巢蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白在大鼠视网膜发育中的动态表达

目的 观察巢蛋白(nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在大鼠视网膜发育中的动态变化.方法 48只Wistar大鼠,其中24只大鼠分为出生后1 d,1、2、3、4、7、12、20周8组,每组3只.制作眼球矢状位冰冻切片,采用共聚焦激光显微镜观察nestin和谷氨酰胺合成酶(GS)以及GFAP和GS免疫荧光染色情况.18只大鼠分为出生后id,1、2、3、4、12周,每组3只.提取大鼠视网膜总RNA,实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测nestin、GFAP和GS mRNA表达.选择6只出生后7～12 d新生鼠,取眼球体外培养Müller细胞,行GS和(或)nestin免疫荧光染色,共聚焦激光显微镜观察荧光染色情况.结果 出生后1 d,nestin免疫阳性细胞贯穿神经视网膜全层,主要定位于视网膜前体细胞放射状排列的细长纤维中,在视网膜内侧出现GFAP阳性的星形胶质细胞.出生后1周出现表达GS的Müller细胞,同时表达nestin,但不表达GFAP;GFAP阳性细胞仍然位于视网膜内侧.出生后2～12周,nestin在Mfiller细胞上的表达逐渐减少直至消失,GFAP在星形胶质细胞中的表达强度投有显著变化.体外培养的Müller细胞表达nestin,不表达GFAP.Nestin和GFAP mRNA在视网膜中的表达与免疫荧光染色结果相一致.结论 随大鼠视网膜不断发育,Müller细胞上nestin表达逐渐减少,成年大鼠视网膜Müller细胞不再表达nestin;新生鼠和成年鼠Müller细胞均不表达GFAP.     

巢蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白在大鼠视网膜发育中的动态表达

目的 观察巢蛋白(nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在大鼠视网膜发育中的动态变化.方法 48只Wistar大鼠,其中24只大鼠分为出生后1 d,1、2、3、4、7、12、20周8组,每组3只.制作眼球矢状位冰冻切片,采用共聚焦激光显微镜观察nestin和谷氨酰胺合成酶(GS)以及GFAP和GS免疫荧光染色情况.18只大鼠分为出生后id,1、2、3、4、12周,每组3只.提取大鼠视网膜总RNA,实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测nestin、GFAP和GS mRNA表达.选择6只出生后7～12 d新生鼠,取眼球体外培养Müller细胞,行GS和(或)nestin免疫荧光染色,共聚焦激光显微镜观察荧光染色情况.结果 出生后1 d,nestin免疫阳性细胞贯穿神经视网膜全层,主要定位于视网膜前体细胞放射状排列的细长纤维中,在视网膜内侧出现GFAP阳性的星形胶质细胞.出生后1周出现表达GS的Müller细胞,同时表达nestin,但不表达GFAP;GFAP阳性细胞仍然位于视网膜内侧.出生后2～12周,nestin在Mfiller细胞上的表达逐渐减少直至消失,GFAP在星形胶质细胞中的表达强度投有显著变化.体外培养的Müller细胞表达nestin,不表达GFAP.Nestin和GFAP mRNA在视网膜中的表达与免疫荧光染色结果相一致.结论 随大鼠视网膜不断发育,Müller细胞上nestin表达逐渐减少,成年大鼠视网膜Müller细胞不再表达nestin;新生鼠和成年鼠Müller细胞均不表达GFAP.     

胶质纤维酸性蛋白在青光眼大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达

目的:探讨胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在青光眼大鼠视网膜Müler细胞上的诱导表达情况及可能的意义。方法:采用烧灼涡静脉的方法制作大鼠青光眼模型,分别于术后2h;1,3d;1,2,3wk取材,制作视网膜矢状位冰冻切片和视网膜铺片,进行GS/GFAP免疫荧光双标。提取视网膜总蛋白行GFAP免疫印迹半定量分析。结果:视网膜矢状位切片可见,正常大鼠视网膜中,GFAP阳性染色只出现在神经节细胞层的星形胶质细胞上,而Müller细胞不表达GFAP。制作青光眼模型术后2h,Müller细胞上出现GFAP阳性染色,术后1,3d,GFAP的表达显著增加,到术后1wk,GFAP在Müller细胞上的表达量达到高峰,一直持续到术后3wk,免疫印迹半定量分析与以上结果吻合。术后1wk视网膜铺片中清晰可见Müller细胞足板出现GFAP的诱导表达。结论:高眼压时GFAP在Müller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达是Müller细胞对眼压升高产生的一种反应,GFAP可能是一种潜在的有用的生物标记物。     

Nestin在视神经横断大鼠视网膜Müller细胞上的诱导表达

目的:探讨中间丝蛋白nestin在视神经横断大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及可能的意义。方法:制作大鼠视神经横断模型,分别于术后1,3,7d取材,制作视网膜矢状位冰冻切片,进行GS/nestin,免疫荧光双标。提取视网膜总RNA行nestin Real-time PCR半定量分析。结果:正常大鼠视网膜中几乎看不到nestin阳性染色。术后1d,在Müller细胞上出现nestin的诱导表达,术后3d,nestin在Müller细胞上的表达进一步增强,术后1wk,nes-tin在Müller细胞上的表达保持在较高水平,Real-time PCR半定量分析与以上结果吻合。结论:视神经横断后nestin在Müller细胞上的诱导表达是Müller细胞对视网膜损伤产生的一种反应,Nestin的表达量在一定时间内与病程进展相一致。Nestin在Müller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达可能对视网膜神经节细胞具有保护作用。     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4的影响

目的 观察高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4(ATF4)的影响.方法 组织块悬浮法体外原代培养Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜Müller细胞,用链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)法对Müller细胞进行神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及谷氨酰胺合成酶(GS)的鉴定.将培养的视网膜Müller细胞分为正常对照组和A、B、C组,正常对照组使用5.5 mmol/L葡萄糖培养液,A、B、C组分别使用20.0、30.0、40.0 mmol/L葡萄糖培养液进行.培养4d后,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组视网膜Müller细胞上ATF4蛋白的表达.结果 体外培养的细胞均为视网膜Müller细胞,95％以上细胞染色呈GFAP及GS阳性.A、B、C组视网膜95％的Müller细胞呈阳性.Western blot检测显示,4d后A、B、C组Müller细胞表达ATF4蛋白的量均较正常对照组升高,组间比较,差异有统计学意义(q＝0.293、0.754、0.484,P＜0.05).结论 高糖能促使体外培养下的视网膜Müller细胞表达内质网应激蛋白ATF4增加,高糖培养下的视网膜Müller细胞可发生内质网应激反应.     

慢性高眼压大鼠视网膜神经胶质细胞组织病理学改变

目的 研究青光眼视网膜神经胶质细胞组织病理学改变及其在青光眼视网膜神经节细胞损伤中的作用机制.方法 对照实验研究.选用造模成功的慢性高眼压雄性SD大鼠72只,眼压＞22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa).右眼为慢性高眼压眼,左眼为假手术对照眼.根据慢性高眼压模型建立的时间(手术结束时开始计算),将实验鼠分为6组(2、12 h,1 d,1、4、8周),每组12只鼠.正常组SD大鼠12只,平均眼压12.56 mm Hg.分别取实验各组(慢性高眼压)、假手术组及正常组大鼠4只眼球,冰冻切片行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色,在激光共焦显微镜下观察视网膜星形胶质细胞及Müller细胞的GFAP表达情况;分别取实验各组(慢性高眼压)和正常组大鼠4只眼球,在视网膜铺片上进行GFAP免疫组织化学染色,进行星形胶质细胞计数并观察其形态;分别取实验各组(慢性高眼压)、假手术组及正常大鼠4只眼球的鼻侧半视网膜,在视网膜铺片上行小胶质细胞标记物OX42免疫组织化学染色,进行小胶质细胞计数并观察其形态;取剩余的颢侧中周部视网膜,半薄切片行甲苯胺蓝染色并进行Müller细胞计数.对不同时间点慢性高眼压组与正常组大鼠细胞表达数最进行比较,采用单因素多水平设计定量资料的方差分析.结果 慢性高眼压模型建立后2 h,即有活化的小胶质细胞出现;1 d后小胶质细胞的数量开始增加,为(327.40±68.32)个/mm2;1周后小胶质细胞的数量达到高峰,为(965.06±86.63)个/mmw,与正常组小胶质细胞数最比较,差异有统计学意义(F=196.56,P＜0.01);其后小胶质细胞数量逐渐减少.慢性高眼压模型建立后12 h,星形胶质细胞及Müller细胞开始呈现活化状态;4周时两种细胞的活化程度达到高峰,以后活化程度逐渐下降,且活化的星形胶质细胞在结构上出现明显异常,表现为星形胶质细胞突起变得粗短、僵硬,胞体的星型结构破坏;但慢性高眼压组视网膜星形胶质细胞及Müller细胞数量与正常组相比,差异均无统计学意义(F=1.36,1.89;均P＞0.05).结论 在慢性高眼压条件下,小胶质细胞可能是视网膜最早发生病理学改变的组织;活化的星形胶质细胞可出现明显的形态和结构变化,其结果不仅将加速神经节细胞的损伤,同时也会形成不利于神经节细胞轴突再生的视网膜微环境.     

巢蛋白——一种新的视网膜损伤生物标记物

目的探讨Mller细胞在视网膜损伤中的作用,探讨巢蛋白(nestin)是否是一个更有价值的评价视网膜损伤的生物标记物。方法33只健康成年SD大鼠,其中3只做为正常对照,于各模型制作之前取材;6只制作大鼠视网膜缺氧模型,先于体积分数9%氧浓度箱中2h,其中3只在体积分数80%氧浓度中治疗2h后,均置于正常环境24h后取材;15只右眼制作青光眼模型,左眼作假手术对照,分别于术后2h、1d、3d、1周、3周取材(每个时间点3只);9只右眼制作视神经横断模型,分别于术后1d、3d、1周取材;作眼球矢状位冰冻切片,行nestin及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)或胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及GS免疫荧光双标记,共聚焦显微镜读片分析。结果健康成年SD大鼠视网膜Mller细胞不表达nestin和GFAP,视网膜损伤后(缺氧、青光眼、视神经横断),Mller细胞均出现nestin的诱导表达,青光眼模型中nes-tin在Mller细胞上的诱导表达随病程延长持续升高;视神经横断后1dMller细胞即出现nestin的诱导表...     

Nestin在视神经横断大鼠视网膜Müer细胞上的诱导表达

目的:探讨中间丝蛋白nestin在视神经横断大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及可能的意义.方法:制作大鼠视神经横断模型,分别于术后1,3,7d取材,制作视网膜矢状位冰冻切片,进行GS/nestin,免疫荧光双标.提取视网膜总RNA行nestin Real-time PCR半定量分析.结果:正常大鼠视网膜中几乎看不到nestin阳性染色.术后1d,在Müer细胞上出现nestin的诱导表达,术后3d,nestin在Müler细胞上的表达进一步增强,术后1wk,nestin在Müer细胞上的表达保持在较高水平,Real-time PCR半定量分析与以上结果吻合.结论:视神经横断后nestin在Müer细胞上的诱导表达是Müer细胞对视网膜损伤产生的一种反应,Nestin的表达量在一定时间内与病程进展相一致.Nestin在Müer细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达可能对视网膜神经节细胞具有保护作用.     

改良的人视网膜Müller细胞的原代培养方法与鉴定

背景 视网膜Müller细胞是视网膜重要的胶质细胞,也是视网膜干细胞的来源之一,研究Müller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义,而建立稳定的视网膜Müller细胞培养体系是相关研究的基础. 目的 优化分离培养和纯化人视网膜Müller细胞的方法,为相关的实验研究提供良好优质的Müller细胞来源. 方法 分离人供体眼视网膜组织,然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0.25％胰蛋白酶+100 U透明质酸酶混合溶液中进行消化,添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液1～2 ml终止消化,然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h,行半量换液,再以含10％胎牛血清的培养液进行传代.光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定,并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Müller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,对培养的细胞进行鉴定.结果 应用0.25％胰蛋白酶+100 U(商品单位)透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Müller细胞,原代培养后24 h细胞贴壁,培养后9～1Od细胞融合.培养的细胞胞体呈长圆形,细胞质丰富,部分细胞体两端锥状长突起,末端膨隆,细胞核大.传代后的细胞胞体大,呈扁平多角形,符合Müller细胞的形态.细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达,90％以上的细胞中GS呈强阳性表达. 结论 应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Müller细胞,分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养和传代的人视网膜Müller细胞产量高且纯度好.     

神经胶质成熟因子-β对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响及可能机制

目的 探讨神经胶质成熟因子-β(GMFB)对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响及可能作用机制。方法 采用腹腔注射链脲佐菌素(55 mg·kg^-1)的方法制备雄性SD大鼠的糖尿病模型,并按照随机数字表法分成STZ组、STZ+AAV-GMFB组、STZ+AAV-GMFB+colivelin组,每组15只。另取15只正常大鼠作为CON组。STZ+AAV-GMFB组、STZ+AAV-GMFB+colivelin组大鼠于成模8周后玻璃体内单次注射AAV-GMFB腺病毒载体5μL;STZ+AAV-GMFB+colivelin组大鼠在注射腺病毒基础上给予腹腔注射colivelin(2 mg·kg·d^-1),共注射4周;CON组和STZ组大鼠腹腔注射2 mL生理盐水。成模12周后,免疫荧光染色检测GMFB在Müller细胞中的表达,免疫组织化学染色检测GFAP的表达,ELISA检测视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量,Western blot检测视网膜中GMFB、p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达。结果 GMFB在STZ组Mülle...     

Revisiting nestin expression in retinal progenitor cells in vitro and after transplantation in vivo

The purpose of this study is to characterize the co-expression of nestin--a neuroectodermal stem cell and a reactive glial marker-with various mature retinal cell markers in retinal progenitor cells (RPCs) expanded in vitro, followed either by in vitro induction or subretinal transplantation. Rat RPCs derived from embryonic day (E) 17 rat retina were expanded in serum free defined culture, and induced to differentiate by all-trans retinoic acid (RA). Following induction, cells were stained for nestin in combination with retinal neuronal and glial markers. Cultured cells were collected for quantitative RT-PCR gene expression analysis prior to and after induction. In a second series, passage 2 RPCs were transplanted into the subretinal space of S334ter-3 retinal degeneration rats at postnatal day 28. After 1-4 weeks, sections through the transplant were double immunostained for nestin and various retinal specific neuronal markers. The cultured RPCs treated with RA exhibited nestin co-expression with various retinal specific markers, including protein kinase C alpha (PKC), neurofilament 200 (NF200), cellular retinaldehyde binding protein (CRALBP), and rhodopsin. Following RA induction, quantitative RT-PCR analysis demonstrated downregulation of nestin, PAX-6, thy1.1, and PKCalpha, and upregulation of rhodopsin, glial fibrillary acidic protein (GFAP), and CrX. No nestin coexpression was observed with any of the retinal specific neuronal markers in RPC transplants in vivo except for some nestin-immunoreactivity overlapping with GFAP positive cells in the host retina. The role of nestin as a unique neural stem/progenitor cell marker should be reconsidered. Nestin expression during RPC maturation appears to be different in vitro versus in vivo.     

色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的　观察色素上皮衍生因子（PEDF）对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞谷氨酰胺合成酶（GS）表达的影响。方法　将Sprague-Dawley大鼠分为模型组、模型对照组、PEDF干预组（干预组）、干预对照组,每组均为8只大鼠。模型组、干预组、干预对照组大鼠链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型。模型组大鼠不作任何干预,模型对照组为相同月龄的正常大鼠,干预组大鼠左眼玻璃体腔注射0.1 μg/μl的PEDF 10 μl,干预对照组大鼠左眼玻璃体腔注射相同容积的磷酸盐缓冲液。采用免疫组织化学法和实时荧光聚合酶链反应（PCR）法检测视网膜GS和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达变化。将视网膜Müller细胞置于高糖环境下培养,实验干预组中加入100 ng/ml PEDF,空白对照组加入相同容积的培养液,24 h后通过蛋白质免疫印迹（Western blot）法和实时荧光PCR法检测PEDF对Müller细胞GS和IL-1β表达的改变。流式细胞仪锚定蛋白-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶（Annexin V-FITC-PI）双染色法检测100ng/mlPEDF对高糖状态下Müller细胞凋亡的影响。结果　实时荧光PCR法从基因水平和免疫组织化学法从蛋白质水平检测均显示,相对于模型对照组大鼠,模型组大鼠视网膜GS表达降低,而IL-1β的表达升高,实时荧光PCR法：GS: t=4.23, P＜0.01;IL-1β: t=16.73,P＜0.01;免疫组织化学法：GS:t=5.13,P＜0.01;IL-1β: t=9.32, P＜0.01;干预组大鼠玻璃体腔注射PEDF 48 h后,IL-1β的表达下降,GS的表达升高,与干预对照组比较,实时荧光PCR法：GS: t=3.87,P＜0.01;IL-1β: t=3.61,P＜0.05;免疫组织化学法：GS:t=3.32, P＜0.05;IL-1β: t=2.63, P＜0.05。在高糖环境下,通过实时荧光PCR法和Western bot 法检测均显示PEDF可以下调IL-1β的表达,而上调GS的表达,与空白对照组比较,实时荧光PCR法：GS: t=2.89, P＜0.05;IL-1β: t=3.37, P＜0.05;Western blot：GS: t=2.66, P＜0.05;IL-1β: t=3.23, P＜0.05。流式细胞仪检测结果显示,PEDF可以抑制高糖环境下Müller细胞的凋亡,实验组凋亡率与空白对照组凋亡率比较,差异有统计学意义(t=3.21,P＜0.05)。结论　对于糖尿病大鼠,PEDF可能通过下调视网膜Müller细胞中IL-1β的表达来上调GS的表达,从而改善谷氨酸循环,抑制神经节细胞的死亡      

人视网膜星形胶质细胞发育及起源的研究

背景 视网膜星形胶质细胞是视网膜主要的神经胶质细胞,其起源及演变过程一直是国内外研究的热点和难点. 目的 探讨人胚胎眼视网膜星形胶质细胞的起源及发育.方法 收集33例自愿终止妊娠的流产人胚胎眼标本,其中8 ～12孕周者20例,15～ 17孕周者2例,19～ 23孕周者4例,25～ 28孕周者4例,30 ～32孕周者3例.对眼球壁切片进行常规组织病理学检查以观察不同胚龄人视网膜发育的形态学变化,分别采用免疫组织化学法及免疫荧光法动态观察不同胚龄人视网膜星形胶质细胞起源位点及发育过程中胶质纤维酸性蛋白( GFAP)表达的变化.结果 人胚6～7周视杯处于视网膜分层发育阶段,9周时视杯内层原无细胞层出现分化不成熟的圆短梭形细胞；胚龄15周时视网膜主要层次可见,分化的细胞增加,但未发现GFAP阳性细胞；胚龄19周视网膜可见梭形细胞从返折部原始神经上皮迁出,并可见这些细胞中GFAP呈阳性表达；胚龄25～ 26周后极部视网膜可见GFAP表达阳性的梭形细胞,这些细胞围绕视网膜血管分布,与血管壁联系密切,邻近锯齿缘处的视网膜内层可见表达GFAP的星形或梭形细胞与睫状体非色素上皮相连,但锯齿缘稍后与赤道区之间并未见GFAP阳性细胞；胚龄28周,视网膜星形胶质细胞呈典型的星状,其突起伸达视网膜内网状层. 结论 人视网膜星形胶质细胞至少存在3个起源位点,即血管前体细胞/周皮细胞、视盘旁原始神经上皮及邻近锯齿缘的睫状体无色素上皮.     

Nestin在高眼压大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达

目的探讨第六类中间丝蛋白nestin在高眼压大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及意义。方法42只SD大鼠采用烧灼右眼涡静脉的方法制作高眼压模型为模型组,剪开左眼结膜作为假手术组。测量并记录眼压,计数术后不同时间点视网膜神经节细胞（RGCs）数。Westernblot半定量分析术后视网膜内nestin蛋白含量。免疫电镜检测nestin在高眼压大鼠视网膜Mailer细胞上的诱导表达。行nestin／谷氨酰胺合成酶（GS）或nestin／胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光双标,共焦显微镜观察nestin／GFAP在Mailer细胞上的表达情况。结果术后各时间点模型组与假手术组眼压的差异有统计学意义（P〈0．05）。术后1～3周模型组RGCs数量显著减少,与假手术组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫荧光结果显示术后2h～3周,模型组nestin在Maller细胞上表达的荧光强度逐渐增强,与假手术组比较差异有统计学意义。Westernblot半定量分析结果与免疫荧光染色结果一致。免疫电镜结果进一步证实眼压升高后Mailer细胞上出现nestin的诱导表达。结论Nestin在Maller细胞上的诱导表达是Mailer细胞对眼压升高产生的一种反应,nestin的表达量与病程进展相一致。眼压升高时,nestin在Mailer细胞上诱导表达,尤其在足板处的强烈表达,可能对RGCs具有保护作用。Nestin有望成为一种新的研究视网膜损伤的生物标记物。     

糖尿病大鼠视网膜神经细胞损伤机制的研究

目的 观察糖尿病大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体（GLAST）、谷氨酰胺合成酶（GS）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的变化、视网膜神经细胞凋亡的检测以及神经营养因子NT-3的表达,探讨糖尿病（DM）对视网膜神经细胞损伤的机制。设计 实验研究。研究对象 Sprague-Dawley（SD）大鼠82只。 方法 大鼠随机分为正常对照组12只,糖尿病模型组70只。链脲佐菌素诱导实验性DM大鼠模型。RT-PCR法检测视网膜GFAP mRNA表达水平;TUNEL法检测视网膜神经节细胞（RGC）及内核层细胞的凋亡并计数凋亡细胞数量;免疫组织化学技术LSAB法检测GFAP、GLAST、GS、NT-3在视网膜的表达,观察DM大鼠视网膜RGC及内核层细胞功能的改变,用图像分析仪测量免疫组化的显色强度。主要指标 GFAP、GLAST、GS和NT-3的表达量,视网膜内核层和RGC细胞凋亡数。结果 （1）与正常组（1.00±0.02）相比,模型组GFAP阳性表达量（5.22±1.34）明显增加（P=0.000）, GLAST、GS、NT-3阳性表达明显降低。（2）大鼠视网膜凋亡阳性细胞仅见于RGC层和内核层,模型组视网膜内核层细胞及RGC凋亡数量（36.00±6.02,11.48±2.08）比正常组（16.33±2.34,5.34±0.52）显著增加（P均=0.000）。（3）DM大鼠视网膜GFAP mRNA表达（7.00±0.37）比正常组（0.29±0.08）明显增加（P=0.000）。（4）GFAP阳性表达与内核层细胞及RGC凋亡数呈正相关（r=0.88、0.85,P=0.021、0.028 ）;GLAST阳性表达与内核层细胞及RGC凋亡数呈负相关（r=-0.91、-0.89, P=0.014、0.020）,GS阳性表达与内核层细胞及RGC凋亡数呈负相关（r=-0.93、-0.90, P=0.007、0.009）;NT-3阳性表达与内核层细胞及RGC凋亡数呈负相关（r=-0.74、-0.71, P=0.036、0.041）。结论  糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡增加与Müller细胞的过度反应性增生及神经营养因子的缺失有关,高浓度谷氨酸的兴奋性毒性作用以及神经营养因子NT-3的缺失是其视网膜神经细胞损伤的重要机制。     

Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy

PURPOSE: To characterize early structural gliotic reactions in retinal Müller cells, astrocytes, and microglia in experimentally induced diabetes. METHODS: Rats were rendered diabetic by streptozotocin injection and killed after 2, 4, 12, or 20 weeks. Cell densities were determined in flatmounted retinas or transverse semithin sections. Expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) was localized on frozen sections or flatmounts by immunofluorescence and confocal microscopy, and GFAP content was evaluated by Western blot analysis. Microglial cells were visualized by binding of isolectin B4 or staining with antibodies to phosphotyrosine residues. The integrity of the blood-retinal barrier was assessed by intravenous injection of Evans blue. RESULTS: The density of Müller cells and microglia was significantly increased at 4 weeks of diabetes compared with nondiabetic controls. GFAP expression in Müller cells was not detected at 4 weeks but was prominent at 12 weeks. The number of astrocytes was significantly reduced at 4 weeks in the peripapillary and far peripheral retina. Shape changes of microglial cells indicated functional activation. Leakage of the blood-retinal barrier was observed at 2 weeks of hyperglycemia, the earliest time point investigated. CONCLUSIONS: The leakage of the blood-retinal barrier before glial reactivity suggests that glia are early targets of vascular hyperpermeability. The individual glial cell types react differentially to the diabetic state. Müller cells undergo hyperplasia preceding GFAP expression, and microglial cells are activated, whereas astrocytes regress. This glial behavior may contribute decisively to the onset and development of neuropathy in the diabetic retina.     

Altered expression of aquaporins 1 and 4 coincides with neurodegenerative events in retinas of spontaneously diabetic Torii rats

Evidence is mounting that not only microangiopathy, but also neurodegenerative events occur in the retinas of humans and rodents with early diabetes. Diverse pathologies are known to alter the amount and/or location of glial expression of the water-selective channels aquaporins (AQPs) 1 and 4. However, the temporal relationships among glial activation, the altered expression of the AQP proteins and neuronal death in the retinas of diabetic animals remains to be investigated. Male spontaneously diabetic Torii (SDT) rats reportedly develop diabetes by 40 weeks of age at the latest and manifest proliferative diabetic retinopathy at 50 weeks or later. This study compared temporal changes in neuroretinal apoptosis, glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression and the expression of AQPs 1 and 4 between SDT rat retinas and age-matched Sprague-Dawley (SD) rat retinas. Cell death was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxy-uridine triphosphate nick end-labeling on retinal flatmounts and activated caspase 3 immunofluorescence of retinal cryosections. The expression of GFAP and AQPs 1 and 4 was assessed by immunohistochemistry of cryosections and retinal flatmounts. Diabetes started to develop around 15 weeks in SDT rats. Apoptotic cells in the ganglion cell layer and the inner nuclear layer were significantly more numerous in 40-week-old SDT rat retinas than in either age-matched SD rat retinas or 10-week-old SDT rats. GFAP immunoreactivity was confined to the nerve fiber layer both in SD and SDT rats at 10 weeks, whereas it spanned the whole retina in SDT rats, but not in SD rats, at 40 weeks. AQP1 was expressed in the outer retina, whereas AQP4 was expressed in the perivascular and end feet of Müller cells and astrocytes in the inner retina in the control SD rats and the SDT rats at 10 weeks. The perivascular AQPs shifted from AQP4 to AQP1 in 40-week-old SDT rats that exhibited marked hyperglycemia. Thus, the development of diabetes increases neuroretinal apoptosis, and this coincides with an altered expression pattern of GFAP and water-selective channels AQPs 1 and 4 in SDT rats.