应用改进的AdEasy系统制备重组腺病毒

目的 改进AdEasy系统，使之更简便、高效、快捷。方法 pAdtrack经酶切线性化后，转化经氯化钙处理的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。荧光显微镜下细胞中重组腺病毒观察绿色荧光蛋白的表达。结果 应用氯化钙法由pAdtrack转化AdEasier-1细菌，可获得极高比例的(20／20)阳性重组腺病毒克隆。结论 应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短、对实验室的条件要求低。     

应用改进的AdEasy系统制备重组腺病毒

目的改进AdEasy系统,使之更简便、高效、快捷。方法pAdtrack经酶切线性化后,转化经氯化钙处理的感受态AdEasier-1细菌,获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。荧光显微镜下细胞中重组腺病毒观察绿色荧光蛋白的表达。结果应用氯化钙法由pAdtrack转化AdEasier-1细菌,可获得极高比例的(20/20)阳性重组腺病毒克隆。结论应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统,方法更简便、成功率更高、实验周期更短、对实验室的条件要求低。     

细菌内同源重组制备重组腺病毒及其初步应用

目的通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒。方法质粒pAdTrack酶切线性化后，通过电转化方法转化AdEasier细菌，线性化的腺病毒重组质粒转染293包装细胞后获得重组腺病毒，观察腺病毒感染喉癌细胞Hep-2后的报告基因表达情况及病毒对培养细胞生长的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确；扩增的腺病毒转染培养的Hep-2细胞8 h后即开始表达报告基因，48 h后全部细胞均有报告基因表达；该重组的腺病毒对培养Hep-2细胞生长无明显影响。结论通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒，方法简单、成功率高、实验周期短。     

细菌内同源重组高效制备人突变p27基因重组腺病毒

目的:利用细菌内同源重组法,构建含人突变p27(hp27mt)基因重组腺病毒. 方法:hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出,亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-hp27mt;然后再用PmeI线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组. 重组质粒鉴定正确后经PacI酶切,转入Ad293细胞,包装成重组腺病毒Ad-hp27mt. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用紫外分光光度计进行滴度测定. 结果:用含pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183后,可获得约30%的阳性重组质粒. PCR检测表明重组腺病毒含有目的基因. 滴度为7.95×1015 pfu/L. 结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备均一的高滴度重组腺病毒. 为研究p27mt对消化道肿瘤的治疗奠定了基础.     

复制缺陷型腺病毒AdE1CMV-NGF的制备

通过DNA重组技术 ,经亚克隆和克隆过程构建分泌表达型重组腺病毒穿梭质粒pAdE1CMV NGF ;制备完整高纯度辅助病毒 pJM1 7。将 pAdE1CMV NGF和 pJM1 7在 2 93细胞中同源重组 ,获得复制缺陷型腺病毒重组体AdE1CMV NGF。梯度系列稀释测得滴度为 4 .6× 1 0 10 PFU/mL。     

血红素氧化酶1基因重组腺病毒的构建

目的利用细茵内同源重组法构建含血红素氧化酶1基因的重组腺病毒.方法用限制性内切酶XhoⅠ HindⅢ从克隆载体PRH01中切出血红素氧化酶1基因片段,亚克隆至经Sal Ⅰ HindⅢ酶切的克隆质粒Puc18中,形成转移质粒Puc18-PRHO1,将之用KpnⅠ HindⅢ双酶切,再次亚克隆至经同样酶切的质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrackPuc18-PRHO1,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-H01.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果利用CaCl2法由pAdTrack-Puc18-PRHO1和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态菌,可获得阳性重组体细菌克隆.PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1.4×1010pfu/ml.结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法.所制备的重组体腺病毒Ad-H01在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对血红素氧化酶1的深入研究奠定了基础.     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

编码绿色荧光蛋白和βARKct的重组腺病毒的制备

[目的]制备编码绿色荧光蛋白(GFP)和Gβγ活性抑制剂βARKct的重组腺病毒载体.[方法]构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-βARKct,经PmeI线性化后转化入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-I的BJ5183菌,筛选获得重组腺病毒质粒pAdEasy-gfp-βARKct.用LipoFectamine 2000将经PacI线性化的pAdEasy-gfp-βARKct转染入人胚肾293细胞,包装并扩增出重组腺病毒颗粒rAd-gfp-βARKct.用氯化铯高速梯度离心、纯化rAd-gfp-βARKct.用rAd-GFP-βARKct干预去甲肾上腺素诱导的乳鼠心肌细胞肥大过程,观察对β肌球蛋白重链(βMHC)基因表达的影响.[结果]将pAdTrack-CMV-βARKct转入含pAdEasy-I的BJ5183菌后获得20%的阳性重组体克隆.重组腺病毒质粒在293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有βARKct编码基因.透析纯化得到重组腺病毒滴度为6.0×106 pfu/mL.rAd-GFP-βARKct表达的βARKct可抑制乳鼠心肌细胞βMHC的高表达.[结论]成功构建重组腺病毒载体,并在293细胞中包装、制备出可表达βARKct的重组腺病毒rAd-gfp-βARKct.     

携带乙肝核心抗原基因复制缺陷型重组腺病毒的高效制备和表达

目的构建表达乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的复制缺陷型重组腺病毒载体。方法扩增乙肝病毒(HBV)C基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBVC区基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹PacⅠ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装。体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达。结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBc。重组质粒pAd-HBc导入293细胞,经过包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBc,其病毒滴度达5×109pfu/mL,并能在真核细胞中有效表达目的基因。结论成功构建表达HBcAg复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础。     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

抑制HBV复制的小干扰RNA的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建可同时表达绿荧光蛋白（GFP）和针对HBVS区基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒,并研究该siRNA在体外对HBV的抑制作用。方法采用PCR技术自质粒pEGFP-C1中扩增含CMV启动子的GFP表达框,自质粒pAVU6＋4sh579中扩增含U6启动子的针对HBV S 区579-597位基因的siRNA表达框,分别将两个表达框克隆至穿梭载体质粒pShuttle内,与质粒pADEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,将阳性重组体DNA转染至人胚肾细胞株HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中初步观察其对HBV复制的抑制疗效。结果构建了可同时表达GFP和siRNA的重组腺病毒,其可在HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的表达具有抑制作用。结论成功构建了可同时表达GFP和针对HBV的siRNA的重组腺病毒,并在体外实验中证实了其对HBV复制具有抑制作用。     

人抗黏液病毒A基因重组腺病毒体外抗乙型肝炎病毒的作用

目的:研究人抗黏液病毒A(MxA)基因重组腺病毒AdMxA体外抗乙型病毒性肝炎病毒(HBV)的作用效果.方法:以1倍感染复数(MOI)(1倍MOI感染组)及5倍MOI(5倍MOI感染组)的重组腺病毒AdMxA分别转染HepG2.2.15细胞,以未感染HepG2.2.15细胞为对照(未感染组).利用RT-PCR检测3组H...     

重组腺病毒pAdxsi-eGFP-rNIS的构建及初步应用

目的 构建包含rNIS和eGFP基因的重组腺病毒栽体及初步应用.方法 以CMV为启动子,将pShuttle-eGFP-CMV重组穿梭载体和含有目的 基因rNIS的原始质粒酶切后,电泳、切胶回收,分别得到载体片段和插入片段.连接酶连接两种片段后,转化化学感受态DH5a菌株,涂布到抗性固体培养基中;挑取单克隆菌落,接种到抗性液体培养基培养;提取pShuttle-eGFP-CMV-rNIS重组穿梭质粒,酶切鉴定.用类似的方法将pShuttle-eGFP-CMV-rNIS重组穿梭质粒转移到pAdxsi重组腺病毒骨架栽体上.在细菌内扩增培养后,提取pAdxsi-eGFP-rNIS病毒质粒,酶切鉴定.将最终的重组腺病毒Ad-eGFP-rNIS转染到A549细胞,荧光显微镜下观察、拍照;细胞与125I溶液培养后,γ计数器检测细胞放射性计数.结果 rNIS构建到pShut-tle-eGFP-cMV(-)TEMP重组穿梭质粒中,并成功转移到pAdxsi重组腺病毒骨架载体上,经酶切鉴定,rNIS和eGFP均表达正确.荧光显微镜下,转染Ad-eGFP-rNIs的A549细胞可见大量强烈绿色荧光,未转染细胞未见明显绿色荧光.转染细胞摄取放射性计数为(29 250±1 441)cpm,未转染细胞摄取放射性计数为(490±27)cpm,两者之间的差异有统计学意义,t=15.2,P<0.001.结论 成功构建了含rNIS基因的重组腺病毒载体,转染肿瘤细胞后rNIS功能正常,为下一步rNIS介导的肿瘤基因靶向治疗及分子显像奠定了基础.     

重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫效果差异的初步分析

目的:研究重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫效果的差异,探讨重组腺病毒疫苗免疫接种的新途径。方法:构建人乳头瘤病毒重组腺病毒rAd5-L1E7,用TCID50微量滴定法测定病毒滴度。将0.1ml滴度为10-4重组腺病毒和10μg重组腺病毒基因组DNA分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,在接种后第1～5周分离小鼠血清。以HPV16L1E7重组蛋白为抗原,用ELISA方法检测血清HPV16特异性抗体水平。通过T细胞增殖试验和检测脾细胞IFN-γ水平确定疫苗诱导的细胞免疫,并分析二者之间的差异。结果:重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫接种均能有效地诱导体液和细胞免疫,抗体达到高峰的时间不同,二者在第3和第4周血清抗体IgG水平差异有统计学意义(P<0.05)。T淋巴细胞增殖试验结果和脾细胞分泌IFN-γ水平差异无统计学意义。结论:重组腺病毒基因组裸DNA接种能够有效地诱导细胞和体液免疫应答,是腺病毒疫苗接种的一种新途径。     

Chemerin重组腺病毒表达载体的构建

目的:应用基因重组技术,构建表达chemerin基因的重组腺病毒载体.方法:经PCR方法扩增得到chemerin基因,将其插入到带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1中,得到重组质粒pShuttle-chemerin-IRE...     

PTEN cDNA重组腺病毒载体的构建

目的:应用同源重组法构建含野生型抑癌基因PTEN cDNA的腺病毒载体pAdPTEN cDNA,产生重组腺病毒AdPTEN.方法:将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN cDNA中切出,亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,产生重组PTEN cDNA的腺病毒载体pAdPTEN cDNA,通过脂质体介导将pAdPTEN cDNA转染至HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒AdPTEN,并测定其滴度.结果:产生具有感染能力的重组腺病毒AdPTEN,滴度约为5×109pfu/ml.结论:成功构建出含有PTEN cDNA的具有感染能力的腺病毒,并可获得较高的病毒滴度,为进一步研究PTEN基因的功能和相关肿瘤的基因治疗提供有效的基因转移载体.     

人血管形成素腺病毒重组粘粒构建

血管形成素(angiopoietin,ANG)是一种新近发现的与血管生长密切相关的生物因子,目前已发现有两种分型,即和型血管形成素(ANG,ANG2)[1,2]。其中型血管形成素具有很强的促进血管内皮细胞增殖和血管形成的作用[3],其编码基因位于染色体的8q22.3-q23区,受体为Tie-2。体内外实?..     

大鼠Otos基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建表达Otos基因的复制缺陷型重组腺病毒.方法 应用RT-PCR技术从大鼠耳蜗螺旋韧带成纤维细胞总RNA中克隆出Otos基因,将Otos基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后,转染293细胞进行包装,反复感染293细胞,并进行扩增,对其进行安全性、病毒滴度以及活性等指标的检测.结果 克隆出大鼠Otos基因,经测序证实结果正确,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA证实含目的 基因.结论 成功构建了表达Otos的复制缺陷型重组腺病毒.     

HBV-TR重组腺病毒载体的构建

目的: 构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)基因的重组腺病毒载体. 方法: 将HBV-TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC316得到pDC316/TR等穿梭质粒,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre以磷酸钙法共转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒,并以空斑形成实验(Plaque Assay)测定病毒滴度. 结果: 成功构建了HBV-TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒. 结论: HBV-TR重组腺病毒载体成功构建.