氟尿嘧啶对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响

目的观察氟尿嘧啶（5-FU）对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响。方法用不同药物浓度的5-FU处理SW480细胞,用CCK8法检测5-FU在SW480中的IC50,流式细胞仪检测SW480细胞ABCG2的阳性表达率．RT—PCR检测ABCG2的mRNA在SW480细胞中的表达差异。结果5-FU对SW480细胞的IC50随着药物浓度的增加而升高（P〈0．05）。流式细胞仪检测发现,正常SW480细胞（A组）中ABCG2阳性表达率为（6．26±0．86）％;在药物处理48h后即刻检测时（B组）的阳性表达率下降至（3．43±1．18）％（P〈0．05）;在药物处理48h后的第2代细胞检测时（c组）则升高至（12．91±3．42）％（P〈0.05）。3组ABCG2mRNA表达趋势与流式细胞仪检测结果的趋势一致。结论不同浓度的5-FU可以影响人结肠癌SW480细胞ABCG2的表达。     

pcDNA3.1(+)-ABCG2真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人的ABCG2基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中表达.方法 以人的癌细胞为材料提取RNA,经反转录得到cDNA,利用PCR方法,根据人ABCG2基因62526032(NM_004827.2)序列信息设计引物,扩增ABCG2基因的CDS序列,将其克隆到pcDNA3.1+表达载体中.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中.采用Western blot法检测外源基因ABCG2的表达.结果 PCR扩增片段大小与理论片段大小相符,酶切大小与理论大小相符,阳性的克隆测序鉴定正确,表明人ABCG2基因克隆及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2构建成功.在蛋白水平,转染72h后的细胞中外源基因ABCG2表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中进行了表达.     

肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药模型的建立及其耐药机制

目的 建立肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药细胞株并探讨其耐药机制.方法 通过阿霉素浓度递增筛选出SMC7721/ADM肝癌多药耐药细胞株并建立裸鼠移植瘤模型;噻唑蓝(MTr)检测各组移植瘤对化疗药物的耐药性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测MDR1和BCRP在各组移植瘤中的表达.结果 SMC7721/ADM对阿霉素,丝裂霉素,5-Fu的耐药性均较亲本细胞明显降低(P<0.01);其移植瘤对3种化疗药物的IC50.均明显低于亲本细胞(P<0.05);SMC7721/ADM细胞中MDR1 mRNA表达是亲本细胞的40.13倍(P<0.01);BCRP mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05).其移植瘤中BCRP mRNA表达是亲本细胞移植瘤的3.69倍(P<0.01);而MDR1 mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05);SMC7721/ADM细胞株中两种蛋白表达显著高于亲本细胞株(P<0.01);SMC7721/ADM移植瘤中BCRP蛋白表达显著高于亲本移植瘤(P<0.01),而两者中MDR1表达差异无统计学意义(JP>0.05).结论 MDR1和BCRP在SMC7721/ADM多药耐药的不同阶段起作用并介导肝细胞癌对不同药物的耐药性.     

CD133作为肝癌干细胞表面标记的初步研究

目的 研究人肝癌SMMC7721和bcl-7402细胞株中CD133的表达,探讨CD133作为肝癌干细胞表面标记的可能性.方法 采用流式细胞仪检测SMMC7721和bcl-7402细胞株中CD133的表达;免疫磁珠细胞技术分离SMMC7721和bcl-7402细胞株中CD133阳性和CD 133阴性细胞,检测其细胞周期,观察并采用单因素方差分析和u检验分析体外培养过程中CD133阳性和CD133阴性细胞的细胞形态、增殖和分化能力的差异.结果 CD133阳性细胞在SMMC7721和bcl-7402细胞株中所占比例分别为0.7%～1.0%、1.7%～8.9%;流式细胞仪检测显示两种细胞株中处于G0/G1期的CD133阳性细胞分别为85.3%、89.4%,明显高于CD133阴性细胞和未分选细胞(F=14.49,38.84,P<0.05);CD133阳性细胞体外增殖能力强于相同条件下CD133阴性细胞和未分选细胞,在1～3 d和5～7 d曲线变化更明显(F=49.32,784.04,89.91,152.83,P<0.05);体外培养过程中,CD133阳性细胞的比例逐日下降,至扩增的第15天,与未分选细胞含量相似(u=0.271,P<0.05).结论 人肝癌SMMC7721和bcl-7402细胞株中,CD133阳性细胞体外增殖和分化能力较强,CD133是肝癌干细胞的表面标记之一.     

多种人结肠癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株的建立及耐药机制初步研究

目的:通过建立多种5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的人结肠癌细胞株,探讨耐药的结肠癌细胞的生物学特性与耐药机制。方法:选用人结肠癌HT-29、LoVo和SW480细胞,通过高浓度5-FU反复接触结合药物浓度递增法建立耐药株HT-29/5-FU、LoVo/5-FU和SW480/5-FU。不同浓度5-FU作用所建立的耐药细胞株及其亲本细胞后,分别用MTT法、流式细胞术、qRT-PCR、Westernblot检测细胞对5-FU的敏感性、周期分布、耐药相关分子[P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、ATP结合盒超家族G成员2(ABCG2)]及第十号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)与蛋白激酶B(Akt)的mRNA和蛋白的表达,并用Akt活性检测试剂盒检测细胞Akt活性。结果:与各自的亲本细胞比较,构建的HT-29/5-FU、LoVo/5-FU和SW480/5-FU对5-FU的IC50均明显升高(均P0.05),耐药指数分别为7.213、5.849和15.940。随着5-FU处理浓度的升高,亲本细胞和耐药细胞G0/G1期细胞数量均明显增加(均P0.05),但同一浓度5-FU处理下,各耐药株G0/G1期细胞数量均明显少于其对应亲本株(均P0.05)。与各自的亲本细胞比较,对应耐药株的P-gp、MRP1、ABCG2、Akt的mRNA和蛋白表达水平均明显升高,而PTEN表达均明显降低(均P0.05),且Akt活性均明显提高(均P0.05)。结论:成功建立了结肠癌5-FU耐药细胞株,其耐药机制可能与PTEN下调所致的PI3K/Akt降低PI3K/Akt通路活化有关。     

边缘群细胞在肝癌耐药中的作用及其机制

目的 观察肝癌细胞株Li-7中边缘群在肝癌耐药中的作用,并分析其可能机制.方法 流式细胞术分选边缘群和主群细胞后,MTS法比较阿霉素作用下两亚群细胞增殖能力,流式分析ABCG2/BCRP表达,观察边缘群细胞的耐药作用.利用P13K抑制剂LY294002,分析Akt信号通路对边缘群细胞表型及耐药现象的作用.结果 边缘群细胞占Li-7细胞总数(2.07±0.22)%,阿霉素作用后其增殖能力高于主群细胞,吸光度值第9天(0.33±0.06比0.05±0.02,P<0.05),第12天(0.58±0.09比0.04±0.02,P<0.01),ABCG2/BCRP荧光强度高于主群细胞(212.72±21.01比96.36±18.36,P<0.05).LY294002作用后,边缘群细胞比例降至(0.96±0.21)%,阿霉素作用后细胞存活率由(64.93±6.96)%降至(38.73±5.25)%(P<0.01).结论 Li-7细胞边缘群耐药性较强,其机制与有功能的ABCG2/BCRP及Akt信号通路有关.     

人甲胎蛋白增强子驱动自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷自杀基因系统体内外靶向杀伤肝癌细胞的效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒;利用脂质体将质粒转染入AFP阳性肝癌细胞株HcpG2和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721;采用RT-PCR和Western blot检测TK mRNA和蛋白表达;MTT检测细胞的存活率;观察丙氧鸟苷对肝癌细胞体外增殖、生长曲线和细胞凋亡的作用,以及丙氧鸟苷体内抑制肿瘤生长的效应.采用t检验分析相关数据.结果 成功构建pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒并转染入肝癌细胞;AFP阳性肝癌细胞株HepG2中能检测到TKmRNA和蛋白表达;丙氧鸟苷呈剂量和时间依赖性抑制转染后肝癌细胞株HepG2的生长并诱导其凋亡;AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721中没有TKmRNA和蛋白表达,细胞增殖、生长曲线和凋亡均不受影响,两者比较,差异有统计学意义(t=2.58,2.73,3.12,P＜0.05).丙氧鸟苷可以特异性地抑制转染后肝癌细胞株HepG2治疗组中肿瘤的生长,肿瘤抑制率为46%,而在转染后肝癌细胞株SMMC7721治疗组中,对肿瘤生长无明显抑制作用,两者比较,差异有统计学意义(t=3.36,P＜0.05).结论 人AFP增强子驱动的HSV-TK/丙氧鸟苷自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞,抑制肿瘤生长.     

中药复方肝癌-1号逆转肝癌多药耐药的实验研究

目的分析中药复方肝癌-1号逆转阿霉素(ADM)诱导的HepG2/ADM细胞的多药耐药性的机制。方法以亲本细胞HepG2为对照,MTT法观察肝癌-1号对HepG2/ADM细胞的毒性作用;流式细胞仪检测肝癌-1号作用后细胞表面p-糖蛋白(P-gp)表达阳性率;逆转录聚合酶链式反应检查多药耐药基因(MDR1)mRNA表达水平;MTT法观察肝癌-1号处理后的HepG2/ADM细胞对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶耐药的逆转作用。结果肝癌-1号<50μmol/L对HepG2/ADM细胞无明显毒性,半数抑制率(IC50)为75μmol/L;50μmol/L的肝癌-1号可部分抑制HepG2/ADM细胞P-gp合成及MDR1 mRNA的表达,可逆转HepG2/ADM的耐药性,对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶的逆转倍数分别为3.94(P<0.01),1.72(P<0.05),1.67(P<0.05)。结论肝癌-1号通过抑制HepG2/ADM耐药细胞MDR1 mRNA的表达及P-gp合成,能部分逆转HepG2/ADM的耐药性。     

肝癌SMMC-7721细胞中侧群细胞干细胞标记的表达

目的 分选肝癌细胞株SMMC-7721中的侧群(SP)细胞,并分析其干细胞标记的表达.方法 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将SMMC-7721细胞分为SP细胞和非侧群(NSP)细胞两个亚群,以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术和流式细胞术对两个亚群细胞干细胞标记mRNA和蛋白表达进行分析.结果 SMMC-7721细胞株中分选出的SP细胞比例为(9.2±0.2)%.SP细胞ABCG2、CD133、Oct4、Sox2和NANOG等干细胞标记mRNA的表达水平分别是NSP细胞的7.132倍、4.985倍、8.642倍、5.095倍和5.164倍,差异均有统计学意义(P＜0.01);ABCG2、CD133、Oct4、Sox2和NANOG蛋白在肝癌SP细胞中的含量分别为(92.65±3.92)%、(12.75±1.62)%、(17.35±2.31)%、(9.57±1.71)%和(28.39±5.28)%,在NSP细胞中的含量分别为(0.26±0.06)%、(2.51±0.17)%、(1.74±0.38)%、(1.52±0.41)%和(3.37±1.02)%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 肝癌SMMC-7721细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞,联合应用多种干细胞标记筛选肝癌SP细胞可能会获得纯化的肝癌干细胞.

Abstract：

Objective To study the expression of stem cell markers in side population cells sorted from SMMC-7721 cell line. Methods Fluorescence-activated cell sorting (FACS) was used to sort side population (SP) cells and non-SP (NSP) cells from SMMC-7721 cell line. Real-time polymerase chain reaction (PCR) and flow cytometry (FCM) were used to evaluate the expression of several stem cell markers such as ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG in SP cells and NSP cells. Results FACS analysis indicated that (9.2 ±0. 2)% of the SMMC-7721 cells were SP cells. Real-time PCR analysis suggested that ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG were expressed in the SP cells at higher levels than the NSP cells by about 7. 132, 4. 985, 8. 642, 5.095 and 5. 164 folds, respectively ( P ＜0. 01 ). FCM analysis revealed that the expression of ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG proteins in SP cells was (92. 65 ±3.92)%, (12.75 ±1.62)%, (17.35 ±2.31)%, (9.57 ± 1.71)% and (28.39 ±5.28)% respectively,while in NSP cells that was (0. 26 ±0. 06)%, (2. 51 ±0. 17)%, ( 1.74 ±0. 38)%, ( 1.52 ±0. 41 )% and ( 3.37 ± 1.02) % respectively ( P ＜ 0. 01 ). Conclusion The SP cells sorted from SMMC-7721 cell line may enrich tumor stem cells. Purified liver cancer stem cells may be obtained by screening SP cells using a variety of stem cell markers.     

CD326在乳腺癌细胞系的表达及其与乳腺癌细胞耐药的关系

目的 探讨上皮细胞黏附分子(CD326)在乳腺癌细胞系中的表达及其与乳腺癌细胞耐药的关系.方法 流式细胞仪分析MCF-7、MCF-7/ADR及MDA-MB-231中cD326表达情况;细胞计数法(CCK-8法)检测流式细胞仪分选获得的CD326阳性和阴性细胞亚群体外对表阿霉素、多西他赛耐药情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同细胞亚群中多药耐药基因(MDR1)及乳腺相关耐药基因(BCRP)的表达情况.结果 MCF-7/ADR中CD326的表达(31.03%)明显高于亲本株MCF-7(27.02%),MDA-MB-231中CD326的表达(33.43%)明显高于MCF-7及MCF-7/ADR;MCF-7和MDA-MB-231中CD326阳性细胞亚群对表阿霉素及低浓度多西他赛(0.25～1.0*IC50)的体外耐受性明显高于阴性细胞亚群(P＜0.01),但对高浓度多西他赛(1.5～2.0* IC50)的体外耐受性差异无统计学意义(P＞0.05);CD326阳性与阴性细胞亚群间MDR1、BCRP基因表达差异元统计学意义(P＞0.05).结论 CD326与乳腺癌化疗药物的耐药有关,其诱导耐药并不是通过经典的耐药途径.     

胰腺癌细胞对5氟脲嘧啶和健择的获得性耐药机制的研究

目的探讨胰腺癌细胞对 5氟脲嘧啶 (5 FU)和健择产生获得性耐药的机制。方法用磺酰罗丹明B蛋白染色法检测细胞毒性作用 ,根据药物剂量与细胞生存的关系计算 5 0 %抑制浓度(IC50 ) ;用RNA酶保护分析和Westernblot法来检测Bcl xL和mcl 1的表达水平。结果 5 FU和健择对 3株胰腺癌细胞均产生了细胞毒性作用。 5 FU长期作用后 ,Capan 1细胞IC50 上升了 2 1倍 (P <0 0 5 ) ;健择长期作用后 ,Capan 1细胞IC50 上升了 1 8倍 (P <0 0 5 ) ;而Mia Paca 2细胞在 5 FU和健择作用前后IC50 明显降低 (P <0 0 5 )。产生获得性耐药细胞的Bcl xL 和mcl 1的表达均上调。结论胰腺癌细胞对 5 FU相对耐药 ,而对健择较为敏感。化疗药物长期作用后 ,抑凋亡基因Bcl xL和mcl 1的表达上调 ,胰腺癌细胞产生了获得性耐药。     

ABCG5和ABCG8在肝细胞胆固醇转运中的作用

目的验证ABCG5和ABCG8在胆固醇转运中的作用。方法通过脂质体介导将含ABCG5或ABCG5和ABCG8的质粒导人7721细胞系，通过抗生素G418、zeocin筛选获得新的细胞系7721-G5与7721-DG。用RT-PCR及Western blot等方法证明细胞系7721-G5与7721-DG中分别含有ABCG5，ABCG5和ABCG8。7721、7721-G5、7721-DG细胞系分别用[^3H]标记的胆固醇、游离胆固醇、卵磷脂、无脂血清作用使细胞内胆固醇饱和，随后用牛磺胆酸钠／卵磷脂受体系统进行胆固醇外运实验。每60min测定培养液中[^3H]标记的胆固醇含量，计算外运的胆固醇数量。结果研究发现转染后含有ABCG5和ABCG8的7721-DG细胞系胆固醇转运能力明显高于其余两株细胞系，而仅含有ABCG5的7721-G5细胞系胆固醇转运能力无明显变化。结论ABCG5与ABCG8具有促进胆固醇外运的作用，两者必须形成异二聚体才能行使这种作用。此外，用myc和HA标记后并不影响ABCG5和ABCG8发挥功能。     

马钱子碱纳米微粒抗肝细胞癌作用的实验研究

目的 观察马钱子碱纳米微粒的抗肝细胞癌作用.方法 采用超声乳化法研制羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱纳米微粒,体外观察其对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响;采用Western blotting和FQ-PCR检测药物作用72 h对肝癌细胞凋亡相关蛋白Fas蛋白和mRNA表达水平的影响.结果 马钱子碱纳米微粒平均粒径(146±96) nm,载药率:4.2％,包封率:67％.随药物浓度的增加,肝癌细胞生长抑制作用明显,呈现剂量依赖性.5-FU、马钱子碱和马钱子碱纳米微粒对肝癌细胞生长的IC50分别为16.7 μg/ml、90.3 μg/ml和164.9 μg/ml,三者之间差异显著(P＜0.05).与空白纳米微粒相比,马钱子碱纳米微粒显著诱导肝癌细胞Fas蛋白和mRNA表达,且320 μg/ml剂量诱导表达显著高于160 μg/ml (P＜0.05).结论 马钱子碱纳米微粒显著抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,可能与上调肝癌细胞Fas蛋白和mRNA表达有关.马钱子碱纳米微粒是一种具有潜在发展前景的肝癌治疗药物.     

人平衡型核苷载体在乳腺癌细胞中的表达情况及其对5-FU药效的影响

目的研究乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3、MCF-7中人平衡型核苷载体（hENTS）的表达及其对5氟尿嘧啶（5-Fu）细胞毒性的影响。方法MDA-MB-231、MDA—MB-468、SK-BR-3、MCF-7细胞常规培养于含10％小牛血清的高糖DMEM培养液中。逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）检测4种细胞株中hENTlmRNA及hENT2mRNA的表达。每种细胞分别在含有一定浓度序列（1．28×10^4ng／L～2．00×10^8ng／L）5-FU的培养液中培养48h。MTT法检测4种细胞株增殖,并计算其5-FU的半数抑制浓度（IC50）。结果①bENT1及hENT2mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞中的表达均较其在MCF-7细胞中（P伊〈0．05）,但其表达在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞中差异无统计学意义（P〉0．05）。hENT2mRNA表达在4种细胞中均较hENT1 mRNA表达低,差异有统计学意义（P〈0．05）。②MTT结果显示,5-FU的IC50在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞株中均较在MCF-7细胞株中低（P〈0．05）,在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞株之间差异无统计学意义（P〉0．05）。③在5-FU的IC50 较低的乳腺癌细胞株（MDA-MB-231、MDA—MB-468、SK-BR-3）中高表达hENTs,而在5-Fu的Ic50较高的乳腺癌细胞株（MCF-7）中,低表达hENTs或无表达。结论在乳腺癌细胞株中,细胞膜上hENTs的表达情况能显著影响5-FU的作用效果,其结果提示,在临床上可能需要依据hENTs的表达情况来选择核苷类抗癌药物。     

携带促血管生成素基因的肝癌细胞对血管内皮细胞的趋化作用

目的观察携带促血管生成素(angiopoietin)基因的肝癌细胞系SMMC7721对血管内皮细胞的趋化作用,为进一步研究促血管生成素在肝癌血管生成中的作用奠定基础。方法通过脂质体介导的基因转染方法将促血管生成素基因导入SMMC7721肝癌细胞系,采用小孔趋化分析实验观察肝癌细胞系对脐静脉血管内皮细胞(采用原代培养2~3代之细胞)的趋化作用。结果促血管生成素1(Ang-1)基因转染前、后SMMC7721肝癌细胞使脐静脉血管内皮细胞迁移数分别为(21±2)个/HPF和(62±3)个/HPF,差异有统计学意义(P<0.05)。促血管生成素2(Ang-2)基因转染后与转染前相比差异无统计学意义(P>0.05)。这种趋化作用可以被相应抗体所阻断。结论Ang-1对血管内皮细胞具有明显的趋化作用,是新生血管形成的促进因子;Ang-2对血管内皮细胞没有明显的趋化作用。     

血管生成抑制剂YH-16联合氟尿嘧啶抑制结直肠癌肝转移的研究

目的探讨血管生成抑制剂YH-16和氟尿嘧啶（5-FU）联合应用对结直肠癌肝转移的抑制作用。方法用MTT方法测定血管生成抑制剂YH-16和5-FU对血管内皮细胞和结肠癌细胞的IC50；建立小鼠肝转移模型。随机分为对照组、YH-16组（又分为低、中、高剂量3组）和5-Fu组及联合治疗组（YH-16加5-FU），术后2周观察各组小鼠肝转移瘤数目、原发灶大小和毒性反应。并检测肝转移瘤血管内皮生长因子（VEGF）的表达和肿瘤微血管密度（MVD）。结果YH-16对结肠癌细胞的IC50是血管内皮细胞的3．38倍，而5-Fu对两种细胞的IC50差别不大。高剂量YH-16组、5-FU组和联合治疗组肝转移瘤数目明显低于对照组。而联合治疗组又低于高剂量YH-16组和5-FU组（均P〈0．05）。YH-16各剂量组的脾原发瘤体积与对照组比较均P〉0．05。差异无统计学意义；而5-FU组和联合治疗组则小于对照组（均P〈0．05）。YH-16的毒性明显低于5-FU（P〈0．05），且两者联合使用其毒性与单用5-FU比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。5-FU组和联合治疗组肝转移瘤组织中VEGF的表达明显降低，中、高剂量YH-16组和5-FU组及联合治疗组肝转移瘤组织中的MVD计数明显降低（均P〈0．05）。结论血管生成抑制剂YH-16明显抑制结直肠癌肝转移，YH-16与5-FU联合应用对结直肠癌肝转移的抑制具有协同作用。