感觉神经元特异性受体rMrgE基因的克隆与表达

目的 克隆感觉神经元特异性受体rMrgE基因并于HEK293细胞中表达.方法 利用聚合酶链式反应技术,从大鼠背根神经节总RNA中扩增出目的基因rMrgE,克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisB中,构建真核表达rMrgE载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株.采用RT-PCR、免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定.结果 与结论含有rMrgE基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上.本研究为进一步探究rMrgE受体的功能奠定了基础.     

脊髓感觉神经特异性蛋白质相关EST片段的筛选

我们在寻找感觉、运动神经系统蛋白表达差异的过程中 ,曾发现了感觉神经特异的相对分子质量(Ｍｒ) 2 9× 10 3蛋白 ,但未能获得其全长ｃＤＮＡ[1] 。因此 ,我们试图通过ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳来分析脊髓感觉神经和运动神经蛋白的表达 ,以获得这一感觉神经特异性蛋白并进行测序。根据测得的氨基酸序列设计简并性引物 ,用ＲＡＣＥ方法对与其相关的ｃＤＮＡ序列进行钓取 ,为将来寻找感觉神经特异性蛋白的ｃＤＮＡ序列提供相关的线索。1　材料与方法1.1　材料Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,购自军事医学科学院动物中心。Ｂｉｏ Ｒａｄ公司垂直电泳仪及ＳＤＳ …     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

感觉神经肽P物质参与修复细胞内源性生长因子及受体表达调控

在皮肤伤口愈合中 ,主要来源于感觉神经末梢释放的P物质 (substanceP ,SP)参与伤口愈合的调控。以往认为这主要与P物质引起神经源性炎性反应 ,促进成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞增殖有关。近年来第三军医大学野战外科研究所在国家重点基础研究发展规划项目资助的研究中发现     

大肠杆菌aroE基因的克隆与表达

目的:克隆表达大肠杆菌莽草酸脱氢酶基因aroE,并测定其生物学活性。方法:根据大肠杆菌中aroE基因的序列设计了一对引物,利用PCR技术扩增得到aroE基因,将其克隆入高效原核表达载体pBV220,以双脱氧法进行测序,然后对该重组子利用温度诱导表达,并测酶的生物活性。结果:构建了aroE基因的克隆和表达重组子,aroE基因获得高效表达,SDS-PAGE图谱显示新增30×103蛋白带,酶活性测定结果表明奎尼酸脱氢酶的相对酶活性是5.6倍。结论:实现了莽草酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的高效表达,证明了其具有奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌种奠定了基础。     

人类维甲酸受体α的克隆表达

目的：构建人类维甲酸受体α基因的高效表达系统。方法：提取人肝组织总RNA，RT-PCR扩增Retinoid X receptor α（RXRα）的cDNA。将其克隆入原核表达载体pETDuet-1，构建重组表达载体pETDuet-1／RXRα。将已构建好的表达载体pETDuet-1／RXRα重组质粒转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代-8-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，Western Blot鉴定表达产物。结果：重组载体pETDuet-1／RXRα经限制性核酸内切酶BglⅡ和AatⅡ双酶切鉴定，得到符合预期大小的核酸片段。SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带，Western Blot证实该条带即为RXRα。并对重组质粒pETDuet-1／RXRα在BL21菌株的表达效率进行评价，目的蛋白占菌体总蛋白的百分比为65．8％。结论：成功建立了pETDuet-1／RXRα的高效表达系统。     

特异性表达新霉素耐药基因NeoR的人乳腺癌细胞模型的建立

将含有Ｎｅｏ＾Ｒ基因的ＰＳＶ２－ｎｅｏ质粒经扩增,提取及纯化,以磷酸钙共沉淀法转染入ＭＤＡ人乳腺癌细胞系,经Ｇ４１８长期高压筛选出７株ＭＤＡ细胞克隆,采用Ｎｅｏ＾Ｒ基因特异性引物进聚合酶链反应,证实了Ｎｅｏ＾Ｒ基因在各株Ｇ４１８抗生ＭＤＡ细胞基因组中的整合。     

我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达

目的：通过对登革病毒ＮＳ１基因的表达,研究表达的ＮＳ１蛋白的抗原性,为研制新型登革疫苗提供依据。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术将扩增的ＮＳ１基因插入到ｐＢＶ２２０载体中,通过温控诱导进行外源蛋白的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果：获得正向插入的ＮＳ１－ｐＢＶ２２０重组质普,表达产物的相对分子质量约为５１０００,与预期大小一致,并且可与登革２型     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

HCCR-2基因的克隆及原核表达

目的:克隆HCCR-2基因、原核表达并鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得HCCR-2基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的HCCR-2基因亚克隆到pET-28a( )表达载体中,构建HCCR-2表达载体,IPTG诱导表达1~5h,做SDS-PAGE分析,鉴定HCCR-2蛋白的表达。结果:DNA测序证明,获得了HCCR-2基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,HCCR-2蛋白获得高效表达,其相对分子质量为39kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论:HCCR-2基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨HCCR基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。     

DNA错配修复基因MutS的克隆和表达

目的：克隆ＭｕｔＳ基因并构建高效表达菌株，为建立ＤＮＡ错配突变检测系统和应用于临床肿瘤的检测等打下重要的基础。方法与结果：通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组中扩增得到ＭｕｔＳ基因（２．６ｋｂ），克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，构建了重组质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ／ＭｕｔＳ，核酸序列分析表明所克隆的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ的ＭｕｔＳ一致。然后亚克隆到原核表达载体ｐＢＶ２２０上，构建了重组菌株ＤＨ５α／ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ，４２℃热诱导表达ＭｕｔＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量９７×１０３左右处出现一条表达量高达３０％以上的表达蛋白带，而对照菌株表达量很低。将重组质粒ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ转化到ＭｕｔＳ缺陷菌株ＥＳ１３０１互补了该菌株ＭｕｔＳ的缺陷，使其链霉素、利福平抗性（Ｓｔｒｒ，Ｒｉｆｒ）的突变频率分别降低９９％、９６％。结论：克隆得到ＭｕｔＳ基因并在大肠杆菌中得到高效表达，表达的ＭｕｔＳ蛋白在菌体内具有生物学功能     

人杀伤抑制性受体CD158bcDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:CD158b基因克隆与表达.方法:采用RT-PCR技术,从正常人外周血单个核细胞中扩增编码CD158b的cDNA,经酶切后将其克隆于pMBP-c表达质粒上,酶切和测序鉴定.构建的高效表达克隆子经IPTG诱导后,表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳分析.结果:RT-PCR获得了预期大小的cDNA,DNA测序结果与GenBank登记的人CD158b编码序列一致.pMBP-c-CD158b表达质粒酶切后结果与预期相符.表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳分析,得到分子量为58 kD的蛋白质,与理论值一致,所获重组蛋白占菌体总蛋白25%.结论:获得了CD158b基因,并成功在大肠杆菌中表达,所获重组蛋白为进一步研究CD158的功能打下了基础.     

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的：克隆人KGF-2基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：通过PCR扩增，从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA，并将其分别克隆入pBV220，pLEX和pGEX4T-1质粒中，研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果：克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中，在E．coli JM109中表达量相对最高，约占茵体总蛋白的4％；克隆于pLEX质粒中，在E．coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5％；克隆于pGEX4T-1中，在E．coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20％。结论：采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达，较pBV220和pLEX具有明显优势，能实现对KGF-2的高效表达，为进一步的功能研究奠定了基础。     

脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :克隆表达大肠杆菌脱氢奎尼酸合成酶基因aroB ,并测定其生物学活性。方法 :根据大肠杆菌中aroB基因的序列设计了一对引物 ,利用PCR技术扩增得到aroB基因 ,将其克隆入pGEM Teasy载体中 ,以双脱氧法进行测序 ,然后再克隆入高效原核表达载体pBV2 2 0 ,对该重组子的SD序列进行调节后利用温度诱导表达 ,并测酶的生物活性。结果 :构建了aroB基因的克隆和表达重组子 ,经SD序列调节后 ,aroB基因获得高效表达 ,SDS PAGE图谱显示新增 38.8× 10 3 蛋白带 ,酶活性测定结果表明脱氢奎尼酸合成酶的相对酶活性为 5 .4。结论 :实现了脱氢奎尼酸合成酶基因在大肠杆菌中的高效表达 ,为构建产脱氢奎尼酸工程菌种奠定了基础。     

端粒酶催化亚基hTRT组合抗原决定簇基因的克隆与表达

目的：利用计算机软件对端粒酶催化亚基抗原决定簇进行模拟预测分析，制备端粒酶催化亚基组合抗原决定簇重组蛋白，为制备端粒酶催化亚基单克隆抗体提供条件。方法：以Goldkey软件模拟分析端粒酶催化亚基抗原决定簇，设计抗原决策簇的PCR扩增系列引物，组合PCR扩增获得组合抗原决定簇序列并克隆到pGEM-T Easy Vector载体中，组合抗原决定簇基因序列插入pGEX-6P-1中，诱导表达融合蛋白，亲和层析获得组合融合蛋白重组抗原。结果：发现了4个可能性较大、序列较长的抗原决定簇氨基酸离列，获得了重组人端粒酶催化亚基组合融合蛋白。结论：实验结果表明，计算机辅助设计和组合扩增技术是获得含多位点抗原决定簇的端粒酶催化亚基组合抗原融合蛋白的有效方法。     

结核分枝杆菌Rv2389c基因的克隆和原核表达

目的:克隆并原核表达结核分枝杆菌Rv2389c基因。方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出485bp的Rv2389c基因,克隆入pSP73载体,测序分析。将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),待大肠杆菌增菌至A600nm值为0.6时,用0.3 mmol/L IPTG在30℃诱导表达重组蛋白。结果:测序结果证实获得了Rv2389c基因,其序列与GenBank中报道完全一致。构建了重组表达质粒,表达的蛋白以12%SDS-PAGE分析,在Mr约42KD处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体蛋白的26.8%。结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2389c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。