颞叶癫痫大鼠模型海马蛋白质组学的研究

目的 研究颞叶癫痫大鼠海马组织差异表达的蛋白质,为探讨癫痫发病机制和寻找新的治疗靶点提供依据.方法 运用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马组织的差异蛋白进行分析鉴定.结果 检测到颞叶癫痫大鼠海马组织中19个差异表达的蛋白质点...     

癫痫持续状态大鼠海马线粒体分裂、融合的变化

目的 探讨癫痫持续状态大鼠海马线粒体分裂、融合的变化。方法 将50只Wistar大鼠随机分为正常对照组和癫痫组,癫痫组分为癫痫持续状态后4、8、24和72h组,观察癫痫持续状态后不同时间点大鼠海马线粒体分裂、融合的变化。Western blotting、PCR分析海马线粒体中Drp1、hFis1、 Mfn1、Opa1的表达;免疫组化分析海马CA3区神经细胞Drp1、Opa1的表达。结果 Drp1、 hFis1在癫痫持续状态后4h时开始升高,24h达高峰,72h仍处于较高水平;Mfn1、Opa1在癫痫持续状态后4h时出现短暂的升高,随即表达下降,并于24h时达最低水平。癫痫持续状态后24h时,大鼠海马CA3区Drp1阳性神经元数目显著高于对照组(P＜0.05),Opa1阳性神经元数目显著低于对照组(P＜0.05)。结论 癫痫持续状态大鼠海马线粒体分裂、融合失衡,主要表现为线粒体分裂增强、线粒体融合抑制。     

癫痫大鼠海马线粒体融合分裂相关基因的表达变化

目的:观察大鼠癫痫持续状态后线粒体融合分裂相关基因Mfn2和Drp1在海马中的动态变化,探讨线粒体融合分裂在癫痫发生中的作用。方法:随机将成年雄性Wistar大鼠48只分为对照组、癫痫持续状态(status epilepticus,SE)后2 h、8 h及24 h组,后3组建立氯化锂-匹鲁卡品诱导的大鼠癫痫持续状态模型。观察各组大鼠行为学变化;采用Nissl染色检测海马神经元损伤;采用实时定量PCR(real time quantitative PCR,QT-PCR)方法观察大鼠海马Mfn2及Drp1 mRNA表达变化。结果:①与对照组相比,SE组可见大鼠海马CA1和CA3区细胞正常结构破坏、神经元脱失等改变,以癫痫发作后24 h最显著。②与对照组相比,SE后Mfn2 mRNA表达均较对照组显著降低(F=5.362,P=0.006),而Drp1 mRNA表达均较对照组显著升高(F=6.655,P=0.002)。结论:线粒体融合分裂失平衡可能是造成癫痫神经损伤的重要原因。     

线粒体分裂蛋白抑制剂对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影响

目的:研究线粒体分裂蛋白抑制剂(mitochondrial division inhibitor,Mdivi-1)对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影响及机制。方法:121只雄性SD大鼠随机分成4组,分别为对照(CON)组、PILO组、PILO+DMSO组和PILO+Mdivi-1组。观察各组大鼠行为学改变,并分别采用尼氏染色法及TUNEL法检测神经元损伤及凋亡,Western blot法检测动力相关蛋白1(dynamin-releted protein 1,Drp1)和半胱天冬酶3(caspase-3)表达水平。结果:Mdivi-1组较PILO组致痫成功率降低(P>0.05),海马神经元损伤显著减轻(P<0.05)。Mdivi-1明显降低癫痫持续状态(status epilepticus,SE)引起的海马神经元凋亡和caspase-3激活(P<0.05)。结论:Mdivi-1对癫痫大鼠海马神经元凋亡有明显的抑制作用,其机制可能是抑制caspase-3激活。     

难治性癫痫耐药机制的研究进展

多项研究证实大约30％的癫痫患者应用抗癫痫药物治疗后并不能完全控制其发作^[1],临床称为难治性癫痫或耐药性癫痫。然而其耐药机制的形成一直是癫痫领域研究的难点问题。难治性癫痫的临床特征包括：发病年龄早,具有多种发作类型,每次发作时间长,影像学检查显示有脑部结构异常（如海马硬化）,[第一段]     

颞叶癫痫大鼠海马线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅲ和Ⅳ表达的变化

目的:探讨癫痫对大鼠海马线粒体细胞色素氧化酶（COX）的mtDNA和nDNA编码亚基Ⅲ、Ⅳ表达的影响。方法:将成年雄性Wistar大鼠40只随机分为生理盐水对照组,癫痫持续状态（SE）后急性期（3h）、静止期（7d）、慢性期（45d）组和注射匹鲁卡品（PILO）但未出现SE组,每组8只。荧光实时定量PCR和Western blot分别检测海马线粒体COX Ⅲ、Ⅳ mRNA和蛋白的表达。结果: COX Ⅲ mRNA和蛋白在SE后3h表达明显升高(P<0.001, P<0.01),7d时降到对照水平,45d显著降低(P<0.001, P<0.01);COX Ⅳ mRNA和蛋白在3h时表达较对照组升高,但差异无统计学意义（P＞0.05),7d和45d时下降至对照水平。注射PILO但无SE组与对照组结果类似。结论: 颞叶癫痫海马cox功能紊乱与痫性发作相关,线粒体编码的基因更易受痫性发作的影响。     

二氮嗪抑制癫痫大鼠海马神经元凋亡的研究

目的 观察线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoKATP)开放剂二氮嗪(DZ)对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元线粒体凋亡通路相关凋亡因子的影响,探讨DZ对癫痫大鼠神经保护作用的机制.方法 采用腹腔注射的方法,建立氯化锂-匹鲁卡品( PILO)诱导的大鼠癫痫持续状态(SE)模型.在检测大鼠海马凋亡相关蛋白水平变化时分为对照组,SE后24h、72 h、5d组;在检测DZ对海马神经元保护作用时分为对照组、PILO致痫72 h组(PILO组)、DZ预处理组(PILO+ DZ组)、DZ +5-羟基癸酸(5-HD)预处理组(PILO+ DZ+ 5-HD组).SE后分别在相应时间点灌注取脑,采用TUNEL法检测细胞的凋亡;采用Western blot法检测大鼠海马Bcl-2、Bax、活性半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3( Caspase-3)蛋白的水平及细胞色素C(cytC)由线粒体到胞浆的释放.结果 与正常对照组比较,SE组大鼠在SE后备相应时间点TUNEL染色阳性细胞明显增加(P＜0.05),海马Bcl-2蛋白、线粒体中的细胞色素C(mito-cytC)的表达显著降低(P＜0.05),海马Bax、活性Caspase-3蛋白及胞浆中的细胞色素C(cyto-cytC)的表达明显增高(P＜0.05).与PILO组及PILO+ DZ+ 5-HD组比较,PILO+ DZ组降低的海马Bcl-2蛋白水平显著升高(P＜0.05),而升高的海马Bax、活性Caspase-3蛋白的水平明显降低(P＜0.05),cytC由线粒体到胞浆的释放减少(P＜0.05),TUNEL染色阳性细胞明显减少(P＜0.05).DZ的保护作用能被5-HD阻断.结论 DZ可通过上调Bcl-2/Bax水平,减少cytC的释放,抑制Caspase-3的激活,从而通过线粒体凋亡通路抑制氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠SE后海马神经元的凋亡,对癫痫发作所致的脑损伤具有神经保护作用,为癫痫的神经保护治疗提供新的治疗靶点.     

海人酸致痫大鼠海马CA3区神经元线粒体损伤及caspase 3的表达

目的：观察海人酸（kanic acid,KA）诱导的癫痫持续状态（status epilepticus,SE）大鼠海马CA3区神经元线粒体超微结构的损伤及caspase 3表达的变化。方法：用KA诱导大鼠SE 2?h,分别于SE终止后第3、6、24?h取脑,用电镜观察海马CA3区线粒体的超微结构,同时用免疫组化方法检测相同部位caspase 3表达的变化。结果：SE终止后3?h可见到海马线粒体超微结构损伤,从肿胀到膜的完整性破裂。caspase 3的表达在SE后6?h开始增加,于第24小时明显增高。结论：在实验性SE模型中,海马线粒体的超微结构在早期即有损伤,caspase 3在线粒体损伤后数小时才出现表达,并于SE后24?h明显增高。     

线粒体蛋白质组学研究进展

0 引言 线粒体拥有自己的DNA(mtDNA),可以进行转录、翻译和蛋白质合成. 根据人类的基因图谱,估计大约有1000～2000种线粒体蛋白,大约有600多种已经被鉴定出来. 线粒体蛋白质只有2%是线粒体自己合成的,98%的线粒体蛋白质是由细胞核编码、细胞质核糖体合成后运往线粒体的,线粒体是真核细胞非常重要的细胞器,在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用. 线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程,如ATP的合成、脂肪酸代谢、三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化过程. 线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关,如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症.     

甲状腺癌蛋白质差异表达的观察

目的 由于甲状腺结节的高发率和鉴别良恶性的困难,所以需要寻找一种比较特异的分子标志。本研究的目的就是利用蛋白组学方法,建立人甲状腺癌和癌旁正常组织的双向凝胶蛋白图谱,寻找差异表达的蛋白质。方法 双向凝胶电泳分离人甲状腺癌及其周围正常组织的总蛋白质,通过图形软件分析比较,找出差异表达的蛋白质,利用质谱对差异表达的蛋白质进行鉴定。结果 建立双向凝胶图谱,平均蛋白质点数约为1000个左右。发现只在肿瘤表达的点有263个,表达上调2倍及以上的点有134个。在对差异点进行的质谱鉴定中发现了热休克蛋白27在肿瘤中表达下调。结论 建立了人甲状腺乳头状癌和癌旁正常组织的双向电泳图谱,并鉴定了一些与肿瘤相关的蛋白质。     

癫痫大鼠海马小胶质细胞的激活特点

目的:研究癫痫大鼠海马小胶质细胞在癫痫持续状态后不同时间点激活的特点。方法:采用锂-匹罗卡品癫痫大鼠及免疫组化方法比较不同时间点OX-42阳性细胞的增殖及形态变化。结果:小胶质细胞在癫痫持续状态(SE)后被激活;OX-42阳性细胞在SE 3～7 d时增加达到一个峰值,7～14 d时细胞的增加处于一个相对稳定状态,而14 d以后增加的OX-42阳性细胞逐渐下降,大约在21 d时细胞数恢复到较先前稍高的水平。结论:癫痫发作后的炎症病理损伤与小胶质细胞的增殖活化密切相关,小胶质细胞的激活是构成癫痫炎症损伤机制的重要环节。     

癫痫大鼠海马CA3区Nav1.2、Nav1.6的动态表达变化

目的 动态观察Nav1.2、Nav1.6在氯化锂-匹罗卡品癫痫模型大鼠海马CA3区的表达变化,探讨两者在癫痫发病机制中的可能作用.方法 采用随机数字表法,将90只健康雄性SD大鼠随机分为实验组(n=45)和对照组(n=45),实验组予以腹腔注射氯化锂-匹罗卡品致痫,对照组予生理盐水假处理.根据时间点又分为3个亚组:24 h(n=15)组(n=15)、7d组(n=15)和60 d组(n=15),采用随机数字表法将每亚组再随机分为3个小组(n=5)分别进行免疫组化、Western印迹及RT-PCR方法检测Nav1.2、Nav1.6在大鼠海马CA3区的动态表达.结果 (1)免疫组化检测示实验24 h组海马CA3区Nav1.2蛋白表达相对对照组差异无统计学意义(P=0.492),而实验组Nav1.6蛋白表达(0.398±0.019)较对照组(0.313 ±0.017)显著升高,差异具有统计学意义(P =0.034);实验7d组海马CA3区Nav1.2和Nav1.6蛋白相对对照组差异无统计学意义(P=0.157,0.109);实验60 d组Nav1.2蛋白表达(0.117±0.009)较对照组(0.155±0.010)显著降低,差异具有统计学意义(P =0.002),而实验组Nav1.6蛋白表达(0.400±0.009)较对照组(0.318±0.010)显著升高,差异具有统计学意义(P=0.018).(2) Western印迹检测示实验24 h组海马CA3区Nav1.2蛋白表达较对照组差异无统计学意义(P=0.472),实验组Nav1.6蛋白表达(0.419±0.027)较对照组(0.290±0.007)显著升高,差异具有统计学意义(P=0.001);7 d组Nav1.2和Nav1.6蛋白表达较对照组差异无统计学意义(P=0.517,0.514);60 d组实验组Nav1.2蛋白表达(0.209 ±0.077)较对照组(0.339±0.080)明显降低,差异具有统计学意义(P=0.024),实验组Nav1.6蛋白表达(0.772±0.029)较对照组(0.489±0.014)显著升高,差异具有统计学意义(P=0.00I).(3)RT-PCR检测示实验24 h组海马CA3区Nav1.2 mRNA表达较对照组差异无统计学意义(P =0.453),实验组Nav1.6mRNA表达(2.250±0.117)较对照组(0.998±0.139)显著升高,差异具有统计学意义(P=0.001);7d组Nav1.2和Nav1.6 mRNA表达较对照组差异无统计学意义(P=0.493,0.624);60 d组实验组Nav1.2 mRNA表达(0.718±0.056)较对照组(1.000±0.026)明显降低,差异具有统计学意义(P=0.027),实验组Nav1.6 mRNA表达(2.445±0.167)较对照组(1.003±0.060)显著升高,差异具有统计学意义(P =0.001).结论 Nav1.2和Nav1.6均参与氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠慢性自发性癫痫形成,且Nav1.6在大鼠急性期痫性发作中发挥了作用.     

宫内乙醇暴露对胎鼠大脑线粒体蛋白质组的影响

目的:探讨宫内乙醇暴露对胚胎大脑线粒体蛋白组的影响.方法:CD-1孕鼠随机分成对照组和5.0g/kg乙醇染毒组,染毒期为孕6～15 d,孕18天剖腹取胎,选取没有明显外观畸形的胎鼠进行实验.提取胎鼠大脑线粒体进行全蛋白双向凝胶电泳分析,并用质谱鉴定差异表达的蛋白点,同时进行线粒体呼吸酶活性和大脑细胞ATP含量检测.结果:宫内乙醇暴露组胎鼠大脑线粒体蛋白表达发生改变.呼吸酶复合物Ⅳ(相当于对照组的72.3%±4.6%)和三磷酸腺苷(ATP)合成酶活性(相当于对照组的80.3%±5.1%)均较对照组降低,大脑细胞内ATP含量下降(相当于对照组的67.9%±3.9%).结论:宫内乙醇暴露能够影响胚胎大脑线粒体蛋白表达,即使没有出现明显的形态畸形,胚胎大脑细胞能量状态已经受到影响,可能与孕期饮酒导致的后代神经行为障碍有关.     

雷公藤内酯醇对匹罗卡品致痫大鼠海马神经元的保护性研究

目的研究雷公藤内酯醇对颞叶癫痫大鼠海马神经元的保护作用及其机制。方法随机将70只生后21 d的雄性Wistar大鼠分为空白对照组10只,癫痫组及雷公藤内酯醇干预组各30只。采用Nissl、FJB染色法观察海马神经元的损伤变化;采用免疫组化法检测海马组织中星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和小胶质细胞标志物钙离子结合适配器分子1(IBa-1)的表达状况。结果与空白对照组相比,癫痫组和药物干预组海马神经元损伤明显,GFAP、IBa-1呈高表达;与癫痫组相比,药物干预组海马神经元的损伤较小,GFAP及IBa-1表达较低。结论雷公藤内酯醇对癫痫持续状态后海马神经元的损伤有保护性作用,其作用机制可能与雷公藤内酯醇抑制胶质细胞活化抵抗脑内炎症反应有关。     

注射YVAD-CHO后癫痫大鼠海马组织细胞形态及Caspase-3表达的改变

目的:探讨癫痫大鼠单侧海马注射Caspase-3抑制剂YVAD-CHO后海马组织形态及Caspase-3表达的改变.方法:将YVAD-CHO注射入癫痫大鼠模型单侧海马,HE染色观察组织形态学变化,免疫组化法观察Caspase-3蛋白的表达及相应的改变.结果:HE染色显示,干预组1大鼠海马安蒙角(Cornu ammonis,CA)1-CA3区神经细胞胞质浓染,核固缩等改变,与模型组比较明显减少;免疫组化显示干预组1海马区Caspase-3蛋白的表达较模型组明显减少.结论:YVAD-CHO可在体内抑制大鼠海马神经元凋亡.     

癫痫大鼠脑组织内免疫反应特点的研究

目的:研究脑“免疫特免性”与癫痫发病的关系。方法:用免疫细胞化学法观察IgG免疫反应阳性(IgG-IR)细胞在两种不同处理程序的正常成年、癫痫及尼莫地平作用下癫痫大鼠脑组织内分布情况。结果:灌注大鼠,除癫痫组个别脑片散在弱IgG-IR细胞外,其余均阴性;未灌注大鼠,各组脑片均散布IgG-IR细胞;癫痫大鼠脑组织内IgG-IR细胞分布较正常组增多(P<0.01);尼莫地平作用下癫痫大鼠脑组织内IgG-IR细胞分布与正常组比较无显著差异。结论:脑“免疫特免性”在癫痫发病中具有一定意义。     

癫痫大鼠脑组织内免疫反应特点研究

目的研究脑“免疫特免性”与癫痫发病的关系。方法用免疫细胞化学法观察IgG免疫反应阳性(IgG-IR)细胞在两种不同处理程序的正常成年、癫痫及尼莫地平作用下癫痫大鼠脑组织内分布情况。结果灌注大鼠,除癫痫组个别脑片散在弱IgG-IR细胞外,其余均阴性;未灌注大鼠,各组脑片均散布IgG-IR细胞;癫痫大鼠脑组织IgG-IR细胞分布较正常组增多(p<0.01);尼莫地平作用下癫痫大鼠脑组织内IgG-IR细胞分布与正常组比较无显著差异。结论脑“免疫特免性”在癫痫发病中具有一定意义。     

听源性癫痫发作对大鼠学习记忆的影响及机制探讨

目的探讨癫痫发作对大鼠学习记忆的影响及机制。方法以100dB铃声刺激60s诱发遗传性听源性癫痫大鼠癫痫发作,采用光辨别学习和放射免疫分析相结合的方法,研究大鼠癫痫发作对光辨别学习的影响及脑组织中生长抑素含量的改变。结果癫痫发作后,大鼠光辨别学习能力明显减弱,表现为达到学会标准所需的时间明显延长(6.20±0.97vs3.90±0.57,P<0.01);癫痫发作后,大鼠下丘脑、海马、颞叶皮层组织中生长抑素含量明显增高(下丘脑:551.28±68.21vs273.41±53.51,P<0.05;海马:246.71±43.26vs135.74±36.60,P<0.01;颞叶皮层:235.88±42.14vs150.01±37.71,P<0.01)。结论癫痫发作对大鼠光辨别学习有明显的抑制作用,该作用可能与下丘脑、海马及颞叶皮层组织中生长抑素含量的改变有关。     

GIRK通道开放剂在癫痫大鼠中抗癫痫的研究

目的 探讨GIRK通道开放剂氟吡汀（flupirtine）对癫痫大鼠癫痫发作和脑电图的影响.方法 30只雄性健康成年SD大鼠随机平均分成三组：正常对照组、癫痫＋生理盐水（NS）组和癫痫＋氟吡汀（flupirtine）组.癫痫＋生理盐水（NS）组和癫痫＋氟吡汀（flupirtine）组两组动物复制青霉素诱发癫痫模型,造模成功后分别给予生理盐水和氟吡汀治疗,再观察痫样行为和脑电图.结果 正常对照组行为学和脑电图均正常;癫痫＋生理盐水组有明显痫样行为,脑电图呈现明显的尖波、棘波、尖-慢复合波以及棘-慢复合波的阵发性痫样放电;癫痫＋氟吡汀组大部分大鼠行为正常或是轻度的痫样行为,脑电图恢复正常的基础波放电,只有1例呈少量的痫样放电.结论 GIRK通道开放剂flupirtine对癫痫大鼠痫样行为和异常的脑电图有改善作用.