组织转谷氨酰胺酶基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞的影响

目的 构建组织转谷氨酰胺酶(tTG)RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,研究其对肝星状细胞(HSC)的影响.方法 设计、合成tTG基因RNAi有效靶序列,与慢病毒载体系统进行连接、转染,获得表达tTG基因的RNAi慢病毒载体质粒(Lenti-siRNA-tTG);将大鼠活化HSC分成阴性对照组(CON)、siRNA-GFP对照组(GFP)和siRNA-tTG组(nTG).应用real-time PCR、Western blot和MTT法检测Lenti-siRNA-tTG感染后HSC中tTG、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(collagen-1)的mRNA和蛋白表达情况以及HSC的增殖情况.结果 成功构建siRNA-tTG慢病毒载体;Lenti-siRNA-tTG感染后,HSC中tTG和collagen-1的mRNA表达水平降低(P<0.05),HSC中tTG、lysine和collagen-1的蛋白表达水平下降(P<0.01),HSC的增殖能力降低(P<0.05).结论 Lenti-siRNA-tTG能通过抑制HSC中tTG基因的表达而抑制HSC的增殖,并降低HSC中collagen-1合成和交联的形成,具有潜在的抗纤维化形成的功能.     

小RNA干扰DDR2基因表达对肝星状细胞的影响

目的 探讨siRNA干扰大鼠盘状结构域受体2(discoidin domain receptor2,DDB2)基因对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的影响,评估DDR2在肝纤维化发生中的作用.方法 (1)化学合成3对针对DDR2基因的siRNAs,转染肝星状细胞株(HSC-T6),筛选抑制效率最高的siRNA用于干扰实验;(2)将肝星状细胞株HSC-T6分为3组:正常组(normal,N组)、阴性对照组(negative control,NC组)和干扰组(siRNA-DDR2,SI组).将筛选的抑制效率最高的siRNA以脂质体法转染HSC-T6细胞株,以RT-PCR检测其DDR2,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型胶原(collagen-Ⅰ)的mRNA表达,Western blot检测DDR2蛋白表达变化;同时四唑盐(MTT)法检测细胞增殖情况.结果 (1)868位点的siRNA抑制效率最高;(2)与正常组相比,siRNA-DDR2转染组DDR2和α-SMA的mRNA表达均显著下降(分别t=6.43,t=7.34,均P<0.01),DDR2蛋白的表达亦显著降低(t=4.49,P<0.01),同时HSC的增殖能力也显著降低(t=18.32,P<0.01);相反,阴性对照组与正常组相比,DDR2、α-SMA的mRNA表达以及DDR2蛋白和HSC的增殖能力则无明显改变.结论 siRNA-DDR2能显著抑制HSC的活化与增殖,进而抑制纤维化发生,具有潜在的抗纤维化作用.     

siRNA干扰ADAMTS2基因对肝星状细胞的影响

目的 探讨siRNA干扰大鼠含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶2(ADAMTS2)基因后对大鼠肝星状细胞(HSC)生物学特性的影响及其机制,评估ADAMTS2基因作为一种新的靶向基因在抗肝纤维化治疗中的应用前景.方法 设计并化学合成3对针对大鼠ADAMTS2 mRNA 2237、2597及690位点的siRNAs.用筛选出的抑制效率最高的siRNA体外转染HSC-T6,应用实时PCR、Westem blot及MTT等方法研究沉默ADAMTS2基因对大鼠HSC活化、增殖等生物学特性及对基因ADAMTS2、α-SMA、COL1α1、COL(I)、TGF-β1、MMP-2和TIMP-3表达的影响.结果 在相同注射剂量(50 nmol/L)及时间(48 h)下,2237位点的siRNA-ADAMTS2具有最高的抑制效率;能显著抑制ADAMTS2基因mRNA和蛋白表达(抑制率80％以上);显著抑制COL(I)、α-SMA和TGF-β1在HSC中的表达.HSC的增殖能力显著降低.结论 化学合成的siRNA-ADAMTS2干扰载体能有效抑制ADAMTS2基因在大鼠HSC-T6细胞系中的表达,抑制HSC的活化和增殖,同时显著降低COL(I)、α-SMA和TGF-β1的表达,具有潜在的阻止甚至逆转肝纤维化的作用.ADAMTS2可能是抗肝纤维化治疗的有效靶位,抑制ADAMTS2在肝脏的表达可能是一种有效的抗肝纤维化治疗策略.     

结缔组织生长因子对Kupffer细胞诱导的肝星状细胞激活的影响

目的 探讨肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达对Kupffer细胞(Kc)诱导的HSC激活的影响.方法 构建含CTGF的RNA干扰载体.将肝星状细胞系rHSC-99分为3组:对照组、空载体组和RNA干扰组.采用RT-PCR方法 检测HSC的CTGF表达.分离培养KC,建立各组HSC与KC的共培养体系,MTT检测HSC的增殖情况;RT-PCR检测HSC的TGF-β1、I型前胶原的表达;Western Blot检测HSC的TGF-β1表达,ELISA检测共培养上清中I型胶原的表达;免疫荧光化学检测HSC的α-SMA的表达. 结果 构建CTGF的RNA干扰载体Psilencer 3.1H1-Neo-CTGF.RNA干扰后CTGF表达降低22%.KC得率为5×107,活率＞98%.在HSC和KC共培养体系中,RNA干扰HSC的CTGF表达后,与KC共培养的HSC活化和增殖明显被抑制,与对照组相比,HSC的增殖降低29%(t:20.17,P＜0.01).Ⅰ型前胶原和α-SMA的表达下降38%,细胞培养上清中Ⅰ型胶原的分泌量下降48%(t=12.18,t=7.81,t=15.96,均P＜0.05).TGF-β表达则没有明显的变化.结论 阻断HSC的CTGF表达能抑制由KC诱导的HSC激活.     

circUTRN24通过肝星状细胞自噬介导胆道闭锁肝纤维化

目的 探究胆道闭锁中circUTRN24与自噬途径的关联,以及是否通过自噬参与胆道闭锁的肝纤维化过程。方法 通过RT-qPCR、Western blot分别检测BA组和对照组的肝组织中circUTRN24以及自噬相关蛋白的表达,并进行相关性分析。在细胞水平,通过慢病毒转染使人肝星状细胞系LX-2过表达circUTRN24,Western blot检测转染前后自噬相关蛋白Beclin-1、LC3以及HSC活化相关指标α-SMA、COL-Ⅰ的表达水平。结果 胆道闭锁患儿肝组织中circUTRN24以及自噬相关蛋白Beclin-1的表达明显高于对照组,并且呈正相关关系。过表达circUTRN24的LX-2细胞中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ及HSC活化相关指标α-SMA、COL-Ⅰ均明显升高。结论circUTRN24可能通过调控肝星状细胞自噬过程促进胆道闭锁肝纤维化的进展。     

视黄醇类核内受体α基因慢病毒表达载体构建

目的 通过构建大鼠视黄醇类核内受体-α(RXR-α)基因慢病毒表达载体,获得可供转染的滴度.方法 大鼠RXR-α基因序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增,与经AgeI酶切后的pCC-FU-3FLAG载体连接产生慢病毒载体表达质粒pGC-fu-3flag-Rxra,转化DH5α,PCR筛选阳性克隆,片段长为411bp.测序并转入293T细胞Western blot鉴定,90 KDr处有特征条带.将pGC-fu-3flag-Rxra、pHelper 1.0、pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,测病毒滴度,1.00E-04μl组和Control组的Ct值存在差异(2.775).结果 DNA测序及Western blot鉴定证实构建的大鼠RXR-α基因慢病毒表达载体pGC-fu-3flag-Rxra正确,浓缩慢病毒悬液滴度为2×108TU/ml.结论 成功构建携带大鼠RXR-α基因的重组慢病毒表达载体.     

脂肪特异性蛋白27基因抑制大鼠肝星状细胞增殖活化

目的 探讨脂肪特异性蛋白27(Fsp27)基因对活化态肝星状细胞(HSCs)增殖、活化的影响及其对纤维化相关基因的调节作用.方法 提取HSCs并培养.用实时定量PCR技术检测原代HSCs及活化HSCs中的Fsp27基因表达.构建携带Fsp27目的基因的慢病毒,转染活化的HSCs并继续培养72 h.通过CCK-8比色法检测Fsp27基因对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCsα-肌动蛋白(α-SMA)的表达,了解HSCs的活化状态.实时定量PCR技术研究Fsp27基因对HSCs纤维化相关基因表达的影响.结果 成功分离原代HSCs,Fsp27基因在原代HSCs及活化HSCs中表达差异显著(P＜0.01).活化HSCs成功转染携带Fsp27目的基因的慢病毒后继续培养72 h,与对照组比较,HSCs的活化与增殖受到明显抑制(P＜0.05);Fsp27基因促进MMP-2的表达(P＜0.05),降低了TIMP-1及TGF-β1的表达(P＜0.05).结论 Fsp27基因具有抑制HSCs活化增殖的潜能,Fsp27基因可调节纤维化相关基因的表达.Fsp27基因的作用可能与维持HSCs静息状态细胞表型有关.     

AA-861抑制5-LO途径对KC和HSC的影响

目的 探讨5-脂氧合酶(5-LO)特异性抑制剂AA-861对肝枯否细胞(KC)和星状细胞(HSC)的活化、增殖和基因表达的影响.方法 (1)观察AA-861对脂多糖(LPS)诱导的活化KC凋亡、KC中5-LO mRNA和蛋白表达的影响;(2)分别将LPS和AA-861处理后的KC上清液加入静止HSC中,观察HSC的活化、增殖及基因表达情况.结果 (1)经LPS刺激后,KC中5-LO的mRNA和蛋白表达均显著增加,同时5-LO代谢产物的含量也显著增加;AA-861显著降低活化KC中5-LO mRNA和蛋白的表达及其培养上清中5-LO代谢产物的含量,并显著增加KC的凋亡,AA-861对静止状态的KC的凋亡和基因表达无明显影响.(2)加入活化KC上清液后,静止HSC的增殖显著增加,其活化相关基因如平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Collagen-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)等的表达也显著提高;加入AA-861处理后的活化KC上清液可抑制静止HSC的活化,降低其增殖力和活化相关基因的表达.结论 AA-861可通过抑制5-LO途径,诱导过度增殖的KC凋亡,从而抑制HSC的活化和增殖,并降低HSC活化相关基因的表达.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ1基因转染诱导肝星状细胞表型及功能的变化

目的 用慢病毒介导PPARγ1基因在HSC中过表达,观察对HSC的增殖及细胞外基质合成的影响.方法 用慢病毒质粒系统在293T细胞中包装出重组慢病毒Lent/PPARγ1并感染HSC,用RT-PCR及WB检测目的 基因及目的 蛋白的表达,用噻唑蓝(MIT)比色法观察对HSC增殖的影响,用RT-PCR观察对Ⅰ型胶原、TCFβ1表达的影响.结果 成功构建Lent/PPARγ1并感染HSC,RT-PCR及WB检测到目的 基因及蛋白的表达,MTT检测表明Lent/PPARγ1组12、96 h的A值分别为0.420±0.031、0.638±0.040,与对照组0.448±0.019、0.810±0.070比较差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测表明Lent/PPARγ1组I型胶原、TGFβ1的2-△△Ct值分别为1.496±0.359、0.667±0.153,与对照组2.602±0.301、1.008±0.102比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建携带PPARγ1的重组慢病毒载体并感染HSC,PPARγ1基因过表达可抑制HSC的增殖和活化.     

成纤维细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化腱细胞的研究

目的检测腺病毒携带成纤维细胞生长因子2(FGF2)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)后FGF2的表达情况并探索其对细胞增殖、分化及韧带相关特异性细胞外基质表达的影响。方法将腺病毒进行细胞转染,转染后将细胞分为空白组(正常培养)、对照组[重组腺病毒(Ad.e GFP)转染]和试验组[空病毒(Ad.b FGF2-e GFP)转染]。采用形态学、流式细胞仪观察、实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)、蛋白质印迹法(WB)检测转染后BMSCs中FGF2的表达。并采用MTT法检测过表达FGF2后BMSCs增殖的变化。最后用q RT-PCR及WB检测BMSCs中带韧带相关特异性细胞外基质基因的表达水平。结果试验组转染后FGF2表达最高,与空白组及对照组相比,差异有统计学意义(t=19.648,P0.001;t=17.506,P0.001);MTT结果示:在转染后第3天,与空白组及对照组相比,试验组可明显促进BMSCs的增殖,差异有统计学意义(t=3.401,P=0.015;t=3.234,P=0.018);过表达FGF2基因可明显上调BMSCs中特异性细胞外基质基因Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)、纤维连接蛋白(FN)、波形蛋白(Vimentin)及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结论 FGF2能促进BMSCs的增殖并向腱细胞分化,腺病毒携带FGF2转染BMSCs有望成为组织工程韧带的种子细胞。     

丹参预处理对肝脏缺血再灌注损伤后磷酸化真核生物翻译起始因子2α和caspasel2的影响

目的观察丹参预处理对肝脏缺血再灌注损伤后磷酸化真核生物翻译起始因子2d（p-elF-2a）和caspasel2表达的影响。方法将80只Wistar大鼠按随机数字表法分成正常对照组5只,假手术组、缺血再灌注组和丹参预处理组各25只,后3组大鼠再根据缺血再灌注时限（0、3、12、24和72h）分为5个亚组,每组5只。采用动脉夹钳夹肝蒂45min后,使血液复流的方法制备大鼠缺血再灌注损伤模型。正常对照组大鼠不做处理;假手术组仅解剖肝门不钳夹肝蒂;丹参预处理组大鼠在肝血流阻断前30min经尾静脉注入丹参注射液6ml／kg;假手术组和缺血再灌注组大鼠则在肝血流阻断前30min经尾静脉注入等量生理盐水。采用Westernblot检测各组大鼠肝组织中p-eIF-20α和caspasel2蛋白的表达,HE染色观察各组大鼠同期肝组织的病理形态学变化。多组间比较采用单因素方差分析,组间比较方差齐采用LSD法,方差不齐采用Games-Howell法。结果正常对照组大鼠肝组织中p-eIF-20α蛋白的相对表达量为0．296±0．038,假手术组在缺血再灌注0、3、12、24和72h分别为0．304±0．048、0．298±0．038、0．272±0．042、0．266±0．076和0．296±0．043,两组比较,差异无统计学意（P〉0．05）。缺血再灌注组大鼠肝组织中p-eIF-2α蛋白的相对表达量在缺血再灌注0h为0．310±0．034,与正常对照组和假手术组同时相点比较,差异无统计学意义（F=0．15,P〉0．05）;在缺血再灌注3、12、24h,p-eIF-2α蛋白的相对表达量分别为0．386±0．021、0．710±0．034和0．474-4-0．017,与正常对照组和假手术组同时相点比较,差异有统计学意义（F=11．90,211．52,25．15,P〈0．05）;至缺血再灌注72h,p-eIF-2α蛋白的相对表达量为0．336±0．043,基本回落至正常对照组和假手术组同时相点水平（F=1．57,P〉0．05）。丹参预处理组大鼠肝组织中p-eIF-2α蛋白的相对表达量在缺血再灌注0、12、24和72h分别为0．278±0．044、0．800±0．079、1．056±0．125、0．736±0．087和0．442±0．047,丹参预处理组在缺血再灌注3、12、24、72h明显高于缺血再灌注组同时相点水平（P〈0．05）。正常对照组大鼠肝组织中easpasel2蛋白的相对表达量为0．983±0．003,假手术组在缺血再灌注0、3、12、24和72h分别为0．974±0．004、0．9834-0．005、0．985±0．003、0．981±0．004和0．978±0．004,两组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。缺血再灌注组大鼠肝组织中caspasel2蛋白的相对表达量在缺血再灌注0h开始上升为1．018±0．076,但与正常对照组和假手术组同时相点比较,差异无统计学意义（F=1．43,P〉0．05）;在缺血再灌注3h明显升高为2．056±0．067,12h达到峰值为2．804±0．050,24h仍处于相对高水平为1．882±0．037,72h有所下降为1．282±0．066,与正常对照组和假手术组同时相点比较,差异均有统计学意义（F=1290．69,6490．84,2898．71,103．61,P〈0．05）。丹参预处理组肝组织中caspasel2蛋白的相对表达量在缺血再灌注0、3、12、24、72h分别为0．998±0．056、1．442±0．066、1．990±0．068、1．364±0．056和0．962±0．054,缺血再灌注3、12、24、72h均明显低于缺血再灌注组同时相点（P〈0．05）。病理形态学检测结果显示：正常对照组和假手术组大鼠肝组织肝小叶结构基本完整,肝细胞连续成索,胞核大而圆;肝缺血再灌注组大鼠肝组织可见肝小叶变形,细胞体积变小,细胞核浓缩,部分出现片状坏死;丹参预处理组大鼠肝细胞肿胀,出现轻微的点状坏死。结论丹参可能通过上调p-eIF-2α的水平稳定内质网内环境,减轻经内质网细胞凋亡途径中caspasel2的表达,在肝脏缺血再灌注损伤期发挥肝脏保护作用。     

糖肾平通过TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路干预高糖＋LPS诱导足细胞上皮间质转分化的分子机制研究

也页目的：探讨糖肾平对高糖环境下脂多糖（ lipopolysaccharide,LPS）刺激足细胞上皮间质转分化的影响,并探讨其作用机制。方法：以体外培养大鼠肾小球足细胞为研究对象,以高糖（25 mmol/L）、LPS（1μg/mL）刺激足细胞建立模型,分为正常组、高糖组、高糖＋LPS组、厄贝沙坦组、抑制剂组、糖肾平小、中、大剂量组。采用Western blotting及RT-PCR方法检测足细胞中转化生长因子-β1（ transforming growth factor-β1,TGF-β1）、Smad2/3、整合素连接激酶（ integrin-linked kinase, ILK）、CD2相关蛋白（CD2AP）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）的表达水平。结果：与正常组比较,高糖组和高糖＋LPS组足细胞TGF-β1、ILK、α-SMA蛋白及其mRNA表达明显增加（P〈0.01）,P-Smad2/3蛋白及Smad2/3 mRNA表达明显增加（P〈0.01）,CD2AP蛋白及其mRNA表达明显减少（P〈0.01）;与高糖＋LPS组比较,厄贝沙坦组足细胞P-Smad2/3、α-SMA蛋白表达明显减少（P〈0.01）,TGF-β1蛋白表达减少（P〈0.05）,TGF-β1,Smad2/3,α-SMAmRNA表达明显减少（P〈0.01）,ILK mRNA表达减少（P〈0.05）,CD2AP蛋白及其mRNA表达明显增加（P〈0.01）;糖肾平大、中、小各剂量组足细胞TGF-β1蛋白表达明显减少（P〈0.01）,糖肾平大剂量组足细胞TGF-β1 mRNA表达减少（P〈0.05）,小、中剂量组表达明显减少（P〈0.01）;糖肾平小、中、大各剂量组足细胞P-Smad2/3蛋白及Smad2/3mRNA表达均明显减少（P〈0.01）;糖肾平小、大剂量组足细胞ILK mRNA表达减少（P〈0.05）,中剂量组表达明显减少（P〈0.01）;糖肾平大剂量组足细胞α-SMA蛋白及其mRNA表达减少（P〈0.05）;糖肾平小、中、大各剂量组足细胞CD2AP蛋白及其mRNA表达均明显增加（P〈0.01）。结论：糖肾平能够降低足细胞TGF-β1、ILK蛋白及mRNA表达,降低P-Smad2/3蛋白及Smad2/3 mRNA表达,升高足细胞标志物CD2AP蛋白及mRNA表达,降低间充质细胞标志物α-SMA蛋白及mRNA表达,通过抑制TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路的激活减少足细胞转分化,保护足细胞,可能是其防治糖尿病肾病的作用机制之一。     

PPARα激动剂非诺贝特在高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖中的作用

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）激动剂非诺贝特在高糖诱导的肾小球系膜细胞中的作用,探讨其对糖尿病肾脏疾病的可能保护作用。方法将。肾小球系膜细胞分为6组：正常对照组（5mmol／L葡萄糖）、高糖组（40mmol／L葡萄糖）和高糖＋不同浓度PPARα激动剂组（FN,40mmol／L葡萄糖加1、10、50、100μmol／L非诺贝特）。应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot检测各组肾小球系膜细胞PPARα的表达;通过转染含PPAR反应元件的p4XPPRE-luc重组质粒,双荧光素酶分析法检测体外不同组细胞PPARα活性的改变;MTT法检测细胞增殖;Westernblot检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅳ型胶原蛋白的表达情况。结果高糖刺激组系膜细胞PPARα mRNA及蛋白表达均上调;非诺贝特组上述表达水平则显著升高,且呈浓度依耐性;正常。肾小球系膜细胞弱表达PPARα受体,高糖组PPARα活性无显著升高,而合适浓度的非诺贝特干预后PPARα受体活性明显增加;高糖组Q-SMA及Ⅳ型胶原蛋白表达明显上调,非诺贝特干预后上述指标明显下调。结论非诺贝特可通过抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质蛋白的表达而对糖尿病肾脏疾病起保护作用     

低氧诱导因子1α／结缔组织生长因子在肾间质纤维化中的表达及关系

目的探讨低氧诱导因子1α与结缔组织生长因子致肾间质纤维化的作用及关系。方法应用单侧输尿管结扎手术建立单侧输尿管结扎模型,将32只健康成年的雄性SD大鼠随机分为2组,假手术组（Sham组,n=16）、模型组（n=16）。分别于术后第7天、第14天处死大鼠,留取肾组织行HE染色并观察病理变化。应用原位杂交检测低氧诱导因子1a、结缔组织生长因子在肾小管间质中的表达,并检测二者之间的相关性。结果与7天对照组比较,7天模型组肾间质面积明显增加（P〈0．01）。与14天对照组比较,14天模型组肾问质面积也明显增加（P〈0．01）。与7天模型组比较,14天模型组大鼠肾脏间质纤维化显著增加（P〈0．05）,肾间质面积（0．51±0．04）、（0．82±0．06）,表明梗阻性肾病大鼠肾脏组织形态学呈进行性损害。7天模型组肾间质HIF1α及CTGFmRNA的表达较7天对照组均显著增加（均P〈0．01）。14天模型组肾间质HIF1αmRNA的表达明显增加（P〈0．05）,为（19．69±4．11）、（30．45±6．27）,CTGFmRNA的表达亦明显增加（P〈0．05）,分别为（21．38±4．26）、（37．18±7．52）,且HIF1αmRNA的表达与CTGFmRNA的表达在第7天、14天均呈正相关（分别为r=0．697,P〈0．01;r=0．715,P〈0．01）。结论低氧诱导因子1α及结缔组织生长因子促进了肾间质纤维化发生和发展的过程,二者之间相关性显著。     

活体荧光显微镜技术在观察肝硬化门静脉高压大鼠肝脏微循环结构变化中的应用

目的探讨活体荧光显微镜技术观察肝硬化门静脉高压模型大鼠的肝脏微循环结构变化的应用效果。方法取雄性SD大鼠70只,将其中40只SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组、胆总管结扎（BDL）模型2周组、BDL模型4周组及BDL模型6周组,每组10只,应用活体荧光显微镜技术观察大鼠肝脏微循环结构变化。将余下的30只sD大鼠于BDL模型建立4周后采用随机数字表法分为3组,动态观察给予生理盐水（生理盐水组）、内皮素-1（ET-1,ET-1组）、NO供体亚硝基半胱氨酸（GSNO,GSNO组）后BDL模型大鼠肝脏微循环的急性改变。组间比较采用单因素方差分析,组内比较采用配对样本t检验。结果BDL模型大鼠共死亡9只,存活率为85．0％（51／60）。假手术组大鼠全部存活。随着BDL造模时间延长,肝脏肝窦直径逐渐变小,BDL模型2周组、BDL模型4周组及BDL模型6周组肝窦直径分别为（13．6±1．0）μm、（8．8±0．7）μm和（8．0±0．5）μm,与假手术组的（17．4±1．0）μm比较,差异有统计学意义（t=5．86,18．24,15．57,P〈0．05）。随着BDL造模时间延长,肝窦开放数量逐渐减少,BDL模型2周组、BDL模型4周组及BDL模型6周组肝窦开放数量分别为（6．8±0．8）个／200μm、（4．3±1．8）个／200μm、（4．0±1．2）个／200μm,与假手术组的（8．8±0．5）／200μm比较,差异有统计学意义（t=3．25,2．77,2．12,P〈0．05）。注射生理盐水15min后,生理盐水组肝窦直径为（7．2±1．2）μm,与注射前的（6．9±0．5）Dm比较,差异无统计学意义（t=0．89,P〉0．05）;肝窦开放数量为（6．8±1．4）＋／200μm,与注射前的（6．6±0．4）个／200μm比较,差异无统计学意义（t=1．12,P〉0．05）。注射ET-115min后,ET-1组肝窦直径为（5．4±0．5）μm,与注射前的（7．9±0．6）μm比较,差异有统计学意义（t=7．39,P〈0．05）;肝窦开放数量为（5．4±1．8）＋／200μm,与注射前的（5．8±1．2）个／200μm比较,差异无统计学意义（t=0．84,P〉0．05）。注射GSNO15rain后,GSNO组肝窦直径为（11．4±1．3）μm,与注射前的（7．5±1．7）μm比较,差异有统计学意义（t=5．95,P〈0．05）;肝窦开放数量为（6．4±1．6）＋／200μm,与注射前的（5．6±0．8）个／200μm比较,差异无统计学意义（t=0．54,P〉0．05）。结论活体荧光显微镜技术可以通过观察肝脏微循环结构变化在一定程度上评价肝纤维化的程度,并且能够通过动态捕捉肝窦直径和肝窦开放数量在药物作用影响下发生的改变。