞培养方法。方法：体外培养胎肝干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组：A组为干细胞组,B组为经随机打乱顺序的小分子干扰RNA转染干细胞组,C组为经小分子干扰RNA转染的干细胞组。应用反转录-聚合酶链反应、Western blot法检测胎肝干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论：转染小分子干扰RNA后C组与A、B组相比,RhoA基因和蛋白表达量明显降低（P〈0.05）,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多,各组间差异有显著性意义（P〈0.05）。提示通过沉默RhoA基因的方法可以促进胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。     

沉默缺氧诱导因子-1α对卵巢癌化疗敏感性的影响

目的观察沉默缺氧诱导因子HIF-1α对卵巢癌细胞化疗敏感性的相关影响并探讨其机理。方法构建HIF-1α基因短发夹RNA真核表达质粒,并转染卵巢癌细胞SKOV3（人卵巢浆液性囊腺癌细胞株）。实验可分为空白组,非特异对照组（转染pNonspecific-siRNA,即SKOV3NS）,目的siRNA组（转染pHIF-siRNA,即SKOV3siRNA）3组,用RT-PCR及Western Blot法分别检测各组HIF-1α基因的mRNA和蛋白的表达水平。细胞经过20μmol/L顺铂作用后,用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术（FCS）检测细胞凋亡率。结果 SKOV3siRNA转染组HIF-1α基因在mRNA水平和蛋白水平表达均明显降低,SKOV3siRNA组肿瘤细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均明显增高（P〈0.05）。结论 RNA干扰技术沉默HIF-1α能够有效地抑制卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因表达,增强其对化疗药物顺铂的敏感性。     

沉默Caveolin-1基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨沉默 Caveolin-1（Cav-1）基因对人膀胱癌细胞株5637增殖和凋亡的影响。方法通过siRNA转染人膀胱癌细胞株5637（沉默组）,以转染 FAM-siRNA为阴性对照组,未转染细胞为正常对照组。Re-al-time PCR法检测Cav-1基因沉默的效率,CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞术检测各种细胞的凋亡情况。结果 siRNA转染可显著降低人膀胱癌细胞株5637中 Cav-1 mRNA 的表达水平。沉默组细胞的增强能力明显减低,而细胞凋亡率明显升高（均P＜ 0.05）。结论沉默Cav-1基因可抑制人膀胱癌细胞株5637的细胞增殖并促进细胞凋亡。     

miRNA-592在肾细胞癌进展中作用及其与预后关系研究

目的 探讨miRNA-592在肾细胞癌(RCC)中的作用及其与预后的关系.方法 逆转录-聚合酶链反应检测110例RCC组织及其配对的癌旁组织、正常人肾上皮细胞系(HK-2)和人RCC细胞系(786-O、ACHN、Caki-1和769-P)中miRNA-592的表达.分析miRNA-592与RCC临床病理特征及生存预后的...