Dispermic chimerism identified during blood group determination and HLA typing

BACKGROUND: Chimerism is the presence of two or more genetically distinct cell populations in one organism. STUDY DESIGN AND METHODS: We report the identification of dispermic chimerism in a 19-year-old female volunteer blood donor. During routine ABO blood grouping strong reactions of the blood donors red blood cells (RBCs) with anti-A reagents and mixed-field reactions with anti-B reagents were observed, while serum-testing showed the absence of anti-A and anti-B antibodies. AB0 blood group genotyping, HLA-typing and microsatellite analysis were performed using blood-samples, buccal mucosa and fibroblasts of the blood-donor and blood-samples of her parents. RESULTS: AB0 blood group genotyping showed three ABO blood group alleles (0(1), A(2) and B) in the DNA-samples of the blood-donor. The evidence of chimerism was supported by the detection of three alleles for the HLA-A and HLA-DRB1 loci. Microsatellite analysis with ten markers revealed three alleles for loci D7S821 and D19S412. All studies carried out, the third allele was always of paternal origin. CONCLISION: The results suggested a case of a human dispermic chimerism. Our proposed explanation for the development of chimerism in the reported case is the fertilization of an oocyte and the corresponding second polar body by two different sperms.     

Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation.

Hematopoietic chimerism is a measure of the number of donor and recipient cells in the host following stem cell transplantation (SCT). The type of conditioning therapy prior to SCT has a major impact on the chimeric status in the recipient. Different techniques of measurement have varying sensitivities. The use of polymerase chain reaction (PCR) of short tandem repeats (STR) using fluorescent amplification permits quantification using Genescan analysis. When SCT is used for malignant haematological disorders, measurement of chimeric status may indicate early relapse and in aplastic anemia graft rejection. Reduced intensity or T-cell depletion is associated with mixed haemopoietic chimerism. SCT for benign haematological disorders does not require complete donor chimerism for a successful outcome.     

脐血造血干细胞移植的产前HLA配型研究

在脐血造血干细胞移植治疗重型β-地中海贫血患儿时,我们运用产前胎血进行HLA-Ⅰ、Ⅱ类血清学配型及HLA-Ⅱ类基因分型,以确定其是否为移植的合适供者。应用此法对11个家系进行了检测,结果发现其产前和产后的配型结果完全一致。依据此研究结果可以认为,HLA产前配型是用于脐血造血干细胞移植的一种可靠的、经济的方法。     

HLA typing and transplantation

Clinical trial of organ transplantation was renal transplantation by Voronoy at 1936. The discovery of HLA in the 1950s was one of the most important new findings in the area of transplantation. Nowadays, developing HLA genotyping methods, the serum analysis does not use for donor and recipient HLA typing but for cross-matching test. Because each of HLA genotyping methods has its merits and demerits, it is important to choice right methods for avoiding type error. PCR-Luminex method using fluorescence microsphere was developed for high-resolution HLA-A, HLA-B and HLA-DRB1 genotyping in the Japanese population. This genotyping method allows to define all the possible combinations of alleles at each loci existing in Japanese at the four-digital level. In hematopoietic stem cell transplantation, to match high resolution level of HLA between donor and recipient lead an improvement of recipient's survival. In organ transplantation, removed organ has to be so immediately transplanted into recipient that no time is left for HLA genotyping. In order to have good survival of transplanted organ, HLA, cytokine promoter lesion and immunoglobulin like receptor genotyping might be helpful. We focused on this review at HLA genotyping, especially new SSO methods.     

单倍体相合异基因造血干细胞移植治疗白血病

背景:对于无HLA全相合同胞供者的患者,采用单倍体相合造血干细胞移植面临移植物抗宿主病重、移植相关死亡率高的风险,但通过不同的移植模式,将有可能获取相近的疗效。目的:观察亲缘HLA单倍体相合异基因造血干细胞移植治疗白血病的疗效,并与亲缘HLA全相合异基因造血干细胞移植相比较。方法:45例白血病患者分为2组。单倍体组移植方式为外周血或联合骨髓干细胞移植,预处理方案为改良白消安与环磷酰胺或加抗胸腺细胞球蛋白,移植物抗宿主病的预防采用环孢素A+甲氨蝶呤+霉酚酸脂;全相合组移植方式为外周血干细胞移植,预处理方案为BuCY,移植物抗宿主病的预防采用环孢素A+甲氨蝶呤。结果与结论:两组均获得造血重建时间差异无显著性意义。单倍体及全相合组急性移植物抗宿主病的累积发病率分别为73%对52%(P>0.05);慢性移植物抗宿主病的累积发病率分别为56%对45%(P>0.05);移植相关死亡率分别为36%对17%(P>0.05);单倍体组无复发,全相合组复发2例;两组的预计3年累积无病生存率分别为61%对60%(P>0.05)。结果提示,亲缘单倍体异基因造血干细胞移植的总体疗效与亲缘全相合异基因造血干细胞移植相似,但中重度急性移植物抗宿主病的发生率较后者为高。     

单倍体相合异基因造血干细胞移植治疗白血病

背景：对于无HLA全相合同胞供者的患者,采用单倍体相合造血干细胞移植面临移植物抗宿主病重、移植相关死亡率高的风险,但通过不同的移植模式,将有可能获取相近的疗效。目的：观察亲缘HLA单倍体相合异基因造血干细胞移植治疗白血病的疗效,并与亲缘HLA全相合异基因造血干细胞移植相比较。方法：45例白血病患者分为2组。单倍体组移植方式为外周血或联合骨髓干细胞移植,预处理方案为改良白消安与环磷酰胺或加抗胸腺细胞球蛋白,移植物抗宿主病的预防采用环孢素A＋甲氨蝶呤＋霉酚酸脂;全相合组移植方式为外周血干细胞移植,预处理方案为BuCY,移植物抗宿主病的预防采用环孢素A＋甲氨蝶呤。结果与结论：两组均获得造血重建时间差异无显著性意义。单倍体及全相合组急性移植物抗宿主病的累积发病率分别为73%对52%（P〉0.05）;慢性移植物抗宿主病的累积发病率分别为56%对45%（P〉0.05）;移植相关死亡率分别为36%对17%（P〉0.05）;单倍体组无复发,全相合组复发2例;两组的预计3年累积无病生存率分别为61%对60%（P〉0.05）。结果提示,亲缘单倍体异基因造血干细胞移植的总体疗效与亲缘全相合异基因造血干细胞移植相似,但中重度急性移植物抗宿主病的发生率较后者为高。     

同种异基因造血干细胞移植后基于血细胞嵌合状态的个体化免疫治疗

目的:研究同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后血细胞嵌合率变化与复发的关系;观察根据血细胞嵌合率变化给予个体化免疫抑制剂治疗和供者淋巴细胞输注(DLI)的疗效。方法:106例供者细胞顺利植入的allo-HSCT患者,采用聚合酶链反应(PCR)扩增短串联重复序列的方法,动态检测移植后T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞的嵌合率。根据血细胞嵌合率的变化调整免疫抑制剂剂量和DLI的使用。结果:6例患者在移植后2个月,供者T细胞嵌合状态一直为混合嵌合(MC),将免疫抑制剂减量后均达到完全供者嵌合(FDC)。12例患者在移植后1～5个月,发生供者T细胞嵌合率下降,予免疫抑制剂减量后转为FDC。24例患者血液学复发或髓外复发(进展),有6例在复发前共发生10例次血细胞嵌合率下降,经免疫抑制剂减量或停药后一度回升至FDC,但最终血液学或髓外复发。12例患者在复发或疾病进展后停用免疫抑制剂,共给予DLI23例次,其中8例在DLI前或后给予化疗,最终5例再次达到完全缓解,其余患者最终均因疾病复发死亡。Ⅱ度及Ⅱ度以上急性移植物抗宿主病(GVHD)发生率为28.3%。慢性GVHD发生率为55.7%。中位随访期为17(1.5～90.0)个月,无病生存65例,死亡41例。67例标危患者预期3年生存率为59.0%;39例高危患者预期3年生存率为44.7%。结论:T淋巴细胞、NK细胞和B淋巴细胞的嵌合状态可作为血液恶性肿瘤复发的预测指标;基于血细胞嵌合率的个体化免疫治疗可以推迟甚至避免临床复发,且不增加急性GVHD的发生。     

异基因造血干细胞移植后细胞嵌合状态动态监测的临床意义

目的 研究异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后各系细胞嵌合状态与移植物植入、急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物被排斥和疾病复发的关系.方法 对65例患者进行allo-HSCT,在移植后定期采集所有患者的外周血和骨髓.用流式细胞术分选了65例患者的CD3+T淋巴细胞,52例分选了CD3-CD56+CD16+NK细胞,32例分选了CD15+粒细胞,20例分选了CD19+B淋巴细胞.进行PCR扩增短串联重复序列检测各系细胞嵌合状态.结果 移植后NK细胞早期植入比例(55.5%)最高,T细胞最晚(+21 d)达到完全供者嵌合状态.+7 d T淋巴细胞供者嵌合比例(DC)≥70%和+14 d T淋巴细胞DC≥95%属aGVHD发生的高危患者.除急性淋巴细胞白血病外,出现移植物被排斥的分子生物学征象者和疾病复发者,都以T淋巴细胞供者嵌合状态下降为主.在过继免疫治疗中,动态检测嵌合状态可以判断疗效和指导进一步的治疗.结论 allo-HSCT后T淋巴细胞嵌合状态动态检测可以早期预测发生aGVHD的高危患者、判断移植物植入、发现移植物被排斥和疾病复发并指导免疫调节治疗的时机和疗效.     

单细胞PCR用于HLA配型的研究

目的研究用筑巢式多重PCR技术对单细胞进行HLA配型，分析影响单细胞PCR扩增的因素。方法首先分别采用不同的细胞裂解方法制备单细胞DNA模板，然后采用多重PCR分别扩增HLA—A，B基因的第2、3外显子和第2内含子区域，HLA—DRB1基因的第2外显子区域，最后根据大量DNA的常规HLA分型结果对单细胞第1轮扩增产物进行第2轮筑巢式序列特异性引物PCR（PCR-SSP）分型。结果酶解法制备单细胞DNA模板效率最高，第1轮扩增成功率为93．3％，而碱裂法和冻融法分别为83．3％和73．3％；采用酶解法制备单细胞DNA模板进行第2轮PCR—SSP分型验证，20份标本扩增成功率为95％，有3份标本只扩增出一条染色体，等位基因脱扣发生率为15％，全部操作可在6h内完成。结论筑巢式多重PCR技术对单细胞HLA分型具有较高的扩增效率，操作时间短，可望应用于妊娠前诊断。     

Real-time biallelic polymorphism-polymerase chain reaction for chimerism monitoring of hematopoietic stem cell transplantation relapsed patients

BackgroundAn accurate analysis of chimerism kinetics permits early detection of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) in patients with high risks of graft-versus-host disease or those liable to relapse. Although short tandem repeats-PCR (STR-PCR) is the golden standard for quantitative chimerism analysis in most of the clinical laboratories, it has a relatively low sensitivity of 5% and the detection of low percentage in mixed chimerism is usually delayed. In this study, we developed a real-time PCR for chimerism analysis based on the informative biallelic polymorphisms (BP).MethodsThe allele frequencies of 19 selective biallelic polymorphic markers were analyzed using the genomic DNA from 100 healthy Taiwanese volunteers. The informative biallelic polymorphic markers with high discrimination power in the Taiwanese population were identified. The TaqMan probe-based real-time BP-PCR for amplification of the informative loci was designed and the detection sensitivity was determined. Clinical application of real-time BP-PCR in chimerism monitoring was evaluated and was compared with the conventional STR-PCR by analyzing the DNA samples obtained at different time points post-HSCT from 4 relapsed and 10 non-relapsed patients.ResultsAllele distribution analysis revealed that the loci of S01a, S03, S04a, S05b, S06, S07b, S08b, S09b, S10b and S11a had a relatively high discrimination power and were the informative BP for chimerism monitoring in the Taiwanese population. Real-time BP-PCRs for these 10 BP loci were set up with the detection sensitivity equivalent to 0.003–0.006%. Real-time BP-PCR of the 4 HSCT patients revealed the presence of recipient-specific DNA at early time point than STR-PCR for 3 of the patients, whereas real-time BP-PCR was as effective as STR-PCR in uncovering the sign of relapse for one of the patients. In addition, the baseline value for the patients with no sign of relapse was 0.127 ± 0.193% of recipient DNA.ConclusionWe conclude that real-time BP-PCR is a sensitive and reliable method for chimerism monitoring and is superior to the STR-PCR in identifying patients who are at high risk for relapse after transplantation.     

人类白细胞抗原（HLA）基因分型在造血干细胞移植中的应用

目的提高造血干细胞移植供、受者HLA配型的精确度，有效防止移植物抗宿主病Graft—vs host disease（GVHD）的发生。方法采用准确、简便的DNA提取方法和PCR—SSP基因分型方法。建立HLA—A，B，DR基因分型方法。结果对167例临床标本进行基因水平的研究发现。DNA提取方法可以满足此项研究对样本的要求。HLAPCR—SSP基因分型方法具有良好的稳定性、可靠性和特异性。结论HLA基因分型方法准确、特异、重复性好．可作为临床造血干细胞移植配型和正常人群无关供者筛选的常规方法。对（GVHD）的发生必将起到重要的预防作用。     

人类白细胞抗原(HLA)基因分型在造血干细胞移植中的应用

目的提高造血干细胞移植供、受者HLA配型的精确度，有效防止移植物抗宿主病Graft—vs host disease（GVHD）的发生。方法采用准确、简便的DNA提取方法和PCR—SSP基因分型方法。建立HLA—A，B，DR基因分型方法。结果对167例临床标本进行基因水平的研究发现。DNA提取方法可以满足此项研究对样本的要求。HLAPCR—SSP基因分型方法具有良好的稳定性、可靠性和特异性。结论HLA基因分型方法准确、特异、重复性好．可作为临床造血干细胞移植配型和正常人群无关供者筛选的常规方法。对（GVHD）的发生必将起到重要的预防作用。     

一种基于单核苷酸多态性位点的定量检测异基因造血干细胞移植后嵌合率的新方法

目的 建立一种单核苷酸多态性-聚合酶链反应(SNP-PCR)定量检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的新方法 ,探讨其可行性、准确性及优越性.方法 利用18个SNP位点筛选移植前每一对供、受者,采用实时定量PCR(RQ-PCR)对筛选出的差异位点行嵌合率定量分析,通过倍比稀释、模拟嵌合与微卫星重复序列-PCR(STR-PCR)、性染色体双色荧光原位杂交(XY-FISH)和融合基因的定量检测,比较、验证方法 的准确性及敏感度.结果①利用内参质粒标准品扩增的17次标准曲线,平均斜率为-3.39,平均截距为39.97,相关系数均＞0.995,扩增效率接近理想水平;批内差及批间差分别为0.50%和1.10%,在可控范围;与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上;可重复敏感度达0.01%.②40例移植患者中,95%以上可以筛选出供、受者差异SNP位点;SNP-PCR与STR-PCR结果吻合率达96.7%,与XY-FISH结果比较差异无统计学意义(P＞0.05);SNP-PCR与特定白血病融合基因检测结果比较,完全嵌合(CC)标本均未检出肿瘤相关的融合基因,部分嵌合(MC)标本融合基因均为阳性.结论 SNP-PCR检测嵌合率准确、敏感、易行,具有极高的临床应用前景,克服了STR-PCR竞争抑制及扩增平台期偏倚的缺点,可以替代其进行临床常规检测.     

嵌合体的动态定量检测在异基因造血干细胞移植中的应用

目的　建立荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列 (STR PCR)结合毛细管电泳 ,定量检测供体细胞 (DC)嵌合率的方法 ,并探讨该方法的连续定量检测对异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后转归的预警作用。方法　采集 31例接受骨髓移植 (BMT)或非清髓外周血干细胞移植 (NST)患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓。DNA样本用ProfilerPlus商品化试剂盒扩增后 ,用ABI 310遗传分析仪进行毛细管电泳 ,确定基因位点及峰面积 ,根据供受体基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果　 31例患者中 15例 (48.4 % )为性别相合移植 ,只能通过STR PCR进行嵌合体的定量分析 ;性别不合移植患者用STR PCR和荧光原位杂交两种方法定量测得的DC嵌合率一致 ;31对供受体中能区别出供受差别的STR位点有 6 .7(2～ 10 )个 ,所有患者均在移植后 7天 ( 7天 )出现供体来源的细胞 ,BMT组 7天、 14天和 1个月DC中位数均明显低于NST组 ,而在移植中后期无显著性差异。 2 1天时BMT和NST患者均达稳定嵌合 ,DC在 92 %以上 ;中位随访 17(3.5～ 2 9.0 )个月 ,2 6例患者DC≥90 % ,均获得持久植入 ,至今均为无白血病生存。另有 5例患者出现不稳定混合嵌合 (MC)状态 (DC为2 7.3%～ 6 2 .7% ) ,其中 4例复发 ,1例出现移植物被排斥。上述 5例患者均     

红细胞嵌合体定量检测及在异基因造血干细胞移植中的应用

摘要：目的：建立流式细胞术（FCM）定量检测不同ABO抗原红细胞嵌合体方法,探讨其在异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）中的应用。 方法：选取标准A、B和O型RBC在体外按不同的比例两两混合（嵌合体）,采用FCM对5例allo-HSCT患者于术前及术后7、15、30、45、60和90 d体内RBC的嵌合体进行相对计数,计算其供体细胞的嵌合率。 结果：体外混合的RBC嵌合体FCM测定值与理论值无显著性差异（P>0.05）。5例患者移植后7 d均能检测到供体细胞,其中3例患者移植后90 d达到完全嵌合状态（FDC）,1例患者移植后30 d,供体细胞的嵌合率为8.9%,移植后40 d疾病复发而死亡,另1例患者供体细胞的嵌合率由移植后60 d的86.5%下降至90 d的23.7%,死于严重感染。 结论：FCM能定量检测不同ABO抗原的RBC嵌合体,可应用于临床alloHSCT后RBC嵌合体的动态监测。     

异基因造血干细胞移植后嵌合状态与白血病复发关系的研究

目的 探讨异基因造血干细胞移植（allo HSCT）后嵌合状态与白血病复发的关系。方法 回顾性分析2014年1月至2018年6月于我院行清髓性allo HSCT的成人白血病患者73例,采用短串联重复序列 聚合酶链反应（STR PCR）检测移植后+30、+60、+90天受者骨髓的供受者细胞嵌合率,分析嵌合率与复发的关系。结果 移植后+90天复发组嵌合率低于非复发组。移植后+60 d、+90 d低嵌合患者有较高的复发率（P=0.021,0.027）。多因素分析显示移植前疾病状态、+60d嵌合率、+90d嵌合率是白血病患者行allo HSCT后复发的独立危险因素。结论 Allo HSCT后嵌合状态对复发具有预测价值,+60、+90天低嵌合患者有较高的复发率。     

国内首对同一父母来源HLA相同的人胚胎干细胞系的建立

目的:建立国内首对同父母来源的人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)系,为干细胞的定向诱导分化提供内参对照模型。方法:利用体外受精后第3天不适宜进行胚胎移植的低质量胚胎,采用机械切割法分离囊胚内细胞团(ICM),接种到丝裂霉素C处理的小鼠饲养层上,对建立的hESC进行多能性潜能检测。结果:成功建立一对具有多能特性的hESC系,体外长期培养维持正常核型,STR显示较高的亲缘性,HLA配型完全相同。结论:本研究建立了国内首对同一父母来源的HLA完全相同的hESC,其遗传背景一致,这为细胞的定向诱导分化体系筛选提供一个很好的内参对照,同时也为干细胞的移植排斥反应、培养扩增等研究提供很好的对比参照模型。