冰冻切片法破碎大鼠心肌组织提取RNA的实验研究

目的:通过比较液氮研磨法和冰冻切片法破碎大鼠心肌组织来提取RNA的效果,证明利用冰冻切片机破碎动物组织提取RNA是一种简便实用的方法。方法:用液氮研磨法和冰冻切片法破碎大鼠心肌组织并提取RNA,通过RNA浓度、纯度及完整性的检测,以及扩增β-actin基因来比较两种方法的效果。结果:液氮研磨法和冰冻切片法提取的RNA浓度分别为2.59μg/μl、2.05μg/μl。琼脂糖凝胶电泳检测可见两条明显的条带。28s rRNA与18s rRNA条带亮度之比大于1。β-actin基因的PCR扩增在约445bp处有与预期长度一致的明亮条带。结论:本实验结果显示,冰冻切片法破碎心肌组织能达到液氮研磨法的效果,是一种成本低,效果好,快速简便的破碎动物组织提取RNA的方法。     

激光捕获技术在心房细胞定位分离中的应用

目的探索激光捕获显微切割技术（laser capture microdissection,LCM）定位分离心房细胞,并对提取的微量RNA进行β-actin及GAPDH基因扩增。方法首先验证预做LCM样品的完整性,然后常规制备冰冻切片,采用改进的HE快速染色脱水法染色,提取刮片组织的RNA验证其质量,确保在切片染色过程中RNA的完整性．最后进行LCM分离纯化心房细胞,通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增β-actin及GAPDH基因．结果经快速HE染色心房细胞形态学清晰;预做LCM的样品和染色后组织刮片可提取出高质量的RNA,紫外分光光度计测定吸光度值A260／A80为1．9～2．0之间。甲醛变性凝胶电泳显示清晰的28SrRNA和18SrRNA条带,捕获细胞提取的微量RNA经RT—PCR后进行凝胶电泳显示有300bp及357bp的扩增条带．结论LCM可以分离出纯度较高的心房细胞,提取的微量RNA可以扩增出管家基因β-actin和GAPDH．     

pcDNA3.1载体对内参基因表达影响分析

目的:研究转染质粒pcDNA3.1对内参基因表达影响差别,为今后在采用pcDNA3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考.方法:选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcDNA3.1空载体质粒,转染后48 h提取细胞总RNA荧光定量PCR法比较内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphste dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)、18sRNA表达水平差异,提取细胞总蛋白,检测GAPDH、β-actin表达水平差异.结果:5种细胞在转染质粒pcDNA3.1后,内参基因转录和蛋白表达均出现不同程度的下降,其中以β-actin下降最为明显,GAPDH及18sRNA在转录水平下降幅度小,且下降程度接近.结论:pcDNA3.1质粒转染造成基因表达非特异性抑制,其中对管家基因β-actin影响较大,因此在应用pcDNA3.1来源载体进行基因功能分析时,不推荐使用β-actin作为内参基因.     

25%蔗糖磷酸盐缓冲液对肝和肺组织核酸的保护作用

目的 探讨蔗糖磷酸缓冲液作标本保存剂对不同组织标本中核酸的保护作用.方法 用25%蔗糖磷酸缓冲液固定小鼠肝脏和肺组织2～72 h后,检测RNA完整性和纯度.结果 肝组织经25%蔗糖磷酸缓冲液保存48 h内,从中提取的RNA完整性与液氮保存的组织无明显区别,72 h内有明显差别;而肺组织保存72 h内无明显差别.结论 25%蔗糖磷酸缓冲液固定肝组织48 h内,不影响组织标本的RNA提取,而肺组织72 h内不影响组织标本的RNA提取.25%蔗糖磷酸盐缓冲液对不同组织的核酸保护作用时间不同.     

肝包虫新鲜组织标本库的初步建立及鉴定

目的:探讨初步建立包虫新鲜组织标本库的条件,摸索一套适合我院实际情况的建库方法,为更加系统开展进一步的相关研究做好准备. 方法:选取2004年7月～2007年8月期间在我院肝胆外科以肝包虫病为主要诊断而行手术切除的患者的手术标本,分割后用编号的灭菌锡箔纸包好,迅速投入液氮转移罐,然后移至深低温冰箱长期保存.全部病例均经过临床与病理学检查予以证实.随即抽取其中部分组织使用Trizol试剂提取总RNA,以鉴定组织成分的完整性.结果:到目前为止共采集标本120例,随机抽取其中11份标本,经Trizol试剂提取总RNA, 经1%琼脂糖凝胶电泳检测未见显著降解,经紫外分光光度计分析得出其OD260/OD280=1.6～2.0.结论:本实验所采用的标本采集方法可保证标本库的质量,有利于更有效地利用病例资源.     

全麻复合硬膜外阻滞对高血压大鼠心肌c-fos和HSP70基因表达的影响

目的 通过检测高血压大鼠心肌组织c-fos和HSP70基因的表达水平,研究全麻复合硬膜外阻滞减轻应激反应的效果.方法 18只SHR和18只SD大鼠随机分3组:气管切开全麻复合硬膜外阻滞组(A1、A2)、气管切开全麻组(B1、B2)和对照组(D1、D2).全麻以氟芬合剂(0.1～0.3 ml/kg)复合地西泮(3～6mg/kg)腹腔注射,气管切开连接简易呼吸装置.硬膜外阻滞选择T11-T12棘突间隙切开直接向头端插入硬膜外导管2 cm,缓慢注入1%利多卡因0.2 ml.A1、A2、B1、B2组施行脾脏切除术.尾动脉置管连接监护仪监测MAP、HR,同时观察呼吸改变.术后24h处死动物,取心肌组织2块,液氮保存.用RT-PCR方法检测c-fos和HSP70两基因反应产物相对于β-actin值.结果 高血压大鼠全麻复合硬膜外阻滞组(A1)的c-fos/β-actin比值显著低于单纯全麻组(B1),而HSP70/β-actin比值显著高于全麻组.结论 与单纯全麻比较,全麻复合胸段硬膜外阻滞可以减少高血压大鼠手术刺激时心肌c-fos表达、降低应激反应水平,同时增强HSP70表达,对心肌具有一定的保护作用.     

钙激活钾通道基因和蛋白水平在膀胱逼尿肌不稳定中的表达

目的观察膀胱逼尿肌不稳定（DI）中钙激活钾通道（BKCa）基因和蛋白水平变化,探讨BKCa在DI发生机制中的作用。方法通过膀胱出口部位梗阻法建立大鼠DI模型,取其膀胱平滑肌,提取总RNA和总蛋白,以β-actin为内参,分别采用定量PCR和WesternBlot化学发光法检测BKCa通道基因和蛋白水平。结果 DI组大鼠膀胱平滑肌BKCa通道基因和蛋白水平均明显下降,与对照组相比,DI组mRNA水平相对量（与内参照基因β-actin）由0.35±0.12（n=15）下降到0.21±0.09（n=12）,两组比较有显著性差异（P〈0.05）,BKCa通道蛋白水平相对量（与内参照蛋白β-actin）0.41±0.08（n=15）下降到0.23±0.06（n=12）,两组相比有显著性差异（P〈0.01）。结论 BKCa在膀胱逼尿肌不稳定时发生明显改变,可能参与了大鼠膀胱DI的发生,调控DI时BKCa通道活性可以作为治疗DI的靶点之一。     

Trizol与RNA Fast1000试剂盒提取外周抗凝血总RNA的方法比较

目的比较传统Trizol法和试剂盒法提取血液中总RNA的效果。方法我们将100份人体新鲜血液标本随机分为2组,每组各50份,分别用Trizol法和RNA Fast1000试剂盒法两种方法从外周血中提取RNA测定其纯度和完整性,通过两独立样本的t检验统计分析2组OD值比值数据的差异性。结果试剂盒提取的总RNA的纯度（1.904±0.15）优于传统的Trizol方法（1.727±0.42）。结论与Trizol法相比,试剂盒法具有简便、快速、高纯度等特点,且提取的RNA样品质量较高,可直接用于RT-PCR合成、Northern杂交等分子生物学操作。     

一种椎间盘组织总RNA提取的改良方法

目的改进传统常规法在椎间盘组织中总RNA提取,获得高质量的椎间盘组织总RNA。方法健康成年Newsland白兔,完整取出椎间盘组织,随机分RNA传统方法组和酶消化改良组。传统组,按Trizol法提取总RNA;酶消化改良组,加入0.2%Ⅱ型胶原酶,置于细胞培养箱消化数小时,加入含小牛血清的PBS液终止,离心收集细胞。余步骤同传统组。结果传统组,电泳结果未见28S和18S条带,5S条带部分可见;A260/280比值在1.5左右,蛋白多糖污染重。而酶消化组,电泳结果可见清晰的28S、18S和5S条带,且28S条带的亮度约是18S的两倍;A260/280比值在1.8～2.0之间,无蛋白污染,此法提取的RNA,逆转录后可用于扩增β-actin基因。结论酶消化改良法可望成为椎间盘组织总RNA提取的好方法。RNA片断完整,纯度高,无蛋白污染,不影响后续基因表达（RT-PCR）的分析,并且重复性好,可以推广。     

骨髓间充质干细胞Hey1基因表达水平荧光定量RT-PCR方法的建立

目的:建立骨髓间充质干细胞中Notch信号通路靶基因Hey1表达水平的荧光定量RT-PCR方法.方法:培养骨髓间充质干细胞(C2C12),提取总RNA,验证内参基因β-actin和目的基因Hey1的扩增效率,优化PCR条件,分析扩增曲线、融解曲线,凝胶电泳验证定量PCR产物.结果:内参基因β-actin和目的基因Hey1扩增效率一致(扩增曲线斜率差＜0.1),提示可以使用比较Ct法对Hey1进行相对定量分析;扩增曲线、融解曲线及凝胶电泳结果提示PCR产物特异性好.结论:本研究所建立的用于Hey1基因表达分析的定量RT-PCR检测方法,准确可靠,可用于Bmp9和Notch信号通路的研究.     

β-catenin和表达cyclin—D1在散发性甲状旁腺瘤的

目的研究β-一连环蛋白（β-catenin）及细胞周期蛋白D1（cyclin-D1）在散发性甲状旁腺瘤中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化、荧光定量PCR（RT—PCR）检测20例散发性甲状旁腺瘤、10例甲状旁腺增生、8例正常甲状旁腺组织中β-catenin、cyclin—D1的表达。结果免疫组化显示：β-catenin在正常甲状旁腺组织、甲状旁腺增生及散发性甲状旁腺瘤胞膜中的表达强度呈下降趋势,而在胞质和细胞核内逐渐增强;cyclin-D1在腺瘤组和增生组的表达明显高于正常组（P〈0．05）,而腺瘤组与增生组比较差异无统计学意义（P〉0．05）;β-catenin异常表达与cyclin-D1的高表达在散发性甲状旁腺瘤中存在显著相关性（P〈0．05）。荧光定量PCR分析显示：cyclin—D1mRNA在腺瘤组织和正常甲状旁腺组织中的表达分别为2．36±1．12和1．50±1．03（P〈0．05）,β-cateninmRNA在腺瘤组织和正常甲状旁腺组织中的表达分别为1．02±0．45和0．88±0．56（P〉0．05）。结论β—catenin的异常表达激活cyclin—D1引起细胞增殖和分化失控,可能是散发性甲状旁腺瘤发生机制之一。     

人心房肌蛋白激酶C表达下调参与心房颤动发病机制

目的：研究心房颤动（atrial fibrillation, AF）时心房肌组织中PKCα、δ、ε、θ4种亚型mRNA和PKC总蛋白的表达变化,探讨PKC与AF发生发展的相关性。方法：泸州医学院附属医院行体外循环手术患者常规切除的右心耳组织作为研究对象。①实时定量PCR实验：提取人右心耳组织总RNA,β-actin为内参照基因,采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR技术检测SR和AF患者PKCα、δ、ε、θ基因mRNA水平。②western blotting实验：右心耳组织提取总蛋白,测定蛋白浓度,GAPDH作为内参照,SDS-PAGE电泳检测SR和AF患者PKC的蛋白表达变化。结果：①AF患者心房肌细胞PKCα和PKCδ亚基mRNA水平下调;PKCε和PKCθ亚基mRNA水平明显上调。②SR组与AF组PKC总蛋白相对表达量分别为1.37±0.09（n=23）、1.00±0.10（n=18）,（P〈0.05）有统计学意义。结论：与SR患者相比,AF患者心肌细胞中PKCα、δ亚基mRNA明显下调,PKCε、θ亚基mRNA上调,PKC总蛋白表达降低。 PKC亚型mRNA和总蛋白的表达变化可能是参与AF发生发展的分子基础之一。     

基质金属蛋白酶-3在原发性干燥综合征患者唇腺中的表达

目的：研究基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinases-3,MMP-3）在原发性干燥综合征（primary Sjogren’s syndrome,pSS）患者唇腺组织中的表达情况。方法：收集24例pSS患者和14例对照组的唇腺标本,提取唇腺中总RNA,利用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法扩增MMP-3、β-肌动蛋白（3-actin）的片段,计算MMP-3／β-actin吸光度比值。免疫组织化学染色方法检测MMP-3蛋白在唇腺中的表达情况。结果：pSS组唇腺中MMP-3的mRNA转录及蛋白表达水平均高于对照组（P〈0．05）。MMP-3蛋白主要分布在腺体导管上皮细胞胞浆内。结论：pSS患者唇腺中MMP-3表达增加,可能是唇腺结构破坏的原因之一。     

MDM2与P_(16)在大肠癌中的表达及临床意义

目的探讨鼠双微基因2(MDM2)和多肿瘤抑制基因(P16)在大肠癌中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶(S-P)法,对67例大肠癌、30例癌旁组织、20例腺瘤组织,20例正常黏膜的MDM2和P16基因蛋白进行检测。结果MDM2在大肠癌组织中的阳性表达率为71.7%(48/67),明显高于结肠腺瘤组织、癌旁组织及正常黏膜,差异有显著性意义(P<0.05)。P16在大肠癌组织中的阳性表达率为38.8%(26/67),与结肠腺瘤组织的75%、癌旁组织的83.3%及正常黏膜组织的90%比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。大肠癌组织中,MDM2在不同分化程度中表达差异无显著性意义(P>0.05)。P16在不同分化程度中表达差异有显著性意义(P<0.05),MDM2和P16在不同Dukes分期中有无淋巴转移之间表达,差异有显著性(P<0.05)。MDM2与P16基因蛋白,在不同年龄组、不同性别组中,表达差异无显著性(P>0.05)。在大肠癌中,MDM2蛋白与P16蛋白表达无明显相关性(P>0.05)。结论MDM2和P16的异常表达,与大肠癌的发生发展有关。联合检测MDM2和P16,对大肠癌的临床诊断、治疗和判断预后,有实际意义。     

外周血TREM-1在老年SIRS患者中的表达及其意义

目的检测外周血髓样细胞触发性受体1-（TREM-1）mRNA的表达水平,探讨其在老年全身炎症反应综合征（SIRS）患者中的表达及其意义。方法采用SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR技术,以β-actin为内参照,检测22例老年SIRS患者〔SIRS组,其中多器官功能障碍综合征（MODS组）6例〕和23例健康者（对照组）外周血TREM-1mRNA表达水平。结果 TREM-1和β-actin的熔解曲线均仅有单一峰。SIRS组Ct值（β-actin/TREM-1）为0.930±0.066,正常对照组Ct值为0.846±0.021,2组比较差异具有统计学意义（P〈0.01）;MODS组Ct值为1.006±0.037,与SIRS组比较差异亦有统计学意义（P〈0.05）,显著高于正常对照组（P〈0.01）。结论应用RT-PCR技术检测TREM-1在外周血中的表达水平简便易行,结果稳定可靠。TREM-1可作为SIRS、MODS早期诊断和病情判断的指标,可能成为SIRS、MODS一个潜在的治疗靶点。     

生长分化因子15检测在早期肝癌诊断中的临床意义

目的观察生长分化因子15在早期肝癌患者癌组织与血清中的表达情况,探讨生长分化因子15检测在早期肝癌诊断中的临床意义。方法选择本院手术切除的早期原发性肝癌患者20例,取其肝癌组织标本、癌旁组织标本,及正常人肝穿刺所得正常肝脏标本,提取各组织总RNA,之后采用RT—PCR的方法检测两组标本中生长分化因子15与AFP的表达情况。β—actin为半定量内参。同时采用全自动电化学发光分析仪检测血清中生长分化因子15与AFP的表达情况,选择20例正常人血清作为对照。结果生长分化因子15、AFP在原发性肝癌组织中表达量与正常肝脏组织比较,差异有统计学意义（P〈0．01）,说明原发性肝癌组织中表达明显高于正常肝脏组织。肝癌患者血清中生长分化因子15与AFP的表达存在一致性,均高于正常人（P〈0．01）。结论生长分化因子15存早期肝癌患者癌组织及血清中均高表达,特征与AFP类似,是否成为较敏感的肝癌早期诊断标志需要进一步研究证实。     

肼苯哒嗪对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231雌激素受体α去甲基化的影响

目的探讨肼苯哒嗪对雌激素受体（ER）α阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231ERα基因启动子区CpG岛DNA甲基化的影响。方法体外细胞培养,按药物浓度分为4组：分别用0、5、10、20μmol／L的肼苯哒嗪作用ERa阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231细胞96h;按药物作用时间分为4组：分别于0、72、96、120h10μmol／L肼苯哒嗪作用ERn阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231细胞,倒置光学显微镜下观察肼苯哒嗪对细胞生长的影响。各组提取MDA—MB-231细胞总RNA,用RT-PCR及图像分析检测肼苯哒嗪对MDA—MB-231细胞ERamRNA表达的影响;提取MDA—MB-231细胞基因组DNA,纯化、修饰后用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231ERa基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态。结果与对照组比较,5、10、20μmol／L肼苯哒嗪组ER／β-actin光密度积分值比值均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）;72、96、120h10μmol／L肼苯哒嗪组ER／β-actin光密度积分值比值均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）。5μmol／L肼苯哒嗪作用120h后ERa基因呈部分去甲基化状态,而经10μmol／L肼苯哒嗪作用120h后的ERα基因呈完全去甲基化状态。结论肼苯哒嗪可以逆转ERα阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231ERα基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态,使沉默基因重新表达。     

补肾复方对压力负荷增加大鼠心肌α-MHC和β-MHC基因表达的影响

目的：观察补肾复方对压力负荷增加大鼠心肌α-MHC和β-MHC基因表达的影响,探讨补肾复方逆转心肌肥厚的作用机制。方法：将雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、卡托普利组、补肾复方大剂量组、补肾复方小剂量组。造模4周后,再药物干预4周。采用RT-PCR的方法检测大鼠左室心肌组织中α-MHC、β-MHC基因表达。结果：模型组大鼠左室心肌组织α-MHC mRNA表达较假手术组下降（P〈0.05）,与模型组比较,卡托普利组、补肾复方大剂量组、小剂量组左室心肌组织α-MHC mRNA表达显著升高（P〈0.05,P〈0.01）。模型组大鼠左室心肌组织β-MHC mRNA表达较假手术组升高（P〈0.05）,与模型组比较,卡托普利组、补肾复方大剂量组、小剂量组左室心肌组织β-MHC mRNA表达下降（P〈0.05）。结论：补肾复方可增加α-MHC基因表达,降低β-MHC基因表达,具有逆转心肌肥厚的作用。     

Apelin-13对压力超负荷大鼠心肌纤维化及TGF-β1/Smads信号通路的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白内源性配体-13（Apelin-13）对压力超负荷大鼠心肌纤维化的影响,探讨其可能的影响机制。方法 40只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、模型组（AOB组）、Apelin-13组、阻断剂组（SB431542组）。假手术组游离但不结扎腹主动脉,其余3组于左肾动脉上方0.5 cm处行腹主动脉缩窄术建立压力超负荷模型,3 d后各组给予相应药物干预。4周后取材,计算大鼠心脏指数（H/B）和左心室质量指数（left ventricular mass index,LVMI）;Masson染色光镜下观察心肌组织形态学改变,测算心肌胶原容积分数（collagen volume fraction,CVF）;ELISA法测定血清转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）浓度;Western-blotting检测TGF-β1及Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维的蛋白表达量;RT-PCR检测心肌组织Smad3 mRNA、Smad7 mRNA的表达水平。结果 与Sham组相比,AOB组大鼠H/B、LVMI、CVF、血清TGF-β1均明显升高（P〈0.05）,心肌组织TGF-β1、Ⅰ型胶原纤维、Ⅲ型胶原纤维及Smad3mRNA表达水平亦显著升高（P〈0.05）;与AOB组相比,Apelin-13和SB431542干预组上述指标均明显下调（P〈0.05）。Smad7 mRNA在各组间的表达呈相反趋势。结论 Apelin-13可通过部分抑制TGF-β1/Smads通路以减轻压力超负荷大鼠心肌纤维化。     

肾上腺皮质腺瘤及嗜铬细胞瘤组织中NF-κB与iNOS蛋白表达水平研究

目的探讨核转录因子κB与诱导型一氧化氮合酶在人肾上腺皮质腺瘤及嗜铬细胞瘤组织中的表达差异。方法采用免疫组织化学两步法检测13例肾上腺皮质腺瘤及15例嗜铬细胞瘤组织标本中NF-κB与iNOS蛋白的表达,以染色后阳性细胞百分比来评价表达强度,并进行统计学分析。结果人肾上腺皮质腺瘤及嗜铬细胞瘤组织中NF-κB与iNOS蛋白水平明显高于正常组（P均〈0.05）;嗜铬细胞瘤组中NF-κB与iNOS蛋白水平明显高于肾上腺皮质腺瘤组（P〈0.05）,各组中NF-κB与iNOS蛋白之间的表达呈正相关（P〈0.05）。结论人肾上腺皮质腺瘤和嗜铬细胞瘤组织中,高表达的NF-κB和iNOS与其发生发展密切相关;在肾上腺皮质腺瘤及嗜铬细胞瘤组织间,NF-κB与iNOS蛋白表达有显著差异,提示肾上腺腺瘤和嗜铬细胞瘤在发病机制中可能有着本质差别;而NF-κB的活化与iNOS的表达,在发病过程中相互作用、相互制约。