TNF-α对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性的影响及罗格列酮的干预作用

目的观察肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性的影响及罗格列酮的干预作用。方法采用不同浓度TNF-α（5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）处理3T3-L1脂肪细胞48h、采用20μg/ml TNF-α处理不同时间（6h、12h、24h、48h）及罗格列酮（10μmol/ml）预处理6h的3T3-L1脂肪细胞与20μg/mlTNF-α作用48h;以2-DG摄入法检测细胞对葡萄糖的摄取率。结果与对照组比较,5μg/L、10μg/L和20μg/LTNF-α作用各组分别使葡萄糖摄取率减少了25%（P〈0.01）、43%（P〈0.01）、58%（P〈0.01）;20μg/L TNF-α处理3T3-L1脂肪细胞6h、12h、24h、48h使葡萄糖的摄取率分别减少10%（P〈0.05）、28%（P〈0.01）、40%（P〈0.01）、57%（P〈0.01）,罗格列酮预处理能使20μg/ml TNF-α组脂肪细胞对葡萄糖的摄取率增加37%（P〈0.01）。结论TNF-α以浓度和剂量依赖方式导致脂肪细胞胰岛素抵抗;罗格列酮能明显改善此作用。     

辛伐他汀对脂多糖介导的3T3-L1脂肪细胞分泌白细胞介素6和脂联素的影响

目的观察辛伐他汀对脂多糖（LPS）介导的3T3-L1前脂肪细胞分泌和表达白细胞介素6（IL-6）和脂联素的影响。方法3T3-L1前脂肪细胞体外培养并诱导成为成熟的脂肪细胞,不同浓度梯度（0,0.1,1.0,10mmol/L）辛伐他汀体外培养16h后,加入脂多糖（100ng/ml）刺激8h,用半定量逆转录聚合酶链反应方法（RT-PCR）检测IL-6和脂联素mRNA的表达,酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养液中IL-6和脂联素的分泌情况。结果脂联素的表达水平随辛伐他汀呈剂量依赖性增加,而炎症因子IL-6随浓度增加呈下降趋势,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论辛伐他汀可以直接作用于脂肪细胞发挥抗炎作用。     

IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立

目的探讨3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞（insulin resistant 3T3-L1 adipocytes cell, IR-3T3-L1）最佳的建立条件。方法采用
地塞米松（Dexamethason,DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）和不同浓度的胰岛素（10-8、10-7、
10-6 mol·L-1）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,Oil red O染色确定最佳胰岛素诱导浓度,继而用1 μmol·L-1 DEX
诱导建立IR-3T3-L1 脂肪胰岛素抵抗细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（Glucose oxidase-peroxidase, GOD-POD）法对
IR-3T3-L1细胞的最佳诱导时间（24~120 h）及其稳定时间（24~48 h）进行了考察。结果Oil red O染色发现3T3-L1前脂肪细胞
用DEX、IBMX和10-6 mol·L-1胰岛素诱导9 d,>90% 的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;用1 μmol·L-1 DEX培养96 h后,脂肪
细胞葡萄糖消耗率达到最大（P=0.0003）;稳定时间考察发现,在36 h内葡萄糖消耗与对照组比较有统计学意义（P<0.001）。结
论3T3-L1前脂肪细胞在1 μmol·L-1 DEX、0.5 mmol·L-1 IBMX 和10-6 mol·L-1最佳胰岛素浓度作用下诱导分化为成熟的脂肪细
胞后,用1 μmol·L-1 DEX培养96 h即可成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪胰岛素抵抗细胞,且在36 h内稳定。
     

TNF-α对未分化及成熟3T3-L1脂肪细胞中TSG-6基因表达的调节作用

目的：探讨TNF-α对未分化及成熟3T3-L1脂肪细胞中TSG-6基因(tumor necrosis factor alpha-stimulated gene-6)表达水平的调节作用.方法：体外培养3T3-L1脂肪细胞．在3T3-L1细胞生长至完全融合后2天(第0天)或细胞诱导分化的第10天,应用重组TNF-α(0．1、1．0、10．0ng／ml)干预未分化(第0天)或已分化成熟(第10天)的脂肪细胞,采刖RT-PCR技术检测干预后不同时间(0、0．5、2．0、6、0、12、0、24．0h)脂肪细胞中TSG-6基因的表达水平。结果：①不同浓度TNF-α对未分化脂肪细胞中TSG-6基因的表达水平均具抑制作用。TNF-α浓度0.1ng/ml时,TSG-6基因表达水平2h内下降67．30%,24h时下降76．05%;TNF-α浓度1．0ng／ml时,TSG-6基因表达水平0．5h内下降52.79％,24h时下降99.20％：TNF-α浓度10．0ng／ml时,TSG-6基因表达水平0．5h内下降96．14％,其表达几乎被完全抑制：②不同浓度TNF-α均能显著抑制成熟脂肪细胞中TSG-6基因的表达。TNF-α浓度0.1ng／ml时,TSG-6基因表达水平6h内下降33．73％,12h内下降97.39％;TNF-α浓度1.0ng／ml时,TSG-6基因表达水平6h内下降78．68%,并持续至24h;TNF-α浓度10.0ng／ml时,TSG-6基因表达水平2h内下降96．27％．TSG-6基因的表达几乎被完全抑制。结论：TNF-α对脂肪细胞中TSG-6基因表达具有抑制作用．其抑制效应总体趋势上呈现剂量和时间依赖性特征．     

内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

目的观察内质网应激(ERs)抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)对ERs诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的干预效果,探讨脂肪细胞IR与ERs的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。以MTT比色法检测不同干预条件下脂肪细胞存活情况、以葡萄糖氧化酶法(GOD)法检测不同干预条件下脂肪细胞葡萄糖消耗情况,利用Western blot检测不同干预条件下ERs关键信号蛋白(P-IRE、IRE)的表达差异。结果 (1)5μg/mL TM作用5h后可使胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量降低19.7%(P<0.05),而1mmol/L TUDCA预处理24h后均可缓解TM的抑制作用。(2)Westernblot显示,5μg/mL TM作用5h明显增加P-IRE的表达,而经1mmol/L TUDCA预处理24h后可减少P-IRE的表达。不同处理因素对总IRE的表达无明显影响。结论 ERs可诱导3T3-L1脂肪细胞发生IR,缓解ERs可减轻IR。     

人绒毛膜促性腺激素对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ及脂联素mRNA表达的影响

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素(HCG)对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)及脂联素mRNA表达的影响.方法:分别用50、500和5000 U/L HCG干预未分化脂肪细胞2、4和6 d,未用HCG干预为空白对照组,PT-PCR测定PPARγ mRNA的表达;用诱导分化液(1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+10 ng/L胰岛素)诱导3T3-L1脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定后用5000 U/L HCG干预成熟脂肪细胞6、12和24 h,未用HCG干预为空白对照组,用RT-PCR测定PPARγ及脂联素mRAN的表达情况.结果:不同剂量HCG干预未分化3T3-L1脂肪细胞,与空白对照组相比,不同剂量干预组未分化脂肪细胞PPARγ mRNA的表达量均增加,差异有统计学意义(F=19.823、21.352和23.519,P均<0.001);不同剂量HCG干预组组间比较,5000 U/L剂量干预组PPARγ的表达量较50和500 U/L剂量组增加,差异均有统计学意义(P均<0.05):50和500 U/L剂量组比较,PPARγ mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05).5000 U/L HCG干预已分化3T3-L1脂肪细胞后,空白对照组、干预6、12和24 h组相比,脂肪细胞PPARγ mRNA的表达差异有统计学意义(F=26.907,P<0.001),脂联素mRNA的表达差异无统计学意义(F=0.066,P=0.976).结论:HCG可能促进313-L1脂肪细胞的分化,但对脂联素的分泌无影响.     

辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞Apelin mRNA表达的影响

目的:观察辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞中Apelin mRNA表达影响,为探讨Apelin在心力衰竭发病中的作用以及他汀类药物抗炎作用提供依据.方法:用辛伐他汀溶液刺激诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,辛伐他汀浓度分别为0、1、10 μ mol/L,作用时间设为24h和48h.提取脂肪细胞总RNA,运用实时荧光定量聚合酶链反应技术测定Apelin mRNA表达量的变化.结果:经辛伐他汀干预后3T3-L1脂肪细胞Apelin mRNA表达降低,高浓度的辛伐他汀对Apelin mRNA的表达有显著的抑制作用(P<0.05).在相同药物浓度下,不同作用时间各组之间差异无显著性(P>0.05). 结论:辛伐他汀可使3T3-L1脂肪细胞中Apelin mRNA表达减少,并具有药物浓度依赖性.这可能部分解释了辛伐他汀的抗炎作用.     

氧化应激对3T3-L1脂肪细胞MCP-1、PAI-1、脂联素表达的影响

目的观察氧化物质第三丁基过氧化氢(t-BHP)对3T3-L1脂肪细胞表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、1型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、脂联素的影响初步探讨氧化应激引发脂肪细胞功能障碍的可能作用机制。方法培养3T3-L1脂肪细胞,将其诱导分化为成熟的脂肪细胞,不同浓度t-BHP(100,200,300,400,500μmol/L)作用10min后继续培养。MTT比色法检测24h时3T3-L1脂肪细胞的存活率;荧光定量PCR检测8h时MCP-1、PAI-1、脂联素的表达,Real-time PCR检测t-BHP(500μmol/L,10min)作用于3T3-L1脂肪细胞后不同时间点(2,4,8,12,24h)MCP-1、PAI-1、脂联素的表达。结果 (1)t-BHP对3T3-L1脂肪细胞的存活状态无明显影响;(2)t-BHP可剂量依赖性的降低脂联素而增加MCP-1、PAI-1mRNA的表达;(3)500μmol/L的t-BHP对脂联素、MCP-1、PAI-1的调节具有时间相关性。结论氧化损伤能够促进MCP-1、PAI-1的表达、抑制脂联素的表达,这是其介导脂肪细胞功能障碍的可能机制之一。     

替米沙坦对脂多糖诱导3T3-L1脂肪细胞生成炎性因子的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂替米沙坦对小鼠3T3-L1脂肪细胞合成白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影响。方法脂肪细胞诱导至90%成熟,随机分为5组：对照组,脂多糖（LPS）组,LPS＋替米沙坦组,其中替米沙坦设0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml 3个浓度梯度。对照组中加DMSO,LPS＋替米沙坦组中加不同浓度替米沙坦,孵育2h后,再向LPS组和LPS＋替米沙坦组加入LPS（1μg/ml）,与替米沙坦共同孵育细胞1h。酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组IL-6和TNF-α的蛋白分泌水平,Q-PCR检测各组IL-6和TNF-αmRNA基因表达。结果脂多糖处理后IL-6分泌较对照组增加约2.7倍,IL-6mRNA表达增加4倍。替米沙坦干预后各组IL-6浓度较脂多糖组均明显下降,10μg/ml组降低67%,IL-6mRNA表达随替米沙坦浓度升高而下降,10μg/ml组下降约63%。此外,与对照组相比,脂多糖处理组TNF-α分泌增加1.3倍,其mRNA表达增加3.5倍,替米沙坦干预后,各组TNF-α蛋白分泌及mRNA表达均较脂多糖组明显降低,大剂量替米沙坦干预后（10μg/ml）,TNF-α蛋白分泌下降约85%,mRNA表达下降约23%。结论替米沙坦通过影响脂肪细胞炎性因子的产生发挥抗炎作用,10μg/ml大剂量时作用尤为明显。     

睾酮对3T3-L1脂肪细胞炎症因子生成的影响及其机制研究

目的 探讨睾酮对3T3-L1成熟脂肪细胞炎症因子生成的影响及分子机制.方法 3T3-L1前脂肪细胞诱导成熟,采用不同浓度睾酮(10-9、10-7、10-5mol/L)分别处理10～30 min及12、24及48 h后,提取上清液用ELISA法检测炎症因子白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的浓度;RT-PCR检测细胞内IL-6、MCP-1mRNA的生成;免疫印迹检测核因子-κB(NF-κBp65)的磷酸化及表达.随后再用10-4mol/L NF-κB的抑制剂吡咯二烷二硫氨基甲酸(PDTC)预处理2 h,再加入睾酮,再观察上述结果的变化.结果 (1)与无睾酮组相比,睾酮3种浓度处理组3T3-L1脂肪细胞上清液IL-6、MCP-1的含量均明显增多(P<0.05),以10-5moL/L睾酮处理24 h时上清液两种因子含量较其他处理组明显增多(P<0.05).与无睾酮组相比,睾酮3种浓度处理组3T3-LI脂肪细胞12 h时,IL-6、MCP-1 mRNA的水平明显增加(P<0.05),以10-5moL/L睾酮处理12 h时两种因子的mRNA水平较其他组明显增加(P<0.05);(2)睾酮3种浓度短时间(10～30 min)处理3T3-L1脂肪细胞时,与无睾酮组相比,均可使NF-κBp65的磷酸化增加(P<0.05),其中以10-5mol/L的作用最明显(P<0.05);睾酮处理3T3-LI脂肪细胞12 h时,NF-κB p65的磷酸化明显增加(P<0.05),其中以10-9和10-5mol/L组较其他组作用明显(均P<0.05);(3)用NF-κB的抑制剂PDTC预处理2 h后,再用睾酮处理,上清液两种因子含量及其mRNA水平明显降低(均P<0.05).结论 睾酮可通过NF-κB途径促进成熟脂肪细胞炎症因子的分泌.     

血清淀粉样蛋白A在3T3-L1脂肪细胞的表达及其与胰岛素抵抗的关系

目的 了解血清淀粉样蛋白A(SAA)在3T3-L1脂肪细胞的表达情况及其与胰岛素抵抗的关系.方法 用3种不同浓度的地塞米松(10、100、1000nmol/L)建立3种不同程度的脂肪细胞胰岛素抵抗模型(分别称为模型组1、模型组2、模型组3),同时设立空白对照组.采用2-脱氧-3H-D-葡萄糖摄入法检测葡萄糖的摄入情况.以葡萄糖摄入减少的百分比反映胰岛素抵抗程度;RT-PCR技术检测各组SAAmRNA的表达,ELISA检测SAA蛋白的表达.结果 各组基础状态下葡萄糖的摄取率无明显差异(P>0.05);胰岛素刺激后模型组1、模型组2、模型组3的葡萄糖摄取率分别比对照组减少了15%(P<0.05)、40%(P<0.01)、55%(P<0.01);SAAmRNA的表达量分别是对照组的2.5(P<0.01)、3.33(p<0.01)、4.08倍(P<0.01);SAA蛋白表达量分别是对照组的2.05(P<0.05)、3.13(P<0.01)、4.23倍(P<0.01);相关分析显示3T3-L1脂肪细胞SAA mRNA的表达量(r=0.773,P<0.01)和蛋白表达量(r=0.832,P<0.01)与胰岛素抵抗程度均呈正相关.结论 采用地塞米松干预3T3-L1脂肪细胞可成功建立胰岛素抵抗模型;脂源性炎症因子SAA与胰岛素抵抗密切相关,它可能是胰岛素抵抗的一个标记物.     

重组人促红细胞生成素对3T3-L1脂肪细胞促红细胞生成素受体表达及下游信号通路的影响

目的 探讨重组人促红细胞生成素( rHuEPO)对正常和胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞促红细胞生成素受体(EPOR)表达及其下游信号通路的调控作用.方法 以1μmoL/L地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛索抵抗模型(模型组),以分化成熟的正常3T3-L1脂肪细胞作为对照组.采用细胞免疫荧光法和Western blotting法检测细胞EPOR的蛋白表达,采用Real-TimePCR技术检测细胞EPOR mRNA的表达.分别以rHuEPO、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂(LY294002)及信号转导和转录激活因子5( STAT5)抑制剂对模型组和对照组细胞进行干预,采用Western blotting法检测不同药物干预对EPOR蛋白的表达及其下游分子丝(苏)氨酸蛋白激酶( Akt)和STAT5磷酸化水平(p-Akt和p-STAT5蛋白的表达)的影响.结果 与对照组比较,模型组EPOR蛋白和mRNA的表达均显著下调(P＜0.05).干预实验结果显示:与相应对照组或模型组比较,rHuEPO+对照组或模型组EPOR、p-Akt和p-STAT5蛋白的相对表达量均显著上调(P＜0.05);与相应rHuEPO+对照组或模型组比较,rHuEPO+LY29400或STAT5阻断剂+对照组或模型组的p-Akt和p-STAT5蛋白的相对表达量显著下调(P＜0.05).结论 正常3T3 -L1脂肪细胞上存在EPOR,胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞EPOR蛋白和mRNA的表达下调,rHuEPO可通过EPOR介导激活PDK-Akt和JAK2 -STAT5信号通路.     

L-4F对oxLDL刺激下脂肪细胞表达单核细胞趋化蛋白-1的影响

目的观察载脂蛋白A-I模拟肽L-4F对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)刺激下3T3-L1脂肪细胞分泌表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 3T3-L1脂肪细胞促分化成熟后,oxLDL(50μg/ml)刺激脂肪细胞,给予L-4F(1-50μg/ml),H-89(10μmol/L)及H-89+L-4F(50μg/ml)干预,收集细胞,测定脂肪细胞MCP-1上清液中的浓度和mRNA表达水平,以及脂肪细胞核因子C/EBPα、β的蛋白质水平;改良Boyden小室法检测不同干预组上清液对人外周血单核细胞趋化活性的影响。结果 OxLDL(50μg/ml)刺激使分化成熟的3T3-L1脂肪细胞表达及分泌MCP-1明显增加,并使得诱导的单核细胞移动距离明显增加。L-4F以浓度依赖的方式减少脂肪细胞MCP-1的表达和分泌,降低单核细胞趋化活性;50μg/ml L-4F使MCP-1 mRNA的表达降低(91±6)%(P<0.01)。PKA抑制剂H-89(10μmol/L)干预oxLDL刺激的脂肪细胞后MCP-1 m RNA的表达也显著减少(P<0.01),但是,在50μg/ml L-4F作用的基础上,H-89(10μmol/L)的孵育并未使得MCP-1 mRNA的表达进一步降低(P>0.05)。50μg/ml oxLDL刺激对脂肪细胞C/EBPα的含量无明显影响,但增加C/EBPβ蛋白量,且该作用呈时间依赖性;L-4F和H-89干预均降低C/EBPβ的蛋白质含量。结论 OxLDL时间依赖性地诱导脂肪细胞C/EBPβ的蛋白合成,并增强脂肪细胞MCP-1的表达分泌,L-4F以浓度依赖的方式对抗oxLDL的致炎作用,cAMP/PKA-C/EBPβ信号通道可能是L-4F的作用途径之一。     

3T3-L1脂肪细胞诱导分化与肿瘤抑制因子PTEN的表达研究

目的 优化3T3-L1脂肪细胞分化条件,研究信号因子PTEN在分化过程中的表达,以了解PTEN是否通过表达量来调节正常脂肪细胞形成,为探索PTEN的药物靶标作用奠定基础.方法 DMEM高糖培养基培养3T3-L1脂肪前体细胞,地塞米松、3-异丁基1-甲基黄磦呤(IBMX)和胰岛素按2种组合方案分别诱导3T3-L1细胞分化,油红O染色鉴定脂肪细胞,蛋白裂解液提取细胞总蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分化过程中PTEN的表达量,用生物信息学进行小鼠和人类PTEN的同源性分析.结果 1 μmol/L地塞米松、0.5 μmol/L mMX和5 μg/ml胰岛素诱导48 h后,再用含5 μg/ml胰岛素的DMEM高糖营养液培养48 h的方案对3T3-L1细胞诱导分化效果较好,脂肪细胞分化率高且均一,在分化第10天可见90%以上细胞分化为脂肪细胞.PTEN在脂肪细胞分化过程中表达量在第0、4 th、6 th、9 th和第12天时不一致,在12天时明显下降,显著低于诱导前.同源性比对分析表明,小鼠和人类的PTENmRNA编码序列匹配率为96%,而氨基酸序列匹配率为100%.结论 内源性PTEN在小鼠3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化为脂肪细胞的时相过程中表达量有所变化,提示PTEN可能在生理条件下即可发挥提高胰岛素敏感性和促进脂肪细胞形成的作用.