慢性粒细胞白血病p53基因的点突变

应用双脱氧指纹图(dideoxy fingerprinting,DDF)技术对不同临床分期的慢性粒细胞白血病(CML)24例骨髓细胞的p53基因的5,6,7,8外显子进行了点突变筛查分析,并用DNA测序技术对筛查到的突变进行确证。结果发现:慢性期20例中未检测到p53基因点突变;加速期3例中有1例在p53基因的第5外显子发生了错义突变,而该病例在慢性期并未发现相同位点的突变;急变期1例p53基因的第6外显子发生了错义突变。结论提示,p53基因的突变可能与慢性粒细胞白血病从慢性期发展到加速期和急变期的临床进程有关。     

瘢痕疙瘩形成与发展中p53基因突变的意义

目的：通过检测瘢痕疙瘩p53基因第4～8外显子的突变，探讨p53基因突变在瘢痕疙瘩形成与发展中的意义。方法：取手术切除的瘢痕疙瘩和正常瘢痕各12例，并分别取正常皮肤对照，采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP)，检测p53基因的突变情况。结果：12例瘢痕疙瘩标本中有9例p53基因外显子4，5，6，7出现点突变和移码突变，正常瘢痕标本、正常皮肤标本均未检出突变：结论：p53基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

骨髓增生异常综合征患者p53基因突变的临床意义

骨髓增生异常综合征(MDS)是以骨髓病态造血和外周血血细胞减少为特征的一组异质性疾病,约30％—40％的患者转变为急性白血病。因此,人们认为急性白血病是多阶段发病过程。癌基因激活和抑癌基因失活是基因异常的两个方面,它在人类恶性疾病的发生、发展中可能起着重要作用。为了评价MDS患者p53基因突变的临床意义,我们用PCR-SSCP分析方法研究了67例不同阶段的MDS患者p53基因7、8号外显子的点突变。     

瘢痕疙瘩形成与发展中p53基因突变的意义

目的:通过检测瘢痕疙瘩p53基因第4～8外显子的突变,探讨p53基因突变在瘢痕疙瘩形成与发展中的意义。方法:取手术切除的瘢痕疙瘩和正常瘢痕各12例,并分别取正常皮肤对照,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP),检测p53基因的突变情况。结果:12例瘢痕疙瘩标本中有9例p53基因外显子4,5,6,7出现点突变和移码突变,正常瘢痕标本、正常皮肤标本均未检出突变。结论:p53基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

原发性肝癌P53和Rb基因改变的分析

目的：研究鄂西北地区原发性肝癌P53基因和Rb基因的突变特点和规律。探讨两种抗癌基因在肝癌发生过程中的作用及其与组织学预后的关系。方法：应用PCR-SSCP和PCR-RFL法检测65例肝癌组织中P53基因5、6、7、8外显子和Rb基因17和21外显子突变率。结果：肝癌中P53基因突变率为50.8%，以缺失为主，Rb基因的突变率为38.5%。P53和Rb基因同时突变率为12.3%。结论：原发性肝癌既有P53基因突变。也存在Rb基因突变，二在肝癌的发生中均起作用。P53和Rb基因同时突变与肝癌组织分级密切相关。     

FLT3基因内部串联重复突变与急性白血病的关系及临床意义

目的　研究FLT3基因的内部串联重复 (internaltandemduplication ,ITD)突变与急性白血病的关系及临床意义。方法　采用PCR方法分析 14 3例急性髓系白血病 (AML)、2 5例急性淋巴细胞白血病 (ALL)、2例急性杂合性白血病 (AHL)、17例骨髓增生异常综合征 (MDS)和 7例慢性粒细胞白血病急变期 (CML BC)患者骨髓单个核细胞中FLT3基因外显子 14和 15中ITD突变 ,分析FLT3 ITD阳性AML患者的临床特征及疗效。结果　 14 3例AML患者中 37例 (2 5 .9% )FLT3 ITD阳性 ,其中 5 3例M2 中 10例、4 0例M3 中 15例、2 0例M4中 4例、2 3例M5中 8例。在 2 5例ALL、2例AHL、17例MDS和 7例CML BC患者中未检测到FLT3 ITD突变。对其中 5例特征性突变测序结果显示 ,ITD位于外显子 14 ,长度为 2 1～ 6 0bp ,3例为单纯串联重复 ,2例同时出现插入序列 ,均未改变FLT3阅读框架。临床研究表明 ,FLT3 ITD突变在染色体核型正常患者中占有较高比例 (P <0 .0 5 ) ,FLT3 ITD阳性患者外周血白细胞数高 (P <0 .0 5 ) ,化疗后完全缓解率低 (P <0 .0 5 )。结论　FLT3 ITD突变多见于M3 、M5患者 ,为框内突变 (Inframemutation)。FLT3 ITD阳性的AML患者外周血白细胞数高 ,化疗后完全缓解率低     

Wilson病基因第8、14和18外显子突变检测的初步研究

目的：探索中国人群Wilson病基因(ATP7B)第8、14、18外显子突变特征。方法：采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染技术初步研究了30例患者和15例正常人ATP7B基因第8、14、18外显子突变频率。结果：第8外显子有6例患者发现泳动异常(20％，6／30)，且均为杂合子；14、18外显子及正常人未见异常迁移。结论：提示中国人ATP7B基因第8外显子可能为一突变热区。     

原发性胃腺癌P53基因7,8外显子突变研究

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤。其发生是以多个原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活为基础的。P_(53)基因是一种人体内重要的细胞生长调节基因。定位在染色体17P13.1。它的突变在许多常见恶性肿瘤发展中起着重要作用,并且突变后的P_(53),基因起癌基因的作用,P_(53)基因突变的热点多集中在5、6、7、8外显子。因此,我们采用多聚酶反应单链构象多态(PCR-SSCP)分析对20例原发性胃腺癌胃镜活检组织7、8外显子突变进行了研究。以探讨P_(53)基因突变和人类胃癌发生的关系。     

脆性组氨酸三联体(FHIT)基因外显子5,8纯合性缺失及突变与胃癌的关系

目的:探讨胃癌组织中抑癌基因FHIT外显子5.8纯合性缺失及突变情况。方法:采用外显子特异聚合酶链反应(PCR)及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)-银染方法对30例胃癌和18例正常组织中FHIT基因外显子5,8的纯合性缺失和点突变显示检测和比较。结果:胃癌组织中FHIT基因外显子5、8总纯合性缺失率为23.3%,正常组织无一例缺失(P=0.011);外显子5、8纯合性缺失率分别为16.67%和13.33%(P>0.05);FHIT基因外显子5、8纯合性缺失与胃癌的分化程度、病理分期及淋巴结转移无显著性相关(P>0.05)。所有胃癌组织标本均未检测到外显子5,8的点突变。结论:提示FHIT基因外显子5、8纯合性缺失可能在胃癌的发生中起重要作用。而点突变不是FHIT基因失活的主要方式。     

成人及儿童急性白血病p16基因失活的对比研究

我们应用PCR、DNA单链构象多态性(SSCP)及DNA序列分析技术对30例成人急性白血病(AL)及53例儿童AL患p16基因外显子1，2进行纯合子缺失和点突变研究．旨在对比分析成人与儿童ALp16基因的失活情况及其与AL的发生、发展、预后的关系。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞P53基因突变检测

目的探讨瘢痕疙瘩体外培养成纤维细胞是否存在P53基因突变及形成发展机制。方法对所取新鲜组织标本进行细胞培养,设计P53基因外显子4,5,6的引物序列,从所培养各组成纤维细胞中提取细胞总DNA,采用PCR技术对所需基因片段进行扩增,并对目的基因进行测序。结果对PCR产物DNA序列分析后发现,所有体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(6/6)均存在P53外显子4的基因突变,有2例(2/6)P53外显子5存在基因突变,表现为点突变及移码突变,而正常皮肤成纤维细胞则未发现有任何形式的基因突变。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞存在P53基因突变,这可引起其细胞增殖凋亡异常。     

以PCR－SSCP分析和核苷酸序列直接测定技术检测人类白血病p53基因点突变

以多聚酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析（技术研究）３６例不同类型的白血病ｐ５３抗癌基因点突变，结果在１４例淋巴细胞白血病中发现３例有ｐ５３基因片段的泳动变位。进一步对其中的１例急性淋巴细胞白血病进行核苷酸序列直接测定，显示在第７外显子的２５７位编码子核昔酸由ＣＴＧ突变为ＣＡＧ、氨基酸由天冬氨酸突变为缀氨酸。２２例髓系白血病未发现有ｐ５３基因的点突变。结果提示ｐ５３抗癌基因点突变导致功能失活在淋巴细胞白血病的发病中可能起一定的作用。     

伴有NPM1基因突变的急性髓细胞白血病患者的临床特征

目的分析急性髓细胞白血病（AML）的NPM1（Nucleophosmin）基因第12外显子突变,探索伴有NPM1基因突变的AML患者的临床特征。方法随机选择98份临床确诊的急性白血病和骨髓增生异常综合征（MDS）患者的冻存骨髓细胞标本,其中78份AML、10份急性淋巴细胞白血病（ALL）和10份MDS提取DNA,行多重PCR,同时扩增NPM1基因第12外显子及FLT3基因第14、15外显子,PCR-毛细管电泳同时检测NPM1和FLT3-ITD基因突变。结果 78例AML患者共检出21例（26.9%）具有NPM1基因突变,10例ALL和10例MDS均未检测出该突变。78例AML中52例核型正常,NPM1阳性19例（36.5%）,26例异常核型AML患者NPM1阳性仅2例（7.7%）,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。AML-M2、M5患者NPM1基因突变发生率高于其他组。NPM1突变型AML患者WBC中位数为42.0（16.3～102.0）×10^9/L,野生型为14.0（3.4～67.2）×10^9/L,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。21例NPM1突变型AML中12例（57.1%）同时伴有FLT3-ITD,57例NPM1野生型患者13例（22.8%）出现FLT3-ITD突变,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。NPM1阳性FLT3阴性患者9例中8例（88.9%）获得CR1,NPM1阳性FLT3阳性12例中3例（25%）获得CR1,NPM1阴性FLT3阴性33例中16例（48.5%）获得CR1,NPM1阴性FLT3阳性13例中2例（15.4%）获得CR1,组间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 NPM1基因突变是AML患者常见的一种突变,尤其是染色体核型正常AML患者发生率较高。伴有NPM1突变的AML患者的临床特征为年龄高,外周血白细胞高,更常见于M2和M5中,伴随FLT3-ITD突变发生率高,CR1率较高。     

Hereditary and acquired p53 gene mutations in childhood acute lymphoblastic leukemia.

The p53 gene was examined in primary lymphoblasts of 25 pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia by the RNase protection assay and by single strand conformation polymorphism analysis in 23 of 25 cases. p53 mutations were found to occur, but at a low frequency (4 of 25). While all four mutations were identified by single strand conformation polymorphism, the comparative sensitivity of RNase protection was 50% (2 of 4). Heterozygosity was retained at mutated codons in 3 of 4 cases. One pedigree was consistent with the Li-Fraumeni syndrome, and bone marrow from both diagnosis and remission indicated a germline G to T transversion at codon 272 (valine to leucine). Although members of another family were affected with leukemia, a 2-bp deletion in exon 6 was nonhereditary. The other two nonhereditary p53 mutations included a T to G transversion at codon 270 (phenylalanine to cysteine) and a G to C transversion at codon 248 (arginine to proline). These data support the role of both hereditary and acquired p53 mutations in the pathogenesis and/or progression of some cases of childhood acute lymphoblastic leukemia.     

Absence of hereditary p53 mutations in 10 familial leukemia pedigrees.

Germline p53 mutations have been identified in the Li-Fraumeni syndrome but the role of such mutations in familial leukemia is not established. The p53 gene was examined by single-strand conformation polymorphism analysis of exons 4-8 in 10 families with multiple members affected with leukemia. The diagnoses included acute and chronic leukemias and Hodgkin's disease. Identified in two families were p53 mutations that were nonhereditary. These included a 2-bp deletion in exon 6 found in the lymphoblast DNA of one child whose sibling, cousin, and several adult relatives had acute leukemia. The other nonhereditary p53 mutation was a transition at codon 248 (CGG to CAG, arginine to glutamine) found in the lymphoblasts of a patient with a preleukemic syndrome and acute lymphoblastic leukemia (ALL) whose brother is a long-term survivor of ALL. Thus, p53 mutations were found to occur in two families but both were nonhereditary. Moreover, in the remaining eight families no p53 mutation was identified in the regions of p53 where most mutations have been found in other cancers. Although p53 mutations sometimes may be present, they do not appear to be a primary event responsible for hereditary susceptibility to familial leukemia. This study suggests involvement of other genes or mechanisms.     

儿童血液系统疾病端粒酶催化亚基基因序列分析

目的分析人类端粒酶逆转录酶（htert）基因部分外显子突变序列在不同儿童血液系统疾病的特征与关系。方法对71例血液科住院患儿（含46例急,tg白血病和25例非白血病患几）的外周血标本,成人急性髓系白血病（AMI。）高发突变的htert基因15号外显子区域进行测序,分析序列特征、突变与疾病的关系。结果71例血液系统疾病患儿htert基因15号外显子序列分析中,46例急性白血病患儿未发现该区域的突变。25例非白血病患儿中,2例再生障碍性贫血患儿发现5号染色体1254714位置碱基C杂合突变为A,该位点距离htert基因15号外显子转录起始位点上游91bp。结论成人AML患者htert基因高突变区在儿童急性白血病中突变率低; htert基因杂合突变可能与端粒相关的再生障碍性贫血有关,值得进一步研究。     

结直肠癌p53基因点突变和蛋白表达的研究

目的了解中国人结直肠癌ｐ５３基因的突变谱，探讨聚合酶链反应－单链构象多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染技术用于研究结直肠癌中ｐ５３基因突变的可行性。方法应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术检测４１例结直肠癌ｐ５３基因突变，以ＡＢＣ免疫组织化学染色检测结直肠癌Ｐ５３蛋白的表达。结果３４％（１４／４１）的病例显示有ｐ５３基因突变，其中外显子５，６，７和８各有４，１，５和４例突变。２０例有Ｐ５３蛋白异常表达，阳性率为４９％。结论导致Ｐ５３蛋白异常堆积的ｐ５３基因突变是结直肠癌的一种常见的分子结构改变，可能在结直肠癌的发生和发展中起着重要的作用。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术是一简便、快速、有效的检测基因点突变的方法     

白血病中FHIT基因的异常表达和缺失

FHIT基因位于染色体 3p14 .2 ,实验室的研究证实FHIT基因具有抑癌基因活性。FHIT基因异常表达或表达缺失出现在多种实体肿瘤和造血系统恶性疾病。为了探讨白血病细胞中FHIT基因的异常表达及意义 ,采用巢式RT PCR法对急性髓性白血病 (AML)、急性淋巴细胞白血病 (ALL)、慢性粒细胞白血病 (CML)以及骨髓增生异常综合症 (MDS)、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、骨髓瘤 (MM )等不同类型白血病患者FHIT基因转录本进行检测 ,并对FHIT基因转录本进行序列测定。 98份血液系统恶性疾病患者的骨髓或外周血标本中AML 38例 ,ALL16例 ,CML 34例 ,其它恶性血液病 10例。全部患者经骨髓细胞形态检查 ,诊断符合FAB诊断标准。肝素抗凝骨髓或外周血 2 - 3ml,分离单个核细胞 ,取 5× 10 7个细胞 ,用RTIZOL 试剂一步法提取细胞总RNA ,行PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。回收目的片段 ,克隆到PGEM T载体 ,进行序列测定。结果表明 :在 5 5 / 98(5 6 % )的被检测病例有FHIT基因的异常表达 ,在AML、ALL和CML异常表达的发生率分别为 2 2 / 38(5 8% ) ,9/ 16(5 6 % )和 19/ 34(5 6 % )。正常骨髓或外周血标本未见有FHIT基因的异常表达。 4 3/ 98(44 % )的患者表达正常转录本 (Ⅰ型 ) ,4 0 / 98(41% )的患者同时表达正常转录本和异常     

Evaluation of oligonucleotide arrays for sequencing of the p53 gene in DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded breast cancer specimens

BACKGROUND: Routine tissue processing has generated banks of paraffin-embedded tissue that could be used in retrospective cohort studies to study the molecular changes that occur during cancer development. The purpose of this study was to determine whether a p53 microarray could be used to sequence the p53 gene in DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues. METHODS: DNA was extracted from 70 FFPE breast cancer tissue specimens. p53 was sequenced with an oligonucleotide microarray (p53 GeneChip; Affymetrix), and the results were compared with the results obtained from direct sequencing. RESULTS: DNA was extracted from 62 of 70 cases. We identified 26 mutations in 24 of the 62 cases by the p53 GeneChip. No polymorphisms were detected, and exon 4 could not be evaluated in 20 cases. There were 43 genetic alterations detected by direct sequencing in 35 of the 62 cases. These consisted of 26 polymorphisms and 17 mutations in exons or splice sites. Fifteen mutations were identified by both methods. Direct sequencing detected significantly more gene alterations (43 of 54) in DNA extracted from FFPE tissue than the p53 GeneChip (26 of 54; P = 0.018). However, if the changes in exon 4 were eliminated from this comparison, the p53 GeneChip detected 26 of 27 mutations compared with direct sequencing, which identified 16 of 27 mutations. (P = 0.016). CONCLUSIONS: A combination of oligonucleotide microarray and direct sequencing may be necessary to accurately identify p53 gene alterations in FFPE breast cancer. The p53 GeneChip cannot be used to detect exon 4 polymorphisms (codon 72) in FFPE breast cancer tissue.