Acrp30生物学功能及调控的研究进展

Acrp30是脂肪来源的血浆蛋白，其生理学功能包括调节糖、脂代谢，提高胰岛素敏感性，抗动脉粥样硬化等。新近的研究表明，Acrp30有抗炎保肝的效果，有可能成为一种新的肝病治疗药物。Acrp30表达调控是与代谢相关的多种因素综合作用的结果，其中肾脏在Acrp30生物降解和清除中起重要作用，但目前Acrp30在体内的作用机制还有待于进一步研究。     

血管生成素基因在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

目的：利用原核表达系统获得重组血管生成素(Ang)并研究其生物学活性。方法：构建高效融合表达载体pGEx4T—Ang，诱导表达后利用亲和层析的方法纯化目的蛋白，经切割后获得非融合的重组人Ang，利用Westem印迹检测表达产物的特异性，通过鸡胚尿囊膜血管增生实验检测重组蛋白的生物学功能。结果：表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20％，亲和层析纯化蛋白的纯度在90％，能够与Ang抗体产生特异性反应，并具有明显的促进血管新生的活性。结论：原核表达的重组Ang具有良好的生物学活性。     

TRAP蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)毒素的调控机制，构建pET—trap表达载体，在大肠杆菌中表达金葡菌毒素调控的重要分子TRAP蛋白。方法：从金葡菌中提取基因组DNA，用特异引物钓取trap基因。通过亚克隆的方法构建了pET—trap表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，经亲和柱层析分离纯化。制备纯化蛋白的多抗血清，利用Western印迹检测多抗与天然蛋白的反应。结果：目的基因在大肠杆菌中获得高表达，超声破碎后，表达产物主要存在于上清中，制备的多抗血清可以与天然蛋白发生特异性反应。结论：通过原核表达获得了天然的TRAP蛋白，为研究金葡菌毒素调控机制及防治金葡菌感染奠定了基础。     

大肠杆菌aroE基因的克隆与表达

目的:克隆表达大肠杆菌莽草酸脱氢酶基因aroE,并测定其生物学活性。方法:根据大肠杆菌中aroE基因的序列设计了一对引物,利用PCR技术扩增得到aroE基因,将其克隆入高效原核表达载体pBV220,以双脱氧法进行测序,然后对该重组子利用温度诱导表达,并测酶的生物活性。结果:构建了aroE基因的克隆和表达重组子,aroE基因获得高效表达,SDS-PAGE图谱显示新增30×103蛋白带,酶活性测定结果表明奎尼酸脱氢酶的相对酶活性是5.6倍。结论:实现了莽草酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的高效表达,证明了其具有奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌种奠定了基础。     

脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :克隆表达大肠杆菌脱氢奎尼酸合成酶基因aroB ,并测定其生物学活性。方法 :根据大肠杆菌中aroB基因的序列设计了一对引物 ,利用PCR技术扩增得到aroB基因 ,将其克隆入pGEM Teasy载体中 ,以双脱氧法进行测序 ,然后再克隆入高效原核表达载体pBV2 2 0 ,对该重组子的SD序列进行调节后利用温度诱导表达 ,并测酶的生物活性。结果 :构建了aroB基因的克隆和表达重组子 ,经SD序列调节后 ,aroB基因获得高效表达 ,SDS PAGE图谱显示新增 38.8× 10 3 蛋白带 ,酶活性测定结果表明脱氢奎尼酸合成酶的相对酶活性为 5 .4。结论 :实现了脱氢奎尼酸合成酶基因在大肠杆菌中的高效表达 ,为构建产脱氢奎尼酸工程菌种奠定了基础。     

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究通过反转录ＰＣＲ得到人ＧＭ-ＣＳＦ基因片段后，通过重组插入ｐＢＶ２２０载体质粒的ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ之间，构建了重组表达质粒ｐｈＧＭ９１。借助计算机分析，优化了构建质粒的转译起始区，采取定点诱变以消除ＳＤ序列和ＡＴＧ区的强二级结构，提高了表达水平。将ＧＭ-ＣＳＦ基因进行序列测定，与文献报导完全一致，所对应的氨基酸序列与天然氨基酸序列一致。将带有表达质粒ｐｈＧＭ９１的ＤＨ５α菌在４２℃诱导，表达了预期的１５ＫＤ的蛋白，约占菌体总蛋白的２０％，并探讨了不同菌株对表达水平的影响。用ＭＴＴ法测定所表达的ＧＭ-ＣＳＦ生物活性，比活性可达到１×１０~７ＩＵ／ｍｇ，表明所表达的ＧＭ-ＣＳＦ具有生物学作用。     

人白细胞介素15基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：分离编码人ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ并大肠杆菌中克隆与表达，方法：采用ＰＨＡ刺激人外周血白细胞提取ｍＲＮＡ，并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法获得ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ将其定向插入ＰＵＣ１９载体中，ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＩＬ－１５的序列与文献报道一致，以ｐＢＶ２２０为表达载体构建并筛选出重组于ｐＢＶｈＩＬ－１５；重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株，经４２℃诱导表达。结果：相对分子质量为１４０００的ｈＩＬ     

人血红蛋白α、β基因以可溶形式在大肠杆菌中的表达

将人血红蛋白α、β珠蛋白基因分别克隆进pET-21b原核表达载体中，宿主菌经IPTG化学诱导，在1.6×105处有特异的蛋白带表达。表达产物以可溶形式存在，α珠蛋白的表达量达总菌体蛋白的5%,β珠蛋白的表达量达15%，并经Western-Blotting杂交证实。     

KGF基因在COS7细胞中的表达及其活性检测

目的：利用COS7细胞表达角质细胞生长因子(KGF)并检测其活性。方法：利用脂质体把KGF基因转入COS7细胞中，再用Western印迹和ELISA方法检测KGF蛋白的表达，然后用MTT法检测其活性。结果：KGF基因在COS7中得到了表达，并对小鼠肠上皮细胞(IEC-6)具有刺激增殖作用。结论：KGF有望成为肠型放射病治疗的新型药物。     

白细胞介素-8在大肠杆菌中的克隆和表达

白细胞介素┐８在大肠杆菌中的克隆和表达苏琴王嘉玺邹民吉肖定华赵春文王利红段聚宝周俐梅刘海天军事医学科学院基础医学研究所北京１００８５０白细胞介素－８（ＩＬ－８）是一种由内皮细胞和单核细胞分泌产生的在机体炎症反应中起作用的细胞因子。与其他炎症因子的区别...     

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的：克隆人KGF-2基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：通过PCR扩增，从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA，并将其分别克隆入pBV220，pLEX和pGEX4T-1质粒中，研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果：克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中，在E．coli JM109中表达量相对最高，约占茵体总蛋白的4％；克隆于pLEX质粒中，在E．coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5％；克隆于pGEX4T-1中，在E．coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20％。结论：采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达，较pBV220和pLEX具有明显优势，能实现对KGF-2的高效表达，为进一步的功能研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒C基因在E.coli中的高效表达

目的：通过观察影响ＨＣＶ Ｃ基因在大肠杆菌中表达的因素，研制高表达工程菌株，制备重组抗原，用于免疫诊断和生物学功能研究。     

丙型肝炎病毒T细胞表位的筛选及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)不同变异株中，筛选高保守的能涵盖多种MHC限制类型的T细胞表位，并构建重组表位抗原的原核表达质粒。方法：检索文献并结合MHC限制型，从中遴选出功能明确的T细胞表位；利用Goldkey软件，建立HCV全长蛋白序列数据库；从中分别截取各个表位所在区段，对所选取的表位进行同源性比较；从中选取保守性强的部分表位，用化学法合成表位基因，插入原核表达载体pBVIL1中，构建多个融合表达质粒并在E．coli表达。结果：从文献中获得HCV免疫优势性T细胞表位18个，在由55条全长HCV序列组成的数据库中进行比较，获得了大量有关表位保守性的信息，并进行了统计分析，所构建的5个表达质粒pBVIL1—T1—T5经鉴定后，在大肠杆菌中均获得了高效表达。结论：本研究有助于深入认识HCV T细胞表位的特性，为表位的筛选提供了方法学依据，所选取的表位及原核表达的重组蛋白，为HCV治疗性疫苗的实验研究提供了候选抗原。     

人降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：利用大肠杆菌表达具有生物活性的人降钙素（ｈＣＴ）。方法：以人类基因组ＤＮＡ，为模板，经ＰＣＲ扩增获取ｈＣＴ基因片段，测序分析克隆到ｐＵＣ１９载体中的ＰＣＲ产物，确定得到两种ＣＴ基因序列，其中１＾＃与文献报道完全一致，２＾＃序列中含有（Ｇ６４／Ａ）点突变，采用带有热诱导启动子的高效表达载体ｐＢＶ２２０，对所获得的基因进行了表达，并利用大鼠降血钙实验，对表达产物的活性进行了检测。结果：所获得的ｒ