实时定量PCR方法检测急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因的评价

目的 应用"欧洲抗癌计划"所定的实时定量PCR(RQ-PCR)法检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML-RARα不同转录本异构体并对结果进行分析.方法 应用RQ-PCR法对30例不同类型(长型、短型和变异型)PML-RARα阳性APL患者的骨髓标本进行扩增,并对扩增结果进行凝胶电泳.结果 短型RQ-PCR体系能扩增出长型、变异型和短型PML-RARα转录本,变异型反应体系能扩增出长型和变异型PML-RARα转录本,长型反应体系仅能扩增出长型PML-RARα转录本;电泳及测序结果显示筑巢式PCR检测为长型PML-RARα的患者标本经短型RQ-PCR体系扩增后可见3条带(621、477和218 bp),筑巢式PCR检测为变异型PML-RARα的患者标本经短型RQ-PCR体系扩增后也可见3条带(567、423和218 bp).结论 RQ-PCR方法敏感、可靠,可用于APL患者微量残留病的随访监测,但用于前瞻性分子诊断时要对结果认真分析.     

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因方法的建立

目的 建立用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα mRNA的方法.方法 制备目的基因PML-RARα的RNA标准品及管家基因β-actin的RNA标准品.然后将目的基因PML-RARα和管家基因β-actin的标准品梯度稀释作为模板进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.利用成功构建的两个标准曲线测定APL患者的目的基因PML-RARα与管家基因β-actin的相对值,分析不同状态患者的微小残留病(MRD)水平是否有差别,从而指导临床的治疗.结果 用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10～5 μg NB4细胞cDNA中的PML-RARα融合基因,其重复性的循环域值(Ct值),管间、批间变异系数(CV)分别为2.2%、4.0%.结论 本研究所建立的实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性好.应用本法检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因表达水平的改变,有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后.     

应用RT-PCR和荧光原位杂交监测急性早幼粒细胞白血病微小残留白血病

目的应用RT-PCR和荧光原位杂交技术(FISH)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者体内PML-RARα融合基因的表达,监测患者体内微小残留白血病的情况。方法采用全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)联合治疗APL,运用RT-PCR和FISH技术检测和分析APL患者体内诱导缓解后及巩固维持治疗后PML-RARα融合基因。结果 46例APL患者PML-RARα融合基因均为阳性,其中34例患者在诱导化疗结束达完全缓解后检测,25例(73.5%)患者基因检测呈阴性,9例(26.5%)患者RT-PCR和/或FISH检测阳性,融合基因阳性和阴性复发APL的预测值分别为44.4%和4.3%;31例再经ATRA及As2O3巩固及维持治疗后,27例患者达到分子生物学缓解,无复发病例,4例融合基因阳性患者,3例复发APL,其复发APL的阳性预测值为75%。结论 RT-PCR和FISH技术是非常有效的监测APL患者体内微小残留白血病的实验方法,其对疾病的诊断、治疗及预后评估具有重要临床价值。     

实时荧光定量PCR检测PML-RARα融合基因的临床应用研究

目的 利用PML-RARα融合基因作为标志物,应用实时荧光定量PCR技术,监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(minimal residual disease,MRD)患者体内病毒的状态,探讨预测APL复发风险的方法.方法 利用本实验室建立的定量检测APL患者PML-RARα融合基因的方法,对25例处于初诊、完全缓解(complete remission,CR)、复发等不同阶段的APL患者进行了PML-RARα融合基因的定量检测,并对其中6例患者的MRD状态进行了动态监测.结果 应用荧光定量PCR技术分析患者初诊、CR和复发状态的PML-RARα基因对数值(lg)水平,结果 显示有统计学意义(x2=6.847,P＜0.05);随访期患者的PML-RARα对数值(lg)水平变化较大:初诊时较高(-0.61±0.79),CR时下降(-1.31±0.62),复发时又出现上升(-0.57±0.44),提示若该患者在CR时的对数值呈现上升趋势,患者复发的机率大.结论 应用实时荧光定量(RQ)-PCR技术定量检测PML-RARα融合基因,对监测APL患者MRD状态具有临床适用性,随访期的MRD动态追踪监测具有预后价值.     

实时定量RT-PCR方法检测初诊白血病患者常见分子标志物

目的 建立实时定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)方法,检测初诊白血病患者骨髓细胞中的常见特征性分子生物学标志物的表达水平,评价其在疾病诊断和微量残留病(MRD)监测中的意义.方法 设计TaqMan探针和引物,建立RQ-RT-PCR法对常见融合基因转录本(bcr-abl、AML-ETO、PML-RARα)和abl阳性模板进行扩增,检测202例初诊白血病患者的融合基因转录本含量.结果 初诊白血病患者中的融合基因表达水平以绝对量表示,bcr-abl转录本b3a2或b2a2型拷贝数为47 614.63,bcr-abl转录本e1a2型拷贝数为98 847.53,AML1-ETO转录本拷贝数为300 029.51,PML-RARα转录本拷贝数为25 506.28.以abl校正拷贝数(NCN)表示相对量,bcr-abl转录本b3a2或b2a2型为1.05、bcr-abl转录本e1a2型为0.91、AML1-ETO转录本为5.33、PML-RARα转录本为0.55.结论 以abl校正拷贝数计算融合基因表达水平,结果更准确、直观,优于绝对定量.同时,不同类型融合基因转录本在初诊白血病患者中表达水平不同.     

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的 建立一步法RT-PCR检测急性平幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML-RARα融合基因的实验方法并作相关性能评价.方法 设计两对特异性引物,用一步法RT-PCR法检测APL患者PML-RARα融合基因的三种异构体,并用NB4阳性细胞株做稀释试验,得出该方法 的最低检测限;同时对2006年以来华西医院确诊APL患者的PML-RARα融合基因检测和骨硅细胞形态学检查结果进行比较.结果 一步法RT-PCR法检测PML-RARa 融合基因的灵敏度可迭10-4水平;使用两对引物同时扩增,可检出PML-RARα融合基因全部三种异构体;62例经临床和骨髓形态学确诊为APL的患者,其PML-RARα融合基因阳性率为100%.结论 一步法RT-PCR检测APL患者PML-RARα融合基因有很好的灵敏度,临床符合度较高且操作简便快速,样本交叉污染可能性小,临床实用性较高.     

急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的临床研究

目的 研究急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的亚型、变化及其临床意义。方法 采用筑巢式逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测初治APL患者PML-RARα融合基因,监测完全缓解者微小残留病灶。结果 32例初治APL患者PML-RARα融合基因均为阳性(100%),其中S型为25%,L型为75%。L型的复发率及早期病死率分别为12.5%、12.5%,显著低于S型的复发率及早期病死率(25%和37.5%)。L型患者的预后比S型患者好。采用全反式维甲酸(ATRA)及小剂量高三尖杉酯碱诱导治疗,缓解后分别用化疗与维甲酸交替进行强化治疗,使PML-RARα阳性率随缓解期的延长而逐渐降低。同时监测16例APL缓解患者,PML-RARα融合基因阴性患者可长期生存。结论 PML-RARα融合基因的检测对APL的确诊、预测预后具有重要的临床意义。     

伴rob(13;21)t(15;17)(q22;q21)急性早幼粒细胞白血病一例报告并文献复习

目的 报道1例初发伴有rob(13;21) t(15;17)(q22;q21)的急性早幼粒细胞白血病(APL)并探讨其临床和实验室特点.方法 在常规核型分析和骨髓细胞形态学的基础上,应用双色双融合荧光原位杂交(DCDF-FISH)和RT-PCR技术进一步检测该患者的细胞遗传学异常和分子生物学异常.并结合文献分析此类伴少见变异易位APL患者的临床特点.结果 患者的临床表现和骨髓细胞形态学检查均符合APL.初诊时免疫表型分析髓系标志呈阳性,R显带染色体分析显示患者核型为45,XX,rob(13;21)t(15; 17) (q22;q21) [6]/45,XX,rob(13;21)[14],FISH结果显示68.9％的细胞为典型的t(15;17)模式,RT-PCR结果显示PML-RARα融合基因水平为25.8％.经诱导化疗、巩固治疗后,达到完全缓解,核型为45,XX,rob(13;21) [20],FISH检测PML-RARα融合基因阳性细胞率为2.5％,PML-RARα融合基因水平为0.003％.结论 伴特征性的rob(13;21)t(15;17)(q22;q21)的APL十分罕见,患者临床表现和实验室检查基本符合APL的临床特点;该染色体异常对APL患者的预后判断价值仍需进一步的观察.     

维甲酸和砷剂联合诱导急性早幼粒细胞白血病中PML-RARα表达上调不影响预后(英文)

急性早幼粒细胞白血病(APL)接受维甲酸和砷剂诱导治疗早期的分子动力学及其临床意义尚不清楚。本研究对32例初治APL进行动态检测,利用实时定量PCR和间期荧光原位杂交(FISH)方法检测PML-RARα转录本水平(PML-RARα/ABL)和细胞遗传学。结果表明,诱导14 d时PML-RARα转录本水平比治疗前显著升高(40.10%和57.74%,P<0.01),诱导28 d和巩固治疗结束时PML-RARα转录本分别为:6.97%和0%。在诱导治疗14 d和28 d分别有65.62%和31.25%患者发生PML-RARα转录本增加。治疗前、诱导14 d和诱导28 d PML-RARα拷贝数/每个APL细胞为0.9,2.2,1.4(PML-RARα/ABL×2/APL细胞%)。中位随访时间为22个月,32例患者均无复发。结论:PML-RARα表达上调是急性早幼粒细胞白血病接受维甲酸和砷剂联合诱导治疗过程中一个普遍现象,对疾病预后无影响。     

实时定量聚合酶链反应动态监测白血病治疗后微小残留病研究

目的建立急性早幼粒细胞白血病(APL)实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测方法,并检测APL治疗后微小残留病(MRD),评价MRD检测的意义。方法应用RQ-PCR对96例APL患者的骨髓标本进行分析,检测PML/RARa融合基因的转录水平。结果 (1)RQ-PCR与传统巢式PCR(RT-PCR)检测结果的差异有统计学意义(P<0.05),提示应用RQ-PCR检测PML/RARa融合基因转录水平的敏感性高于RT-PCR。(2)RQ-PCR可对PML/RARa融合基因进行定量检测,监测患者的PML-RARa融合基因拷贝数水平变化,结果显示初诊时较高,有效治疗后迅速下降,复发时又出现上升,提示若患者在完全缓解(CR)后PML/RARa融合基因拷贝数呈现上升趋势,其复发机率大。结论 RQ-PCR检测作为APL治疗后微小残留病检测的方法,准确可靠,可以判断治疗效果,预测疾病复发,早期给予干预治疗,有重要的临床应用价值。     

实时定量聚合酶链反应在急性早幼粒细胞白血病融合基因检测中的临床应用

目的 比较不同类型的逆转录荧光实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测急性早幼粒细胞白血病（APL）PML-RARα融合基因的方法.方法 建立荧光染料SYBR Green Ⅰ和Eva GreenRQ-PCR技术,同时检测56例APL融合基因PML-RARα的表达水平,并且与传统巢式PCR方法进行敏感度比较.选择10例初诊患者随机分为两组,分别给予维甲酸（ATRA）加化疗或ATRA加三氧化二砷治疗.每3周抽取骨髓标本,检测治疗后PML-RARα表达的变化.结果 两种RQ-PCR的灵敏度均可达到50拷贝,稍低于巢式PCR,但RQ-PCR定量准确,不易污染.分别取10^3拷贝和10^7拷贝的PML-RARα质粒以及患者cDNA同时做8次SYBR-Green Ⅰ平行扩增,批内变异系数分别为7.31%、8.26%和5.02%.不同APL患者PML-RARα表达水平有较大差异,初诊患者PML-RARα/GAPDH比值介于0.018～0.799,中位值为0.070;使用这两种染料建立的RQ-PCR方法进行定量检测,荧光染料Eva-Green荧光强度高于SYBR GreenⅠ 4倍.对接受ATRA加化疗或ATRA加三氧化二砷治疗两种不同治疗方案的APL患者动态观察发现,2～4周PML-RARα转录本均迅速减少,2个月后80%PML-RARα转阴,但两种治疗方式无明显差异.结论 RQ-PCR可以准确检测微小残留病（MRD）融合基因表达水平;Eva Green和SYBR Green Ⅰ都可以用于RQ-PCR,但是Eva Green更敏感高效;监测融合基因表达可以有效观察不同治疗方法的治疗效果.     

急性早幼粒细胞白血病PML—RARα融合基因检测的临床意义探讨

目的探讨PML-RARα融合基因检测在临床检查急性早幼粒细胞白血病（APL）治疗前后的意义。研究PML—RAR饯融合基因含量与急性早幼粒细胞白血病（APL）病变进程的关系。方法运用RT-PCR技术检测急性早幼粒细胞白血病患者治疗前后骨髓内PML-RARα融合基因含量。结果所有51例初诊为APL的患者均做PML—RARα融合基因检测,其中阳性4l例,阳性率为80．4％。初诊为APL的51例患者治疗18个月后（进行随访）,其中死亡3例,阳性3例,阳性率为5．9％。结论PML-RARα融合基因的检测对APL诊断具有重要价值。定期检测PML—RAR仅基因可尽早发现分子学复发以及时治疗,并避免血液学复发。     

急性早幼粒细胞白血病实时定量PCR测定PML-RARa融合基因的临床意义

[目的]探索实时定量PCR(RQ-PCR)检测PML-RARa融合基因对急性早幼粒细胞白血病(APL)的意义.[方法]对22例初诊APL病人血液标本(骨髓/外周血)进行了上述检测.并对其中的12例达到缓解后进行了RQ-PCR,观测PML-RARa融合基因的定量下降程度.[结果]所有患者治疗前均检测到了PML-RARa融...     

筑巢式RT-PCR检测早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的检铡急性早幼粒细胞白血病(APL)中染色体易位t(15；17)所形成的早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α(PML-RARα)融合基因转录本。方法筑巢式逆转录酶／多聚酶链反应(RT-PCR)。结果在30例APL中，L型18例，S型10例，另有两例完全缓解者(CR4年和6年)未检测到上述转录本。10例初治APL同时进行PML-RARα融合基因和细胞遗传学检查，10例患者均植铡刊PML-RARα融合基因，而只有6例检测到t(15；17)易位染色体。结论PML-RARα融合基因植铡在APL的诊断、疗效评价及MRD的监测中是一个快速、准确且灵敏的方法。     

PML-RARoL融合基因L型选择性剪接与急性早幼粒细胞白血病患者预后的关系

目的 探讨PML-RARα融合基因L型选择性剪接与急性早幼粒细胞白血病(APL)患者预后关系.方法 用RT-PCR方法检测33例APL患者PML-RARα融合基因,用UVP凝胶成像分析系统对各扩增条带即E5(+)E6(+)(第5外显子和第6外显子均存在),E5(-)E6(+)(第5外显子缺失)和E5(-)E6(-)(第5外显子和第6外显子均缺失)三条带型进行灰度扫描,计算各剪接体相对表达量;对各剪接体相对表达量、初诊时外周血白细胞计数及年龄三个因素进行单因素及多因素预后分析.结果 死亡组与第1次完全缓解(CR1)组相比,E5(-)E6(+)和E5(-)E6(-)剪接体相对表达量差异有统计学意义(P值均＜0.01),E5(+)E6(+)表达量差异无统计学意义(P＞0.05).死亡组E5(-)E6(+)、E5(-)E6(-)、E5(+)E6(+)相对表达量分别为0.23±0.12、0.58±0.18、0.20±0.09,CR1组分别为0.45±0.16、0.23±0.12、0.31±0.16.初诊时白细胞计数及年龄与预后无明显相关性(P值均＞0.05).Logistic回归多因素预后分析显示E5(-)E6(+)剪接体相对表达量与预后无明显相关性(B=3.475,P=0.492),而E5(-)E6(-)相对表达量与预后呈负相关(B=-19.660.P=0.046).结论 初诊时E5(-)E6(-)剪接体表达量较高的APL患者预后差.     

全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中分化抑制因子1表达水平的变化

目的 探讨分化抑制因子1(ID1)在全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的作用.方法 运用基因芯片、放线菌酮抑制试验、实时定量RT-PCR和Western blot.方法 检测ID1存ATRA诱导的APL细胞系及原代APL细胞分化过程中表达情况.结果 在ATRA污导的NB4细胞和APL初诊患者原代细胞分化过程巾ID1基因的表达上调,ATRA诱导NB4细胞2hID1表达达高峰,其相对表达水平与对照相比升高359.4±48.7倍;ATRA处理APL患者骨髓细胞ID1表达水平2 h达高峰,其中1例患者晕复3次检测的.结果 为对照的(311.1±48.7)倍.而且ID1基因的上调不需要其他蛋白的合成.而在ATRA处理ATRA耐药细胞系NB4-R2细胞未见ID1的表达发生明显变化.结论 ID1基因可能作为ATRA的靶基因参与了ATRA诱导的粒系分化.     

实时定量PCR动态监测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的临床意义

目的:探讨实时定量PCR(RQ-PCR)监测PML-RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的临床意义.方法:采用实时定量PCR(RQ-PCR)法监测患者骨髓PMLRARα融合基因亚型及动态变化.结果:初发32例患者中28例(87.5%)患者PML-RARα融合基因阳性,其中长型(L)19例(67.9%),短型(S)9例(32.1%).23例(82.1%)患者初次诱导后完全缓解,其中L型18例(94.5%),S型5例(55.6%),L型完全缓解率优于S型(P＜0.05),而复发率和病死率均低于S型,但差异无统计学意义(P＞0.05).长期随访的28例完全缓解患者,4例分子学复发,其中1例发生于第一次完全缓解后3个月,诱导缓解治疗后达第二次完全缓解,随后3个月再次分子学与血液学复发,再次诱导后达第三次完全缓解;3例在第一次完全缓解后3、4个月复发,经1疗程诱导后缓解,随访结束时生存期已达24个月.结论:APL初诊时PML-RARα融合基因亚型的检测可在一定程度上提示疾病的预后.在完全缓解期定期监测PML-RARα融合基因,可尽早发现分子学复发,及时治疗,避免血液学复发.     

急性早幼粒细胞白血病患者纤溶活性的临床研究

目的 研究急性早幼粒细胞白血病(APL)患者纤溶活性在诱导治疗缓解前后的改变及其机制,观察全反式维甲酸(ATRA)或ATRA+三氧化二砷(ATO)诱导治疗对APL患者纤溶活性的影响.方法 选择初治APL患者26例,在诱导治疗过程中分别用发色底物法和ELISA法检测患者血浆纤溶酶原和纤维蛋白(原)降解产物(FDP),用全自动血凝仪检测纤维蛋白原和D-二聚体,在治疗前和完全缓解后用流式细胞术检测细胞表面膜联蛋白Ⅱ(Annexin Ⅱ)和尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(u-PAR)的表达,实时定量PCR检测AnnexinⅡ和u-PAR的mRNA表达水平.结果 APL患者存在原发性纤溶亢进,APL细胞表面Annexin Ⅱ和u-PAR蛋白的表达率和mRNA水平均高于正常对照,经以ATRA或ATRA+ATO为基础的诱导缓解方案治疗达到完全缓解后血浆纤维蛋白原、纤溶酶原、FDP及D-二聚体恢复正常,Annexin Ⅱ和u-PAR表达水平相应下降,但仍高于正常对照水平.结论 APL细胞表面Annexin Ⅱ和u-PAR高表达可促使APL纤溶酶生成增多,导致APL患者纤溶亢进.ATRA或ATRA+ATO可通过下调APL细胞Annexin Ⅱ和u-PAR表达纠正APL纤溶异常,这可能是减少APL出血的机制之一.     

全反式维甲酸诱导分化急性早幼粒细胞白血病客观疗效评估的建议

由于对全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的缓解疗效及开始向化疗移行日期的判断尚有困难,作者对18例APL患者治疗中骨髓像、染色体及基因分析[RARα重排,PML-RARα微小残留病(MDR)]作了连续的检测,以探讨ATRA     

免疫荧光动态监测急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合蛋白变化

背景：实时定量RT-PCR只能间接地反映融合基因表达量的变化,并不能在细胞原位直观反映急性早幼粒细胞白血病患者细胞内PML-RARα融合蛋白在全反式维甲酸治疗前后的相对表达量。目的：探讨免疫荧光技术检测融合蛋白PML-RARα表达的动态变化在判断急性早幼粒细胞白血病的全反式维甲酸早期治疗的效果。方法：应用免疫荧光技术检测全反式维甲酸干预的急性早幼粒细胞白血病经典细胞株NB4细胞或来源于急性早幼粒细胞白血病患者的NB4细胞PML-RARα蛋白的表达,以实时定量RT-PCR检测细胞PML-RARα mRNA的表达作为对照,以评价免疫荧光技术的可靠性。结果与结论：免疫荧光染色显示,无论是体外培养的NB4细胞,还是患者骨髓内的NB4细胞,在全反式维甲酸干预前细胞内均可见大量红色的融合蛋白PML-RARα,大小不均一、形状不规则,全反式维甲酸干预后,NB4细胞内红色的融合蛋白PML-RARα形状逐渐规则,弥散状态变为散在分布,且随着全反式维甲酸干预时间的延长,原有的弥散状态逐渐消失。实时定量RT-PCR测得的PML-RARα mRNA的变化趋势与免疫荧光相一致。说明免疫荧光技术检测PML-RARα能够更为直观地判断全反式维甲酸的治疗效果。