低剂量辐射联合pEgr-P16基因治疗诱导食管癌细胞凋亡的研究

目的:研究大剂量(2Gy)和低剂量(0.075Gy)X射线诱导pEgr P16重组质粒稳定转染的食管癌细胞株EC9706凋亡的作用。方法:将脂质体包裹的pEgr P16重组质粒,转染食管癌细胞系EC9706中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞;采用Westernblot方法检测不同剂量X射线诱导后P16的表达;观察不同剂量X射线照射后,EC9706细胞凋亡率的变化。结果:pEgr P16重组质粒转染EC9706细胞,并获得稳定转染的细胞;2Gy和0.075GyX射线照射均可诱导P16表达增强;稳定转染的细胞经2Gy和0.075GyX射线照射,细胞凋亡率明显高于假照射(0Gy)组(P<0.05～0.01)。结论:0.075GyX射线照射可诱导稳定转染的EC9706细胞中P16表达增强,使诱导细胞凋亡率提高。     

电离辐射诱导pEgr-hPTEN 表达增强其体外抗肿瘤作用

目的：研究辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN体外稳定转染联合X射线照射对恶性胶质瘤细胞SHG-44增殖和诱导细胞凋亡的作用。 方法：以脂质体介导携有外源野生型PTEN基因的表达载体pEgr-hPTEN转染人胶质瘤SHG-44细胞,筛选稳定转染细胞克隆并扩增培养,以Western blotting法检测PTEN基因的辐射诱导表达情况,应用流式细胞仪及生长曲线测定稳定转染联合0~10 Gy X射线照射对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响。 结果：SHG-44-hPTEN稳定转染细胞PTEN蛋白的相对表达量可被辐射诱导增强,5 Gy以内呈剂量依赖性增加。稳定转染联合辐射可明显抑制肿瘤细胞的恶性增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,照射后第8天稳定转染不同剂量组细胞数仅为稳定转染0 Gy假照组的30.0%~50.0%和未转染0 Gy假照组的7.7%~13.0%;稳定转染不同剂量照射组早期凋亡细胞百分数分别为稳定转染0 Gy假照组的1.5~2.3倍、未转染照射组的1.9~4.4倍及未转染0 Gy假照组的3.4~5.1倍。 结论：体外基因-放射联合作用可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

pNEgr-mIL-12真核表达重组质粒的构建及在COS-7细胞和黑色素瘤B16细胞中的表达

目的:构建含辐射敏感启动子的pNEgr-mIL-12真核表达载体,转染哺乳动物细胞后经不同剂量X射线照射,检测mIL-12的表达.方法:限制性内切酶酶切构建pNEgr-mIL-12表达载体;脂质体转染法转染COS-7细胞和B16细胞;ELISA法检测mIL-12p70表达.结果:①pNEgrmIL-12重组质粒转染瞬时表达细胞COS-7细胞,经不同剂量X射线照射后,照射组mIL-12表达量比未照射组明显增高(P＜0.05,P＜0.001),约为未照组的1.5～2.5倍;在2.0 Gy照后表达增高最为明显,表达于照后4 h达峰值,在观察的72h内保持于较高水平;②转染pNEgr-mIL-12的B16细胞于2.0 Gy照后增高明显,为未照射组的1.5倍;并且经2.0 Gy X射线照射后随时间延长表达水平逐渐增高;低至0.05 Gy的剂量对两种细胞亦均有激活作用.结论:pNEgr-mIL-12重组质粒具有辐射激活下游基因表达的功能,且经不同剂量X射线照射后表达均有增强,尤以2.0 Gy照射组作用明显,但在低剂量50、75、100 mGy照后表达水平增高与对照组差异均有显著性.     

Egr-1启动子辐射诱导的基因表达特性

目的:研究电离辐射作用下早期生长反应因子1(Egr-1)启动子调控增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因在人结肠癌细胞SW480中的表达。方法:利用基因重组手段构建质粒Egr-1-EGFP;阳离子脂质体介导转染人结肠癌细胞SW480,给予不同剂量γ射线照射,流式细胞仪检测照射后不同时间点EGFP的表达。结果:电离辐射能够诱导Egr-1启动子调控下游基因的表达,且6 Gy照射后最为明显,在照射后24 h达到高峰。结论:Egr-1启动子具有电离辐射诱导特性。     

pEgr-MIP3α重组质粒的构建及其在Lewis肺癌细胞中的辐射诱导表达

目的探讨辐射对转染pEgr-MIP3α质粒的Lewis肺癌细胞MIP3α表达的影响.方法用PCR方法扩增出MIP-3α基因,构建pEgr-MIP3α重组表达质粒,脂质体介导转染Lewis肺癌细胞,用RT-PCR和Western方法检测不同剂量X射线照射后的MIP-3α表达水平.结果所构建的重组质粒pEgr-MIP3α中MIP-3αcDNA正确插入表达载体;各照射组在不同剂量电子线照射后,MIP-3α表达均高于未转染组和假照射组.结论 Egr-1启动子具有辐射启动和诱导下游MIP-3α基因在Lewis肺癌中增强表达的功能,为pEgr-MIP3α用于放射-基因治疗的体内研究提供了实验基础.     

重组质粒pIRESEgr-IFNγ的构建及其在Lewis肺癌细胞中的辐射诱导表达

目的： 构建重组真核表达质粒pIRESEgr-IFNγ并检测其在体外培养的Lewis肺癌细胞中的辐射诱导表达。方法：利用基因重组技术构建含Egr-1启动子的IFNγ表达质粒,脂质体介导体外转染Lewis肺癌细胞,酶联免疫吸附法（ELISA）检测0、2、5和10 Gy X射线诱导IFNγ表达的量效和时程关系。结果：酶切鉴定证实,Egr-1启动子和IFNγ基因正确插入真核表达载体pIRES1neo;2、5和10 Gy X射线照射转染该重组质粒的Lewis肺癌细胞,上清中IFNγ表达量明显高于假照组（P＜0.001）,其中5 Gy照射后表达量最高,为假照组的4.39倍。5 Gy照射后2、6、12和36 h上清中IFNγ表达量逐渐增加（P＜0.001）,照射后36 h表达量为照射前的6.27倍。结论：成功构建了真核表达质粒pIRESEgr-IFNγ,该质粒具有辐射诱导基因表达增强特性。     

小鼠 Egr-1启动子的克隆及其辐射诱导特性的研究

目的 :扩增 Egr- 1启动子并构建 Egr- PGL重组质粒 ,探讨不同剂量 X射线诱导被转染的NIH3T3细胞荧光素酶表达活性。方法 :利用 PCR方法扩增 Egr- 1p与 PGL3- E表达载体连接 ,用发光仪测定荧光素酶与底物反应的发光值 ,分析 X射线诱导荧光素酶表达。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确 ;电泳检测重组质粒 ,有正确的特异性片段 ;重组质粒转染小鼠 NIH3T3细胞鉴定 Egr- 1p的辐射调节特性 ,发现照射组发光值均高于假照组 ,75m Gy照射组的表达量约为假照组的 5倍 ,2、4、6、8和 10 Gy照射组的表达量分别约为假照组的 5～ 7.5倍。结论 :扩增得到的 Egr- 1启动子在不同剂量 X射线照射下均具有诱导下游基因表达增强作用 ;低剂量照射诱导 Egr- 1启动子下游基因表达增强作用的发现可能在肿瘤基因治疗中更具有实用价值。     

TRAIL和endostatin双基因-放射治疗对人血管内皮细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的：观察重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES携带的双基因TRAIL和endostatin联合X射线照射后,对血管内皮细胞ECV304增殖、周期和凋亡的影响。方法：实验分为对照组、空载体pshuttle转染组、TRAIL单基因重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL转染组、endostatin单基因重组质粒pshuttle-Egr1-shES转染组和TRAIL、endostatin双基因重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES转染组。细胞转染采用脂质体介导的方法进行,对照组不转染。细胞转染后给予X射线照射（照射剂量分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy）,采用ELISA法检测转染细胞中TRAIL和endostatin蛋白的表达,并分别采用MTT及PI单染或/和Annexin Ⅴ双染流式细胞术（FCM）检测TRAIL、endostatin单/双基因治疗联合放射治疗对ECV304细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果：2.0 Gy X射线照射后与0 h比较,各时间点转染pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES的ECV304细胞上清中TRAIL和endostatin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,分别于12和24 h达峰值;不同剂量X射线照射可诱导TRAIL和endostatin蛋白表达,且蛋白表达水平随照射剂量的增加而明显升高（P<0.05或P<0.01）。MTT结果显示,X射线照射后, pshuttle-Egr1-shTRAIL、pshuttle-Egr1-shES和pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES组ECV304细胞A490值均明显低于对照组和pshuttle组,并显示一定的时间-效应和剂量-效应关系,并伴有细胞凋亡率明显增加、G₂+M期细胞百分数明显上升和G₀/G₁期细胞百分数明显下降。上述细胞效应,尤以pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES组变化最为明显,与pshuttle-Egr1-shTRAIL和pshuttle-Egr1-shES组比较差异有统计学意义（P<0.05 或 P<0.01）。结论： TRAIL和endostatin双基因联合放射治疗可抑制ECV304细胞生长,影响细胞周期进程,促进细胞凋亡,且其治疗效果优于单纯放射治疗或TRAIL/endostatin单基因-放射治疗。     

Egr-1启动子辐射诱导的基因表达特性

目的：研究电离辐射作用下早期生长反应因子1（Egr-1）启动子调控增强绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在人结肠癌细胞SW480中的表达。方法：利用基因重组手段构建质粒Egr-1-EGFP;阳离子脂质体介导转染人结肠癌细胞SW480,给予不同剂量γ射线照射,流式细胞仪检测照射后不同时间点EGFP的表达。结果：电离辐射能够诱导Egr-1启动子调控下游基因的表达,且6 Gy照射后最为明显,在照射后24 h达到高峰。结论：Egr-1启动子具有电离辐射诱导特性。     

小鼠Egr-1启动子的克隆及其辐射诱导特性的研究

目的：扩增Egr-1启动子并构建Egr-PGL重组质粒,探讨不同剂量X射线诱导被转染的NIH3T3细胞荧光素酶表达活性。方法：并利用PCR方法扩增Egr-1p与PGL3-E表达载体连接,用发光仪测定荧光素酶与底物反应的发光值,分析X射线诱导荧光素酶表达。结果：对PCR产物进行测序,序列基本正确;电泳检测重组质粒,有正确的特异性片段;重组质粒转染小鼠NIH3T3细胞鉴定Egr-1p的辐射调节特性,发现照射组发光值均高于假照组,75mGy照射组的表达量约为假照组的5倍,2、4、6、8和10Gy照射组的表达量分别约为假照组的5～7．5倍。结论：扩增得到的Egr-1启动子在不同剂量X射线照射下均具有诱导下游基因表达增强作用;低剂量照射诱导Egr-1启动子下游基因表达增强作用的发现可能在肿瘤基因治疗中更具有实用价值。     

辐射诱导表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用

目的：研究携带可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(shTRAIL)基因的辐射诱导表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL在人肝癌细胞株中的表达及其促凋亡作用。方法：体外通过脂质体转染SMMC7721细胞。转染细胞分别接受0(假照组)、2、5和10 Gy X线照射,ELISA法检测sTRAIL的表达;细胞分为正常SMMC7721组,分别接受0(假照组)、2和5 Gy X线照射的转染空质粒pshuttle-Egr1组及转染重组质粒pshutlle-Eyr1-shTRAIL组,采用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率;分别取SMMC772细胞、转染STRAIL细胞、转染空载体及照射组细胞,采用克隆形成实验检测细胞存活率。结果：不同剂量X射线照射SMMC7721-shTRAIL细胞上清中可溶性TRAIL表达量明显高于假照组（P< 0.001）;与假照组比较,照射转染后SMMC7721细胞的凋亡细胞百分数明显增加（P<0.05或P<0.001）,细胞存活率明显下降（P<0.05
或P<0.001）。结论：pshuttle-Egr1-shTRAIL     

pEgr1-hsTRAIL质粒对肺腺癌A549细胞放射敏感性及DR4和DR5表达水平的影响

目的:检测转染pEgr1-hsTRAIL质粒的人肺腺癌A549细胞放射敏感性变化及其对死亡受体（DR）4和DR 5 mRNA和蛋白表达的影响,探讨pEgr1-hsTRAIL质粒的辐射增敏效应和诱导细胞凋亡的可能机制。方法:实验分为正常对照（Normal control）组、pEgr1-hsTRAIL组、6 Gy X线照射组和pEgr1-hsTRAIL + 6 Gy X线照射组。A549细胞经过阳离子脂质体转染、X线深部治疗机照射后,利用平板克隆形成试验检测细胞放射敏感性,反转录RCR（RT-PCR）法检测DR4和DR5 mRNA表达变化,Western blotting法检测DR4和DR5蛋白表达的变化。结果：正常对照组和pEgr1-hsTRAIL组A549细胞的平均致死剂量（D0值）分别为3.26和1.91 Gy,说明pEgr1-hsTRAIL质粒能够增强A549细胞的放射敏感性。RT-PCR显示,转染pEgr1-hsTRAIL质粒对DR4和DR5 mRNA和蛋白表达水平无明显影响,而6 Gy X线照射后DR4和DR5 mRNA表达均显著高于正常对照组（P<0.05）,转染pEgr1-hsTRAIL质粒后再进行6 Gy X线照射,DR4和DR5 mRNA表达水平均显著高于正常对照组（P<0.05）,但只有DR5 mRNA表达水平显著高于6 Gy X线照射组（P<0.05）。Western blotting结果显示,与正常对照组比较,DR4和DR5蛋白在pEgr1-hsTRAIL组无明显变化,而在6 Gy X线照射和pEgr1-hsTRAIL + 6 Gy X线照射组表达增加,其中DR5蛋白在pEgr1-hsTRAIL + 6 Gy X线照射组增加更明显。结论:重组表达质粒pEgr1-shTRAIL能够增强A549细胞放射敏感性,且能增强DR5辐射诱导表达,而对DR4的辐射诱导表达无明显增强作用。     

放射诱导启动子的合成与鉴定及质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK的构建

[目的]合成放射诱导启动子序列并构建其调控双自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1( )/ECDglyTK.[方法]利用人工寡核苷酸片段合成放射诱导启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因转染Tca8113细胞,经流式细胞仪鉴定其辐射诱导特性.将pCEA-CDglyTK中双自杀基因CDglyTK亚克隆到pcDNA3.1( ),然后把合成启动子插入到CDglyTK上游构建质粒pcDNA3.1( )/E-CDglyTK并酶切鉴定,阳离子脂质体介导其转染舌鳞癌Tca8113细胞,RT-PCR观察CDglyTK表达及诱导放疗的增效作用.[结果]合成启动子序列分析与设计序列完全一致;低剂量放射线照射可诱导这种人工启动子增强GFP在Tca8113细胞中的表达;重组质粒的酶切图谱与预期一致;3 Gy放疗显著增强CDglyTK在Tca8113细胞中的表达.[结论]成功合成放射诱导启动子并构建由其调控双自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1( )/E-CDglyTK,为进一步研究肿瘤放射-基因治疗奠定了基础.     

脂质体介导E1A—TK基因转染人肺腺癌细胞A549体外研究

目的用脂质体转染真核表达质粒PcDNA3E1A-TK入人肺腺癌细胞A549,观察丙氧鸟苷(GCV)、X射线及二者联合对转染细胞的体外杀伤作用。方法用阳离子脂质体介导真核表达质粒PcDNA3E1A-TK转染人肺腺癌细胞A549,PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A-TK基因DNA整合、mRNA表达。MTT法测不同浓度GCV、不同剂量X射线及一定剂量X线照射后再给一定量GCV对转染细胞的生长抑制率。结果PCR、RT-PCR结果表明转染细胞有E1A-TK基因整合、mRNA表达。根据IC50,转染细胞对GCV、X射线的敏感性分别比亲代细胞提高111.3倍和2.9倍,在作用相同时间后,GCV+X线照射治疗对转染细胞的生长抑制作用比单纯GCV或X线治疗明显增强(P<0.01)。结论脂质体介导外源基因E1A-TK成功转入人肺腺癌A549细胞并获得表达;转染细胞获得了对GCV和X线的敏感性,GCV和X线对转染细胞有协同杀伤作用。     

放射控导正反馈基因环路对肺癌wt-p53基因靶向性表达的研究

目的 构建pE6R4/p53/GFP重组质粒并检测其在人非小细胞肺癌H1299(p53-/-)细胞的辐射诱导表达.方法 用嵌合型增强子E6R4取代pci-neo质粒的CMV增强子,将wt-p53cDNA全长序列、IRES2-EGFP报告基因片段构建于嵌合型增强子E6R4下游,获得pE6R4/p53/GFP重组质粒,采用脂质体法将重组质粒转染人非小细胞肺癌H1299(p53-/-)细胞;采用RT-PCR方法鉴定wt-p53基因整合情况;Western-blot方法检测不同辐射剂量8mV X线照射后,被转染细胞中wt-p53蛋白表达水平和持续时间.结果 酶切和测序鉴定pE6R4/p53/GFP重组质粒构建正确;不同剂量8mV X线照射后,4Gy照射剂量时wt-p53基因表达最强,且持续时间延长.结论 成功将辐射反应元件和正反馈基因环路技术相结合,实现了wt-p53基因的表达调控,为进一步研究非小细胞肺癌的放射-基因联合治疗奠定了基础.     

电离辐射对转染pcDNA3.1-Egr-1-AIF△1-480质粒的MCF-7细胞增殖和侵袭能力的影响

目的：探讨辐射增强靶向截短型凋亡诱导因子（AIFΔ1-480）对MCF-7细胞增殖和侵袭能力的影响,阐明其提高肿瘤基因-放射治疗的可能性。方法：人乳腺癌MCF-7细胞经质粒转染早期生长反应1(Egr-1)介导的AIFΔ1-480重组表达载体pcDNA3.1-Egr-1-AIFΔ1-480（pE-AIFΔ1-480）,2 Gy X射线照射后24 h,分别采用MTT法和Transwell侵袭实验检测细胞增殖和侵袭能力。实验分为正常对照组、pcDNA3.1组（只转染pcDNA3.1质粒）、pE-AIFΔ1-480组（转染pE-AIFΔ1-480质粒）、2 Gy X线照射组和pE-AIFΔ1-480+ 2 Gy X线照射组。结果：质粒转染并经2 Gy X线照射后,正常对照组、pcDNA3.1组和pE-AIFΔ1-480质粒组细胞生长较快,且增殖规律基本一致。与正常对照组比较,2 Gy X线照射组和pE-AIFΔ1-480 + 2 Gy X线照射组细胞增殖能力显著降低（P<0.05）,且以pE-AIFΔ1-480+ 2 Gy X线照射组降低更明显,从12 h开始较2 Gy X线照射组明显降低（P<0.05）。正常对照组、pcDNA3.1组和pE-AIFΔ1-480组穿过基底膜细胞数基本一致,而2 Gy X线照射组和pE-AIFΔ1-480+ 2 Gy 照射组穿过基底膜细胞较正常对照组明显减少（P<0.05或P<0.01）,并且pE-AIFΔ1-480+2 Gy照射组穿过基底膜的细胞数较2 Gy照射组减少更明显（P<0. 01）。结论：AIFΔ1-480和电离辐射均能抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭,二者具有协同作用,并且Egr-1启动子能增强辐射条件下的抑制效果。     

pshuttle-Egr-1-hSmac质粒联合X线照射对乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖的抑制作用

目的:构建pshuttle-Egr-1-hSmac质粒并转染人乳腺癌MDA-MB-435细胞,观察其抑制肿瘤细胞的辐射增敏作用。方法：转染pshuttle-Egr-1-hSmac质粒的MDA-MB-435细胞经过2 Gy X线照射不同时间（4、8、12、24 和48 h）和0.5 ~ 5.0 Gy X线照射后24 h收集细胞,采用RT-PCR和Western blotting法检测Smac mRNA及其蛋白表达。将细胞分为对照组、pshuttle质粒组、pshuttle-Egr-1-hSmac 质粒组、2 Gy 组、pshuttle+2.0 Gy组 和pshuttle-Egr-1-hSmac+ 2.0 Gy组,MTT法检测各组细胞增殖;克隆形成实验检测细胞存活能力;Annexin Ⅴ-FITC双染法检测细胞凋亡;PI单染法检测细胞周期。结果:对照组和pshuttle质粒组MDA-MB-435细胞中Smac mRNA无表达,而pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组MDA-MB-435细胞Smac mRNA表达水平随时间延长逐渐升高,于24和48 h时表达水平最高;经0.5 ~ 5.0 Gy X线照射后24 h MDA-MB-435细胞Smac mRNA表达水平随照射剂量增加而逐渐增加,在2.0和5.0 Gy X线照射后Smac mRNA表达水平最高。pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组4、8、12和24 h后Smac蛋白表达水平逐渐升高,24 h后表达水平最高。经过0、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy X线照射后24 h Smac蛋白表达水平逐渐升高,尤其以5.0 Gy X线照射时表达水平最高。MTT法检测时程效应,2.0 Gy、pshuttle+2.0 Gy和pshuttle-Egr-1-hSmac+2.0 Gy质粒组24、48和72 h细胞A490值明显低于对照组（P<0.01）;剂量效应,pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组1.0～5.0 Gy X线照射后,MDA-MB-435细胞A490值明显低于0 Gy X线照射(P<0.05或P<0.01)。pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组细胞存活分数明显低于对照组（P<0.01）。pshuttle-Egr-1-hSmac+2.0 Gy组细胞凋亡率明显高于2.0 Gy组（P<0.01）,G0/G1期和S期细胞百分率明显低于2.0 Gy照射组（P<0.01）,G2/M期细胞百分率明显高于2.0 Gy组（P<0.01）。结论：X线照射能增加pshuttle-Egr-1-hSmac质粒转染的MDA-MB-435细胞有效表达Smac mRNA及蛋白,能抑制细胞存活,且诱导G2/M期阻滞和凋亡增加;Smac基因联合放射治疗可明显增加乳腺癌细胞的放射敏感性。     

Egr-1启动子调控hNIS基因的重组质粒构建及转染细胞株的建立

目的构建早期生长反应基因-1（Egr-1）启动子调控人钠碘转运体（hNIS）基因的重组质粒并稳定转染人宫颈癌细胞株Hela,评价Egr-1启动子对hNIS蛋白功能的辐射诱导作用。方法以Egr-1／pMRl8T为模板PCR扩增Egr-1启动子序列,亚克隆至真核表达载体FL％-hNIS／pcDNA3,构成重组质粒Egr-1-hNIS／pcDNA3,酶切电泳鉴定,通过FuGENEHD转染入Hela细胞,G418筛选抗性克隆,获取单克隆Hela—Egr-1-hNIS。分别采用流式细胞仪、RT．PCR检测Hela-Egr-1-hNIS细胞系中NIS基因和NIS蛋白的表达。动态摄取碘一125实验观察Hela—Egr-1-hNIS细胞和前期研究所得细胞株Hela—NIS（＋）给予不同剂量的x线辐照前后的摄碘功能。未转染的Hela细胞作为阴性对照组。结果成功构建重组质粒Egr-1．hNIS／pcDNA3,转染Hela细胞后获得了稳定表达细胞系Hela—Egr--一hNIS,流式细胞仪测得NIS表达效率为11．2％;RT—PCR检测到Hela—Egr-1-hNIS有NISmRNA的转录,而对照组无NIS蛋白表达。动态摄碘实验提示Hela—Egr-1-hNIS细胞摄碘能力比阴性对照Hela细胞提高了13倍;辐照后摄碘能力增强,在0～6Gy范围内与辐射剂量成正相关（r=0．960,P〈0．05）;而Hela—NIS（＋）组辐照后摄碘功能下降,与辐射剂量无相关性（r=-0．770,P〉0．05）。结论成功构建Egr-1启动子调控的稳定表达hNIS蛋白的Hela-Egr-1-hNIS细胞系,该细胞系具有较强的摄碘功能及辐射诱导作用,有望在体内治疗中获得更好的治疗效果。     

辐射诱导性自杀基因在胰腺癌细胞中的表达

目的 利用辐射敏感的早期生长反应基因1(Egr-1)启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK),观察其在胰腺癌细胞中的表达效果.方法 以细菌内同源重组法构建含绿色荧光蛋白(GFP)做标志基因的TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胰腺癌细胞系PC-3 60Co-γ射线照射后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析各不同照射剂量组TK基因的mRNA表达.Western印迹法分析60Co-γ射线照射后转染pAdEgr-1-TK细胞中TK蛋白质的表达量.结果 重组腺病毒载体pAdEgr-1-TK转染胰腺癌细胞系PC-3,不同剂量60Co-γ射线照射后,经RT-PCR半定量分析,TK mRNA表达结果分别为0 Gy(67.3±2.1)%、5 Gy为(89.3±1.0)%、7.5 Gy为(114.7±5.7)%、10 Gy为(140.5±3.1)%、15 Gy为(134.5±4.0)%、20 Gy为(117.4±3.4)%,各照射组TKmRNA表达均明显高于对照组0 Gy(均P<0.01),尤以剂量为10.0 Gy时最为显著.Western印迹分析结果分别为0 Gy为(5.4±0.7)%,5 Gy为(7.6±0.9)%,7.5 Gy为(21.5±1.5)%,10 Gy为(35.7±1.4)%,15 Gy为(32.1±1.2)%,20 Gy为(28.8±1.5)%,60Co-γ射线照射可明显提高转染pAdEgr-1-TK细胞中TK的蛋白质表达量,且蛋白质表达量与辐射剂量呈正相关性.结论 放射敏感性启动子Egr-1基因可驱动TK自杀基因在胰腺癌细胞中高效表达.     

伽马射线对重组质粒(CArG)_6-hTERTp-SEA-GPI在人肿瘤A549细胞和成纤维细胞WI-38中的SEA表达的影响

目的:观察γ-射线对重组质粒(CArG)6-hTERTp-SEA-GPI在人肿瘤A549细胞和人正常细胞WI-38中的SEA表达的影响。方法:重组质粒(CArG)6-hTERTp-SEA-GPI分别转染A549和WI-38细胞,转染后12h2Gyγ-射线照射肿瘤细胞和正常细胞,转染后24h后采用RT-PCR法检测SEA mRNA的表达,转染后48h采用Western blot法检测SEA蛋白的表达。结果:(CArG)6-hTERTp-SEA-GPI能够在肿瘤细胞A549细胞中表达SEA,正常细胞WI-38细胞中不能表达SEA;2Gyγ-射线可以诱导转染(CArG)6-hTERTp-SEA-GPI质粒的A549细胞SEA mRNA和蛋白的表达,表达量分别增加115.4%和24.2%。结论:重组质粒(CArG)6-hTERTp-SEAGPI能够在肿瘤细胞A549中选择性表达SEA,且2Gyγ-射线可以增强SEA的表达水平。