原代睾丸支持细胞分离纯化及双室培养模型的建立

[目的]通过建立双室培养模型,为探讨毒物或药物对睾丸支持细胞作用机制提供一个合适的体外研究方法。[方法]18d龄雄性SD大鼠,脱颈椎处死后,无菌条件下取睾丸组织,经胰蛋白酶和胶原酶二步消化后获得支持细胞,经接种、纯化和鉴定,获得纯度>95%支持细胞。培养液A为DMEM培养基和F12培养基按照1:1比例用去离水配制,每升培养基中含有20万单位青霉素和0.2g链霉素,用2%的碳酸氢钠调整pH值为7.2左右。培养液B为培养液A中加入维生素A、E(200ng/ml)和胰岛素(2μg/ml)。培养液C为B培养液中再加入卵泡刺激素(100ng/ml)和睾丸酮(10-8mol/L)。将制备好的支持(Sertoli)细胞混悬液按2.5×106个/ml浓度接种于24孔培养板内,培养条件为35℃(睾丸细胞的适宜温度),2%CO2恒温静止培养。测定3种不同培养液中培养的支持细胞形成的跨细胞上皮电阻值(transep-ithelialelectricalresistance,TER)。[结果]培养液加入维生素A、E和胰岛素后,支持细胞形成的TER有所升高,而培养液在加入睾丸酮和卵泡刺激素后,Sertoli细胞形成的TER则显著升高。培养第1天3种培养液中培养的Sertoli细胞形成的TER分别为33.85、31.38和34.26Ω/cm2,培养第13天分别为198.53、289.91和707.50Ω/cm2。[结论]Sertoli细胞双室培养模型可模拟体内状态的“血睾屏障”,为体外研究雄性生殖毒性机制提供一个合适模型。     

人子宫平滑肌细胞的原代培养及应用

目的掌握人子宫平滑肌细胞原代培养的方法,可以籍之开展一系列的研究工作.比如进行体外药物实验,研究细胞的增殖与遗传,了解平滑肌细胞的动力学效应等许多方面.而且该方法目前在国内未见成功报道.方法用剪切胶原酶消化法分离人子宫平滑肌细胞.用DMEM和胎牛血清进行培养.传一代时用desmin和α-action单抗进行鉴定.结果经实验该法成功率高,纯度高,细胞活力好.结论用该法可以成功进行人子宫平滑肌细胞的原代培养.     

小鼠肝星状细胞分离与鉴定

目的 探讨小鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离效率.方法 取体重约30 g的雄性ICR小鼠,用Ⅳ型胶原酶、Dnase Ⅰ进行体内门静脉灌注消化小鼠肝脏细胞,经过Percoll不连续密度梯度离心法分离小鼠肝星状细胞.台盼蓝拒染方法鉴定细胞存活率,紫外激发下观察自发荧光,油红O染色和结蛋白细胞免疫荧光染色鉴定细胞.结果 小鼠肝星状细胞得率为6.5×105/只,存活率在91％以上,纯度大于92％.结论 该实验建立了简便而有效的小鼠肝星状细胞分离与鉴定方法.     

小鼠滋养层细胞原代培养方法的优化

目的 建立一种简便、有效的小鼠滋养层细胞原代培养方法,为研究病理妊娠的发生机制奠定基础.方法 分别在K.Handschuh和Zhou WH方法的基础上进行改良,获取孕鼠滋养层细胞,进行原代培养,并应用细胞计数及免疫细胞化学法比较滋养层细胞数量和纯度.结果 K.Handschuh改良法和Zhou WH改良法获得滋养层细胞数目分别为(11.4±1.8)×104个/mL、(16.3±0.9)×104个/mL,纯度分别为95%、96%,在获得滋养层细胞数目方面Zhou WH改良法优于K.Handschuh改良法(P<0.05).结论 Zhou WH改良法可获得高纯度足量的小鼠滋养层细胞.     

利用胶质细胞滋养层进行分离式原代神经元培养

为使原代培养神经元能长期健康地生长发育 ,并且易于分离、纯化 ,本文利用胶质细胞滋养层进行胶质细胞与神经元分离式培养。结果表明 ,此方法可靠易行 ,所培养的神经元具有纯度高、健康及存活期长的优点 ,能满足很多相关研究的需要     

两种人早孕绒毛滋养层细胞的原代培养方法

目的:比较两种不同方法进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养的异同。方法:分别用组织块培养法和3种酶联合消化法(Ⅳ型胶原酶、低浓度胰酶及DNaseⅠ)、Ficoll 400梯度密度离心法对人早孕绒毛滋养层细胞培养。结果:两种方法进行早孕滋养层细胞的培养均获得成功,其生长率比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:组织块培养法简单易行,但细胞数量少,生长缓慢,难以完成后续实验;3酶联合消化、Ficoll 400梯度密度离心法相比较而言,可获得数量更多的活力好、纯度较高的具有不同分化功能的滋养层细胞,为进一步研究其侵袭、增殖能力等生理、病理作用提供了坚实的基础。     

人羊膜间充质干细胞体外传代培养对染色体核型的影响

目的:分离培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)并进行体外长期传代培养,通过对连续传代的细胞形态、膜表面标志、增殖、分化特性以及染色体核型进行研究,以观察体外培养对该细胞的影响,为其储备和临床应用提供实验依据。方法:无菌条件下从新鲜人胎盘组织分离羊膜,采用组织贴壁法分离培养hAMSCs,并对原代细胞～P11代细胞利用流式细胞技术检测其膜表面标志物;取P3～P4代细胞向神经细胞和成骨细胞诱导,免疫组化染色、PCR检测基因表达情况;采用染色体G显带法制备染色体核型。结果:hAMSCs形态似长梭型,呈流水状生长,细胞活性高,冻存复苏后仍能保持正常形态,并可在体外稳定扩增,细胞生长曲线呈"S"型;细胞高表达CD90、CD73、CD44、CD105;细胞经诱导后可以向神经细胞和成骨细胞分化,神经元特异性烯醇化酶和成骨细胞矿化结节检测为阳性,PCR检测巢蛋白和骨桥蛋白基因表达为阳性;P3～P10代的hAMSCs染色体核型均为正常二倍体核型。结论:hAMSCs在体外经数代培养后能保持间充质干细胞的外显和遗传特性,并且未见染色体核型异常改变。     

小鼠睾丸支持细胞的原代培养和鉴定

目的 建立小鼠睾丸支持细胞培养方法，为从细胞和分子水平研究环境化合物对雄性生殖系统的影响提供条件。方法 采用两步胶原酶消化，提取出生10d的ICR雄性小鼠睾丸支持细胞，用Tris-HCl处理后除去生精细胞，进一步纯化。倒置相差显微镜和苏木精-伊红（HE）染色观察细胞生长和形态。Feulgen染色法鉴定支持细胞。结果 培养的支持细胞增生活跃，纯度〉95％，Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。结论 酶消化法分离和Feulgen染色法鉴定大鼠支持细胞简单易行，且细胞纯度较高。为今后研究生殖毒理提供了条件和方法。     

大鼠肾细胞分离制备及培养方法的比较

目的比较胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法和胶原酶、胰蛋白酶两步消化法(简称两步消化法)对大鼠肾细胞分离效果及细胞产量的影响,以及不同培养基(MEM、RPMI1640)、鼠龄(乳鼠、成年鼠)对细胞产量、质量、增殖率和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响。方法分别对两组Wistar大鼠(乳鼠和成年鼠)用三种不同的消化方法制备大鼠肾组织细胞悬液,分别在MEM培养液和RPMI1640培养液中原代培养,培养48小时之后第一次传代,观察细胞质量,计算细胞产量,MTT法检测传代细胞24~48小时之间的增殖率,生化分析仪检测传代细胞第1~7天培养液中LDH漏出量。结果胶原酶消化法和两步消化法的肾细胞产量显著高于胰蛋白酶消化法(P<0.01),两步消化法的细胞质量优于胶原酶消化法,MEM培养液和RPMI1640培养液对细胞产量、增殖率和LDH漏出量的影响均无显著性差异,乳鼠的肾细胞产量显著高于成年鼠(P<0.01)。结论两步消化法对于肾细胞的分离制备尤为适合,MEM培养液和RPMI1640培养液均适于肾细胞的培养,乳鼠比成年鼠更适合肾细胞的制备。     

大型成年哺乳类动物绵羊阴道平滑肌细胞的原代培养改进方法研究

目的探索原代培养成年大型哺乳动物绵羊阴道平滑肌细胞(vaginal smooth muscle cells,VSMC)改良方法。方法成年绵羊阴道平滑肌取材,利用预消化组织块法(将组织剪碎呈1 mm3大小组织块,0.1%Ⅰ型胶原酶消化20 min,0.1%胰酶-EDTA与0.1%Ⅰ型胶原酶混合溶液再次消化30 min,将组织块种于培养瓶)原代培养VSMC,并与传统组织块法和酶消化法进行细胞萌出速度及增殖速度比较,提高VSMC原代培养效率;免疫荧光染色法和western bloting法检测平滑肌细胞标志物calponin及a-SMA表达鉴定VSMC。结果预消化组织块法获得原代VSMC速度快于传统组织块法和酶消化法,3 d可见细胞萌出,9 d可达80%细胞融合,"峰谷"特征明显,而酶消化法至12 d增殖至80%细胞汇合,传统组织块法约7 d可见细胞萌出,14 d可达80%细胞汇合;VSMC平滑肌标志物calponin和a-SMA均呈阳性表达(P0.05);VSMC可扩增代数有限,扩增7代后即表现出细胞形态改变,增殖缓慢,胞核内出现空泡,死亡细胞增加等表现。结论预消化组织块法可较快速多量获得绵羊VSMC。     

白纹伊蚊唾液腺细胞的原代培养

目的探讨白纹伊蚊唾液腺细胞的培养,试图建立白纹伊蚊唾液腺细胞的原代和传代培养。方法采用Schneider培养基添加10％的胎牛血清和双抗（100U／ml青霉素,100gμ/ml链霉素）作培养液,在无菌条件下取出唾液腺,经PBS液清洗后放入培养液中,置26℃培养箱中培养。结果3d后白纹伊蚊唾液腺组织开始长出单个细胞,6d后单个细胞增多。说明白纹伊蚊唾液腺细胞在体外培养条件下能够存活一段时间。结论白纹伊蚊唾液腺细胞体外培养存活。     

用细胞计数器和苔盼兰染色技术计数和判定细胞的活性（基础）

在细胞的标准化培养和进行正确的定量试验时，判定培养细胞的数量非常重要。细胞计数器是一个厚玻璃，在中央设计有计数槽。细胞计数器的精确度是可变的。这里我们所描述的是Baxter Scientific到Neubauer。的改良法。中央部分是细胞计数平台，是一个1mm凹槽，这个计数平台被横间的凹槽分成两部分。每一个计数凹槽都是由银制的板组成，并且被制成     

新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞纯化及培养方法的改进

目的快速纯化大鼠大脑皮质原代星形胶质细胞并进行传代培养。方法取新生2日龄SD大鼠大脑皮层,每2只为一组,将剥除软脑膜的大脑皮层剪碎,添加0. 25%胰蛋白酶-EDTA溶液500μL,37℃消化15 min,将细胞悬液接种于未用多聚赖氨酸处理过的培养瓶中,37℃、5%CO_2细胞培养箱中孵育15 min后,将细胞以5×10~6个/m L接种于L-多聚赖氨酸包被的T75培养瓶中。待细胞长满瓶底,200 r/min 37℃恒温摇18 h,加入1 m L 0. 25%胰蛋白酶,待大部分细胞悬浮后收集细胞。在倒置相差显微镜下对细胞进行形态学观察,胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色法进行星形胶质细胞纯度鉴定,并以MTS法测定传代后细胞增殖活力。结果星形胶质细胞纯度达到(97. 86±0. 91)%,细胞传代后生长情况及增殖活力良好。结论该方法可以高效获取原代及传代的大鼠大脑皮质星形胶质细胞。     

流式细胞术（基础）

传统的光镜和电镜技术为研究细胞和坏死提供了很好的分析方法，但不能进行定量；生物化学如DNA梯状带或DNA片断的测定可定量，但测定的实质是定性或检测调亡细胞比例或群体细胞中含凋亡细胞的大致数量，而不能分析群体细胞中单一细胞的生物学变化。流式细胞仪或称流式细胞术可通过荧光激发分选细胞，大量快速地测定单个细胞，其对细胞分析和分选的功用，是近年来荧光细胞分析技术的创举，开创了生物细胞研究的新领域。     

胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定

目的 探讨胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定的方法,为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础. 方法 Sprague-Dawley大鼠孕18 d时剖宫取出胎鼠,手术显微镜下取胎鼠四肢骨骼肌肌肉,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离胎鼠骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法进行纯化.原代培养的生长培养基为(DMEM/F12+ 20％ FBS+ 10％ HS+5 ng/ml bFGF).分化培养基为(DMEM/F12+ 2％ HS).CCK-8法绘制胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线图,细胞免疫组化染色鉴定纯化后细胞的肌源性标志蛋白Desmin,观察分化培养基条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性. 结果 胎鼠原代骨骼肌卫星细胞在培养的第3天进入对数生长期,5～6d达增殖平台期;纯化后的细胞90％以上表达结蛋白(Desmin).在分化培养基的诱导下细胞之间相互融合形成具有自发节律性收缩特性的多核肌管. 结论 采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞,能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞.     

人胃癌原代细胞的甲硫氨酸依赖性研究

目的：探讨人胃癌和胃粘膜上皮原代细胞在体外不含甲硫氨酸（Met)而含同型半胱氨酸（Hcy)培养基（Met^-Hcy^ ）中能否正常生长及是否存在Met依赖性。方法：将将鲜人胃癌及胃粘膜组织制成单细胞悬液，分别置于Met^-Hcy^＋和Met^ Hcy^－培养基中培养，利用细胞计数和流式细胞分选仪检测各组细胞增殖状态。结果：人胃癌原代细胞在Met-Hcy^ 培养基中生长受抑，表现为细胞总数减少，G0，G1期细胞比例下降，S期细胞比例升高，胃粘膜细胞在Met-Hcy^ 培养基中生长正常，细胞总数及细胞周期比例未受影响。结论：人胃癌原代细胞在体外培养中表现出Met依赖性，而胃粘膜细胞则未见类似现象。     

膜片钳技术（基础）

膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多数的)离子通道分子活动的技术。1980年以来此技术已可用于很多细胞系的研究。     

甲苯对原代培养海马神经细胞的毒性研究

目的　通过在体外对原代培养的海马神经细胞进行染毒 ,观察其对神经细胞的毒作用 ,并探讨其作用机制。方法　取新生的SD大鼠海马神经细胞进行原代培养 ,两周后 ,用甲苯染毒 ,分成 3个染毒组 ,染毒浓度分别为 3、6和 9mmol L ,并设空白对照组和赋形剂组 ,染毒 2 4h ,观察其对细胞形态、细胞存活率、LDH漏出率、细胞内游离钙和细胞凋亡的影响。结果　甲苯染毒后 ,细胞的形态发生改变 ,引起细胞突起萎缩 ,细胞肿胀变圆 ,细胞数量减少 ;神经细胞存活率的显著下降 ,且随着染毒时间的延长及浓度的升高其存活率逐渐降低 ;高剂量组神经细胞LDH漏出率的显著升高 ,与对照组相比有显著性 (P <0 0 5 ) ;细胞细胞内的[Ca2 + ]i浓度显著上升 ,与对照组相比P <0 0 5 ,并呈剂量依赖性的变化 ,加入钙通道拮抗剂硫氮卓酮后 ,则未见 [Ca2 + ]i浓度上升 ;可见明显的细胞凋亡。结论　甲苯体外染毒对神经细胞有较强的毒性。这可能与甲苯有较强的脂溶性、引起细胞钙内流增加 ,促进细胞凋亡有关。     

去甲硫氨酸环境加化疗药物 对人胃癌原代细胞生长的阻抑

目的：探讨人胃癌原代细胞在体外去除甲硫氨酸（Met)但含同型半胱氨酸（Hcy)的培养基（Met-Hcy^ ）中能否正常生长和去Met状是否增加化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用。方法：将40例新鲜人胃癌组织制成单细胞悬液,分别置于Met-Hcy^ 和Met＋Hcy^－（含Met不含Hcy)的培养其中培养48h,利用MTT等方法检测各组细胞增殖情况以及在不同培养基中分别加入ADM、DDP、5－FU、MMC和MTX化疗药物后对各组细胞增殖的抑制程度。结果：①人胃癌原代细胞在Met＋Hcy^－培养基中表现为细胞总数减少;②Met-Hcy^ 培养基分别与ADM、DDP、5－FU、MMC和MTX联合时,可显著提高各化疗药物对胃癌原代细胞的杀作用。结论：①人胃癌原代细胞在体外培养中表现对Met的依赖性; ②Met-Hcy^ 培养环境联合应用各化疗药物,可对人胃癌原代细胞的杀伤作用;③MTT法是检测“Met饥饿法”联合个体化疗药物敏感性的有效手段。     

甲基苯丙胺对大鼠小胶质细胞损伤作用

目的观察甲基苯丙胺(Meth)通过电压门控钾离子通道亚型1.3、1.5(Kv1.3、Kv1.5)对大鼠胎鼠小胶质细胞的损伤作用。方法SD胎鼠原代培养小胶质细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力和原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡;采用蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应法观察Kv1.3、Kv1.5表达变化。结果Meth呈浓度依赖性降低小胶质细胞活力,增加小胶质细胞凋亡;Kv1.3的抑制剂MgTx对Meth所致小胶质细胞损伤有部分保护作用;与对照组(1.047±0.165)比较,300 μmol/L Meth组小胶质细胞Kv1.3 mRNA表达(7.453±0.675)增高(P<0.05),MgTx组Kv1.3 mRNA表达(1.684±0.875)低于Meth 300 μmol/L组(P<0.05);Meth对Kv1.5 mRNA表达无影响。结论Meth可引起小胶质细胞损伤,其机制可能与Kv1.3表达变化有关。