人睾丸特异表达基因TDRG1 单克隆抗体的制备及鉴定

目的：构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体（mAb）并鉴定其生物学特性。方法：用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体（mAb）。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western 印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。 结果：成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western 印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论：所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。     

凝血因子Ⅷ C2结构域表达载体的构建及其在真核细胞NIH3T3中的表达

医学院免疫系,加拿大 温尼伯 R3E 0W3 目的：构建人凝血因子FⅧ中具有免疫活性的C2结构域表达载体并通过真核宿主细胞表达出多肽。 方法：从HEK293细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增获得目的片段。将该片段与信号肽共同构建在同一表达载体,并在NIH3T3细胞中表达,Western blotting检测。 结果：经限制性酶切鉴定和测序分析证实,采用RT-PCR成功地完成FⅧ-C2 cDNA的扩增和表达载体的构建,重组载体转染进入NIH3T3细胞后,经检测培养上清中的蛋白成分证实,成功地表达出FⅧ-C2结构域多肽。 结论：重组表达载体的构建是表达出分泌型FⅧC2多肽的一种可行的方法。     

羊布鲁菌BCSP31蛋白表达纯化及其单克隆抗体的制备

目的：表达并纯化羊布鲁菌BCSP31蛋白,制备其单克隆抗体（mAb）．方法：采用GST亲和层析纯化的方法纯化BCSP31蛋白．用纯化的BCSP31蛋白免疫小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2／0细胞融合,ELISA间接法筛选阳性克隆,3次克隆化后建立杂交瘤细胞系．采用小鼠腹腔接种杂交瘤细胞制备腹水,正辛酸-硫酸铵法纯化mAb．采用Western Blot和ELISA等方法鉴定mAb特性．结果：GST—BCSP31融合蛋白在25℃诱导时为可溶性表达,经亲和层析纯化,获得BCSP31纯化蛋白0．5g／L;Western Blot检测结果显示所获蛋白可与兔抗布鲁菌阳性血清特异性反应．获得2株mAb,分别命名为1F1,1E5．结论：BCSP31蛋白的纯化及其mAb的制备为布鲁菌病的诊断与防治奠定了一定的物质基础．     

Mer免疫球蛋白样区原核蛋白表达和单克隆抗体制备

目的利用原核蛋白表达载体,体外表达Mer的IgG样区,并利用此重组蛋白制备抗Mer的单克隆抗体。方法从K562细胞中抽提总RNA,利用RT-PCR扩增Mer的IgG样区片断。经过测序将所得片断与PQE30原核表达载体连接并转化到大肠杆菌M15中,挑选阳性克隆,经诱导和纯化后获得原核蛋白。利用所得的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾脏和小鼠杂交瘤细胞融合制备针对Mer的IgG样区的特异性抗体。利用ELISA方法筛选阳性克隆,Westernblot方法进行验证。结果体外成功表达MerIgG样区的原核蛋白,片断大小经修饰后约为26kd,表达量占菌体总蛋白的15%,经Ni-NTAagrose柱纯化后得到纯化蛋白并免疫Balb/c小鼠。将小鼠脾脏细胞和杂交瘤细胞融合后得到1株特异性抗MerIgG样区的单克隆抗体——SZ-128,Westernblot显示此单抗可以和表达的重组蛋白和Mer胞外区真核蛋白反应。结论成功制备1株抗MerIgG样区的特异性单克隆抗体,为研究Mer的功能提供了有力的工具。     

基因重组人凝血因子Ⅷ在中国人血友病A患者中使用的研究

目的 探讨第二代rFⅧ（Kogenate FS）在中国人血友病A患者中使用的安全性和有效性。方法 采用第二代rFⅧ（Kogenate FS）治疗14例血友病A志愿者患者，用药前进行FⅧ抗体、FⅧ：C活性、血清病毒学（HBV、HCV和HIV）、血常规、尿常规、大便常规以及肝肾功能检查，于第一次用药后10min和60min进行FⅧ：C测定，治疗结束后进行FⅧ抗体和肝肾功能检测。结果 ①采用KogenateFS治疗的14例血友病A志愿者患者中，KogenateFS用量12．99～25．00u／kg（平均18．74u／kg），总用量3000～11000u（平均6570u），自治疗至出血停止或出血症状改善所需的时间为1．5～5．5d（平均3．29d），除1例FⅧ抗体滴度较高者外，其余13例患者第一次用药后10min和60minFⅧ：C活性均明显升高，用药前后FⅧ：C活性比较差异具有显著性（P〈0．01）。显效13例（占92．86％），好转1例（占7．14％），总有效率为100％。②14例血友病A志愿者患者中，用药前FⅧ抗体阳性2例，其中1例FⅧ抗体〉5Bu，第一次用药后10min和60minFⅧ：C活性无明显升高，治疗结束后FⅧ抗体仍然〉5Bu，但出血症状改善；另1例FⅧ抗体为4Bu，第一次用药后10min和60minFⅧ：C活性显著升高，治疗结束后FⅧ抗体转为阴性。③14例血友病A志愿者患者在应用KogenateFS治疗期间和治疗结束后均表现出良好的耐受性，无不良事件或药物不良反应发生。结论 第二代rFⅧ（KogenateFS）治疗中国人血友病A患者耐受性好，安全有效。     

猪链球菌反应调节因子CovR单克隆抗体的制备与鉴定

目的CovR是一个全局性反应调控因子,对猪链球菌的致病性具有重要调控作用。文中制备抗2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype2,S.suis2）反应调节因子CovR蛋白单克隆抗体（mAb）,以便对CovR的调控机制进行系统研究。方法以基因工程重组CovR蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选可稳定分泌抗CovR mAb的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA法和Western blot鉴定抗CovR mAb的特异性后,制备小鼠腹水并测定单抗腹水的抗体效价。单抗分型ELISA鉴定抗CovR单克隆抗体IgG亚类。结果获得2株能稳定分泌抗CovR mAb的的杂交瘤细胞株1A4和4D7,其培养上清抗体效价分别为1∶800、1∶1600,其相应单抗腹水的抗体效价分别为1∶819200、1∶1638400。mAb 1A4和4D7IgG亚类分别为IgG2b、IgGl。结论成功制备了抗CovR mAb,为进一步研究CovR的调控机制奠定了基础。     

重组人IL-1β分子的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

目的克隆人IL-1β基因,纯化其原核表达的产物,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法重组原核表达质粒pET-32a（＋）-IL-1β在宿主菌BL21（DE3）表达后,用割胶回收、电洗脱的方法纯化原核表达的蛋白,并用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。用ELISA法检测mAb的效价,并进行Ig亚类、特异度的检测。结果本研究利用HL-60细胞系cDNA为模板经PCR克隆了人IL-1β基因,纯化的重组人IL-1β蛋白纯度和含量分别为95%和0.75μg/μl。共筛选出能稳定分泌抗人IL-1β的杂交瘤细胞2株,分别为5G5和8H8。抗体亚型均为IgG2a,轻链均为κ链。结论克隆了人IL-1β基因,并成功纯化了其原核表达的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备的鼠抗人IL-1β的单克隆抗体（mAb）,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

人IgE重链3-4区蛋白的表达、纯化及功能分析

目的通过基因重组的方法表达IgE Cε3-Cε4区,鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的相互作用,并用重组蛋白免疫小鼠制备血清。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞调取IgE Cε3-Cε4cDNA片段,克隆至pET28a(+)构建原核表达载体IgE Cε3-Cε4-pET28a(+),将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达IgE Cε3-Cε4区蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白后,用免疫荧光方法鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的结合能力,并用UniCAP 100全自动分析检测仪对重组抗原进行定量检测与鉴定;用表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗鼠血清,用Western-blot法对多克隆抗体进行鉴定。结果成功调取的人IgE Cε3-Cε4区基因与已报道的序列相一致;获得的IgECε3-Cε4区蛋白相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致;IgE Cε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位;免疫鼠血清多抗能特异性结合天然人血清IgE。结论成功构建了IgE C...     

环孢素A对雄性大鼠血浆凝血因子的影响

目的：探讨环孢素A对SD雄性大鼠血浆凝血因子变化和对提高凝血因子Ⅷ（F Ⅷ：C0）浓度的作用机制。方法：将40只SD雄性大鼠随机分为4组，干预组分别以环孢素A 5me/kg（A组）、10mg／kg（B组）和15mg／kg（C组）灌胃，对照组以生理盐水灌胃，2个月后分别检测血小板、FⅧ：C浓度和假血管性血友病因子（vWF）浓度，同时检测大鼠肝、肾功能。结果：与对照组比较，A组大鼠FⅧl：C浓度显著升高（P〈0．05），而B组和C组FⅧ：C浓度与对照组比较无统计学差异（P〉0．05）。各组问血小板数量和vWF浓度无显著差别。结论：给予低浓度5mg/kg环孢素A可促进FⅧ：C的分泌，而高浓度环胞素A对FⅧ：C分泌无影响。     

幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）CagL蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）,并鉴定其特性。方法： 用原核表达并纯化的CagL融合蛋白免疫BALB/c小鼠,6周后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经亚克隆筛选获得阳性杂交瘤细胞株;ELISA法鉴定mAb的亚型;间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清和腹腔积液效价及其相对亲和力;相加ELISA法分析mAb的识别表位;蛋白质印迹法鉴定mAb特异性;冻溶法检测杂交瘤细胞株的稳定性。结果： 获得3株能稳定分泌抗CagL的杂交瘤细胞株,其中两株单抗属IgM类,一株单抗属IgG2a类,轻链型别均为κ型;杂交瘤细胞培养上清效价在1∶64～1∶128之间,腹腔积液的效价均达1∶16 000以上;相对亲和力较高;3株mAb识别3种不同的抗原表位;3株mAb都能与融合蛋白反应,其中两株能与H.pylori全菌蛋白发生特异性反应;杂交瘤细胞经冻存复苏后,体外传代仍能稳定分泌mAb。结论： 成功制备了抗H.pylori CagL蛋白的单克隆抗体,为深入研究幽门螺杆菌CagL蛋白的功能和Ⅳ型分泌系统的致病机制奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导人凝血因子Ⅷ在哺乳细胞中的高效表达

目的　建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ (FⅧ )体外高效表达体系。方法　将一B区缺失 (76 0aa～ 16 39aa)的人FⅧcDNA(FⅧcDNABD)克隆至逆转录病毒载体pLNCX ,构建了重组表达载体LNC ⅧBD。经PA317细胞包装后 ,感染多种靶细胞。分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性 (FⅧ∶C)和抗原含量 (FⅧ∶Ag)以及细胞中FⅧcDNABD的转录。结果　重组逆转录病毒载体LNC ⅧBD在四种靶细胞中有不同程度的表达。其中以NIH3T3细胞的表达最高 ,FⅧ∶C为 1.6U/ 10 6细胞·2 4hrs 1,FⅧ∶Ag为 5 0 0ng/ 10 6细胞·2 4hrs 1。CHO细胞表达的FⅧ∶C活性为 0 12U/ 10 6细胞·2 4hrs 1,FⅧ∶Ag为 6 2 4ng/10 6细胞·2 4hrs 1。FⅧ在Cos 7和一正常成人肝细胞系L 0 2中表达较低。RT PCR可检测到靶细胞中人FⅧcDNABD的转录的mRNA。结论　逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达 ,为血友病A的基因治疗奠定了基础     

凝血因子Ⅷ抑制物的诊治进展

凝血因子Ⅷ抑制物系体内产生的具有灭活或中和FVⅢ促凝活性的抗体，引起FⅧ水平和活性降低，造成临床严重出血。包括同种免疫抗体（allo-antibodies）；血友病A（HA）患者输注FⅧ制品后产生的抗FⅧ抗体；自身免疫抗体（Auto-antibodies）；非血友病患者自发产生的抗FⅧ抗体。     

人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的研制及其生物学功能的初步研究

目的 研制人血管性血友病因子(vWF)A1区的单克隆抗体及其生物学特性的鉴定.方法 采用基因重组技术体外表达人vWF A1区蛋白(rv, WF-A1),以rvWF-A1免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养,用ELISA筛选阳性杂交瘤细胞.采用Western blot和免疫组织化学方法进行单抗鉴定.结果 构建了rvWF-A1表达载体pQE30-vWF-A1.rvWF-A1在大肠杆菌M15中稳定表达.通过融合、筛选获得两株阳性杂交瘤细胞,命名为SZ-129和SZ-130.其分泌的抗体能特异性地与rvWF-A1和人血浆中vWF结合.结论 表达了rvWF-A1,并制备了具有潜在抗血栓作用的vWF-A1单克隆抗体SZ-129和SZ-130.     

重组人凝血因子Ⅷ在中国血友病A患者的有效性及抑制物产生的观察

目的探讨重组人凝血因子Ⅷ（Kogenate FS，拜科奇）在中国血友病A患者的有效性、安全性及抑制物产生率。方法采用拜科奇治疗30例血友病A患者的出血事件，观察其临床止血效果及用药后4周FⅧ抑制物的产生情况。其中11例患者在用药前后进行血、尿便常规、肝肾功、血清病毒学（HBV、HCV、HIV）、FⅧ抑制物、FⅧ活性检测，并于第1次用药后10min、60min检测FⅧ活性；同时随访2年检测FⅧ抑制物。结果11例患者在用药后10min、60min较用药前FⅧ活性明显提高，达到或接近预期升高值；所有30例患者用药后出血症状停止，显效率达100％。每次出血事件约86．7％的患者在≤3次输注即可较好的控制症状，提示具有较好的有效性。30例患者共输注重组FⅧ70次，总计51294u，在用药期间无任何不良反应出现。本研究发现1例患者在用药后4周产生FⅧ抑制物，提示短期抑制物产生率为3．3％（1／30），11例2年随访未见抑制物产生增加趋势。结论重组人凝血因子Ⅷ（Kogenate FS，拜科奇）在中国血友病A患者使用中具有较好的有效性、安全性及较低的抑制物产生率。     

抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定.方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类.结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合.腹水mAb效价可达6×104.mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol.2株单抗属IgM亚类.染色体分析符合杂交瘤细胞特征.结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件.     

鼠抗人PD-L1单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备鼠抗人PD-LI单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行鉴定.方法 以重组GST-PDL1融合蛋白免疫BALB/c小鼠,建立可稳定分泌抗PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株.用ELISA及Western blot鉴定mAb的特性.并测定其效价及Ig亚类.用免疫组织化学和流式细胞术分析其与干扰素-γ(IFN-γ)诱...     

人神经菌毛素1 b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用

目的：制备抗人神经菌毛素1（human neuropilin 1,HuNRP1）b结构域单克隆抗体（monoclonal antibodies,mAb）,为靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料。方法：运用杂交瘤技术,将HuNRP 1 b结构域重组蛋白（TF-HuNRP1b）免疫BALB/c鼠,共免疫3次,取免疫鼠的脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合,采用间接免疫荧光法（immunofluorescent assay,IFA）筛选稳定分泌抗HuNRP1b mA,以Western blot、IFA、流式细胞术分析mAb的特异性。以MTT法及小室迁移实验分析mAb抑制血管生成的能力。结果：获得1株稳定分泌抗HuNRP1b mAb的细胞株4F11。Western blot结果表明,本研究所获得的mAb 4F11只与重组HuNRP1b发生反应,与对照蛋白不发生反应;IFA及流式细胞分析结果表明,所获得的mAb能够识别肿瘤细胞MDA-MB-231、HepG2以及人脐静脉内皮细胞表达的天然HuNRP1蛋白;MTT法及小室迁移实验表明,所获得的mAb 4F11具有抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的能力。结论：成功制备出抗HuNRP1b的mAb,该mAb的获得将为进一步研究HuNRP1的功能及靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料。     

大鼠抗小鼠重组膜联蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌特异性抗小鼠膜联蛋白A2（AnxA2）的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系。方法利用重组小鼠AnxA2蛋白作为抗原免疫Wistar大鼠,通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠AnxA2蛋白的大鼠-小鼠融合单抗杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型,免疫印迹和流式细胞术验证所筛选的单克隆抗体的特异性。结果通过对30多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选,获得一株分泌特异性抗小鼠AnxA2的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系SZ-158,连续培养传代后染色体分析证实,Wistar大鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞稳定融合;免疫印迹和流式细胞术显示该单克隆抗体可以特异识别小鼠AnxA2重组蛋白。结论该研究所获得的大鼠-小鼠融合单克隆抗体特异性针对小鼠AnxA2蛋白,可用于AnxA2转基因小鼠中AnxA2表达的检测,为深入研究AnxA2的功能提供了物质保障。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的快速、高效制备的方法研究

目的探讨制备和鉴定SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体(mAb)快速免疫方法。方法用基因重组SARS冠状病毒N蛋白和足垫免疫2周的BALB/c小鼠制备mAb,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出4株抗SARS冠状病毒N蛋白mAb杂交瘤细胞株,ELISA间接法和免疫荧光证实这组单克隆抗体仅与SARS冠状病毒特异性反应,而与其他病原体无交叉反应,IgG亚类鉴定2株为IgG1,另2株分别IgG2a和IgG2b。2株抗体亲和常数分别为4.14×10-9 M和3.19×10-9 M。结论获得特异性针对SARS冠状病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断、蛋白组学和发病机制的研究奠定了基础。