基因组DNA甲基化的高效毛细管电泳定量检测

目的：建立快速准确的高效毛细管电泳（ HPCE ）定量基因组 DNA 甲基化的方法。方法以含有十二烷基磺酸钠（SDS）的碳酸氢钠溶液作为背景电解质溶液,优化运行电压、柱温,对DNA组成单元脱氧核苷酸进行分离定量。结果5种脱氧核糖核苷和5种核糖核苷在10 min 内实现基线分离。脱氧胞苷（dC）的标准曲线为Y ＝172540.15X-6.19,相关系数（R）为0.999,线性范围从2×10^-3 mol／L 到2×10^-1 mol／L。5-甲基脱氧胞苷（5 mdC）的标准曲线为 Y ＝170271.74X-46.19,相关系数（R）为0.995,线性范围从1×10^-4 mol／L 到2×10^-2 mol／L。日内相对标准偏差（RSD％）〈5％,日间相对标准偏差（ RSD％）〈9％。5 mdC 和 dC 的检测限均为1×10^-5 mol／L。样品的甲基化程度以（5 mdC ）含量占总脱氧胞苷（5 mdC ＋ dC ）的比率表示。应用本方法分析小牛胸腺 DNA 的甲基化水平,结果为6.18％,与本研究组所得液质联用（LC-MS／MS）的定量结果（6.77％）和文献报导中应用液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）的检测结果（6.26％）对比,一致性好。结论本研究建立的方法分析速度快,准确性高,稳定性好,灵敏度满足微量样本的检测需求,可以用于临床甲基化诊断。     

毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术测定甲氨蝶呤对映体耐药A549细胞株中叶酰聚谷氨酸合成酶

目的 为观察甲氨蝶呤(MTX)对映体诱导肺癌A549细胞株耐药后叶酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase,FPGS)含量变化,建立一种用毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术(CEIA-LIF)测定FPGS的方法,以便为深入探讨肿瘤耐药机制提供新的实验手段.方法 实验分别选用耐药浓度为25 μmol/L的L-(+)-MTX和D-(-)-MTX肺癌A549耐药细胞株,以MTX敏感的细胞株作对照,培养获取上述3株细胞,并粗提取FIGS做CEIA-LIF和免疫印迹(WB)实验;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记FPGS抗体,与提取的FPGS进行免疫反应;然后采用CEIA-LIF,根据不同分子量蛋白具有不同的迁移时间,分离检测标记蛋白,检测L广(+)-MTX和D-(-)-MTX作用耐药前后3株肺癌A549细胞株中FPGS表达含量;同时用WB作对照,以评价CEIA-LIF的特异性和FPGs定量的准确性.结果 CEIA-LIF分离标记FPGS抗体与免疫复合物的分离时间分别为7.1、8.9 min,分离度(R)=4.5,在10 min内即完成蛋白的分离和检测.经WB鉴定3株细胞液氮冻融裂解后离心提取液中组分与FPGS抗体无非特异性条带出现.CEIA-LIF测定敏感细胞株的检测下限为0.68 mg/μl细胞;而其检测25 μmol/L L(+)-MTX和25 μmol/L D-(-)-MTX诱导耐药细胞中FPGS的表达含量分别为对照组敏感细胞的46.59%和48.36%.结论 本研究建立的CEIA-LIF检测FPGS法具有高效快速的特点,且具与WB类似的特异性;同时提高了检测的敏感度.L-(+)-MTX和D-(-)-MTX诱导耐药后细胞株中FPGS表达含量较敏感细胞株明显减少,证明MTX耐药细胞株FPGS表达含量受损.     

MTX对映体耐药A549细胞株中EGFR基因mRNA的表达分析

【摘要】目的探讨表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）在氨甲喋呤（methotrexate，MTX）对映体L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX耐药A549细胞株中的表达。方法采用RT-PCR方法测定肺癌A549敏感细胞株和15p,moUL、35p,mol／L、55p,mol／L的L-（＋）-MTX和D-（-）-MTXA549耐药细胞株中EGFRmRNA表达情况。结果15μmol／L、35μmol／L、55μmol／LL-（＋）-MTXA549耐药细胞株中EGFR基因表达的mRNA相对含量分别为肺癌A549敏感细胞株的（1．55±0．26）倍、（1．86±0．13）倍、（1．20~0．05）倍。RT—PCR结果显示，A549敏感细胞株和L-（＋）-MTX各浓度A549耐药株均扩增出315bp条带，有EGFR基因表达，而3种浓度的D-（-）-MTX耐药细胞株中EGFR基因不表达。结论MTX诱导耐药后A549细胞株中EGFRmRNA发生变化，且在3种浓度两种对映体细胞株间具有明显的手性差异，MTX可能通过改变EGFR基因启动子的甲基化状态，影响EGFR的表达。     

DNA修复相关基因甲基化与肺癌A549细胞顺铂化疗耐药的相关性研究

目的探讨5-氮杂-2’脱氧胞苷（5-Aza-2’deoxycytidine,5-Aza—Cde）对顺铂耐药株肺癌A549／DDP细胞DNA修复相关基因hMLH1、MGMT基因启动子区DNA甲基化状态及其表达的影响。方法A549细胞（A549细胞组）、A549／DDP细胞（A549／DDP组）、A549／DDP细胞5、10、20μmol／L5-Aza—Cde组,分别采用甲基化特异性PCR检测细胞hMLHl、MGMT基因甲基化状态,反转录一PCR法检测用药前、后细胞hMLHlmRNA、MGMTmRNA表达情况。结果A549细胞组hMLHl基因呈非甲基化状态且高表达,MGMT呈部分甲基化状态且高表达,A549一DDP细胞组hMLHl、MGMT基因均呈高甲基化状态,mRNA表达下调,10、20μmol／L5-Aza—Cde组hMLHl和MGMT均呈非甲基化状态;A549／DDP细胞组、5μmol／L5-Aza—Cde组hMLHlmRNA与MGMTmRNA表达量均低于A549细胞组（P〈0．05）,20μmol／L5-Aza—Cde组与A549细胞组比较差异无统计学意义（P〉0．05）;10μmol／L5-Aza—Cde组MGMTmRNA表达量低于A549细胞组（P〈0．05）,hMLH1mRNA表达量与A549细胞组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论hMLHl、MGMT基因甲基化修饰程度与mRNA表达有一定相关性,hMLH1、MGMT基因甲基化可能是肺癌A549细胞对顺铂耐药的因素之一。     

实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达

目的 建立实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中FPGS mRNA表达的方法,研究MTX对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药细胞株中FPGS的基因表达差异,并用于观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGS mRNA表达水平的变化.方法 用SYBR Green Ⅰ为荧光染料,以β-actin作参照,建立检测FPGS mRNA的实时荧光定量PCR方法.根据Ct值、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价.并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的14例白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达.结果 建立的标准曲线Ct值与模板浓度有良好的线性关系,FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0.996 8和0.998 7,斜率分别为-3.595和-3.740,批内CV为1.27%～2.95%,批间CV为3.82%;熔解曲线均呈单个特异峰,扩增效率相似(斜率为0.021 7);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞中FPGS mRNA相对含量分别为(3.51±0.66)和(0.16±0.01),A549亲本细胞(S)中FPGS mRNA相对含量为(1.00±0.31),差异有统计学意义(F=64.45,P＜0.01);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞间FPGS mRNA相对含量差异有统计学意义(q=9.29,P＜0.01).白血病患者应用MTX治疗耐药后,FPGS mRNA表达水平为(0.35±0.04),用药前为(1.00±0.44),差异有统计学意义(t=8.83,P＜0.01).结论 建立的实时荧光定量PCR检测FPGS mRNA的方法重复性好、特异度高,可用于FPGSmRNA含量分析.MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA表达发生了变化,MTX 2种对映体形式在细胞耐药机制中可能发挥了不同的作用.     

Luminex液相芯片技术测定氨甲喋呤对映体耐药A549细胞株中磷酸化酪氨酸激酶受体

目的 探讨氨甲喋呤(MTX)对映体诱导的耐药A549细胞株中磷酸化酪氨酸激酶受体(RTKs)的表达差异及受体间的相关性.方法 用MTX对映体浓度递增结合低剂量持续诱导肺腺癌A549细胞株,用Luminex液相芯片技术检测L-(+)-MTX/A549细胞、D-(-)-MTX/A549细胞和亲本A549细胞3组细胞中7种磷...     

氨甲蝶呤对映体获得性耐药A549细胞株二氢叶酸还原酶基因表达分析

摘要：目的：研究氨甲蝶呤(MTX)对映体［L-(＋)-MTX和D-(-)-MTX］耐药与二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达的关系。 方法：用浓度递增结合低剂量持续诱导法获得A549细胞对不同构型及不同浓度的MTX对映体的耐药细胞株,荧光定量PCR检测耐药细胞株中DHFR基因的相对含量。 结果：对两种不同对映体的获得性耐药存在差异,D型耐药细胞耐药指数高于L型;对映体各浓度耐药细胞间耐药指数也有差异。15 μmol/L L型、D型MTX首次诱导耐药细胞的DHFR相对含量低于亲本细胞,对该浓度对映体耐药的各细胞组间没有差别（P＞0.05）。35~45 μmol/L浓度耐药细胞的DHFR相对含量增加,45 μmol/L D型耐药细胞DHFR相对含量高于对应浓度L型耐药细胞,差异有显著性(P<0.05)。 结论：首次诱导MTX耐药以抑制DHFR基因为主。DHFR基因表达具有手性差异。DHFR基因的检测有望作为肿瘤治疗监测的指标。     

miR-9-3在慢性淋巴细胞白血病中的功能与调控机制

目的 探讨microRNA-9-3(miR-9-3)在慢性淋巴细胞白血病中的作用及调控机制。方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测8例正常人骨髓组织和外周血、78例新确诊慢性淋巴细胞性白血病患者骨髓组织和7种白血病细胞系的甲基化水平; 采用Western blot技术检测甲基化阳性白血病细胞株的NF-κB1信号转导通路活化水平。结果 正常对照组miR-9-3启动子呈非甲基化状态; 7种白血病细胞株中只有I83-E95和WAC3CD5+两种细胞株种呈非甲基化状态(MSP阳性率为28.6%); 78例慢性淋巴细胞性白血病患者中65例发生miR-9-3甲基化(MSP阳性率为83%)。去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza2'Dc)处理后的I83-E95和WAC3CD5+细胞株miR-9-3均处于去甲基化状态。结论 慢性淋巴细胞性白血病患者存在miR-9-3异常甲基化,可能导致癌细胞异常增生; miR-9-3去甲基化可抑制NF-κB1信号通路活化,表明miR-9-3可能可以通过该通路抑制癌细胞凋亡,引发患者疾病恶化; 甲基化的白血病细胞株可被去甲基化药物抑制,因此miR-9-3可以作为治疗慢性淋巴细胞白血病的新基因靶点。     

A549/MTX对映体耐药细胞的裸鼠荷瘤模型的建立

目的利用L型和D型氨甲喋呤（MTX）对映体分别建立人肺腺癌A549细胞株裸鼠耐药模型,为进一步揭示MTX对映体体内活性差异的原因提供实验平台。方法裸鼠皮下分别接种A549、耐药细胞株A549/L-MTX、A549/D-MTX各6×10^6个/0.2ml,观察肿瘤生长特性;瘤体原代培养后四甲基偶氮唑兰（MTT）法检测耐药指数（resistance index RI）;免疫组化（IHC）检测ki-67、多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein1,MRP1）、survivin变化。结果从肿瘤生长曲线上看瘤体积三者差异有统计学意义（P〈0.05）,A549/L-MTX/nude组体积更小。A549/L-MTX/nude移植瘤RI为4.9,为低度耐药,A549/D-MTX/nude移植瘤RI为14.5,为中度耐药。A549/L-MTX/nude相关蛋白总体表达低于A549/D-MTX/nude,两者表达差异有统计学意义（P均〈0.05）。结论成功建立对MTX两种对映体耐药的A549细胞株裸鼠肿瘤模型,且两种耐药细胞具有不同耐药特性,为研究MTX对映体体内抗肿瘤活性差异提供了较好的实验平台。     

5-杂氮-2’-脱氧胞苷对人HL-60细胞DAPK基因表达的影响

本研究旨在观察甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2＇-deoxycytidine,5-aza-2dC）对人急性髓系白血病细胞株HL．60凋亡及死亡相关蛋白激酶（deathassociatedproteinkinase,DAPK）基因表达的影响,探讨5-aza-2dC治疗AML的作用机制。不同浓度的5-aza-2dC处理HL-60细胞后,采用瑞式染色法观察5-aza-2dC对HL-60细胞形态的影响,流式细胞术检测5-aza-2dC对HL-60细胞凋亡的影响,RT—PCR法检测5-aza-2dC对HL击0细胞DAPK基因表达的影响。结果表明,①5-aza-2dC呈浓度依赖性地促进HL-60细胞凋亡;②经5-aza-2dC处理后,HL-60细胞DAPK基因表达水平较处理前呈剂量依赖性地增加。结论：随着5-aza-2dC作用浓度的增加,HL-60细胞的凋亡率及DAPK基因表达水平均逐渐增加,提示DAPK基因可能是5-aza-2dC诱导HL-60细胞凋亡的调控基因之     

柱上样本堆积毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤及其六种代谢产物

目的 建立柱上堆积高效毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤(MTX)及其6种代谢产物氨甲蝶呤多聚谷氨酸链( MTXPG)的方法.方法 采用高效毛细管电泳技术,以75 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.40)作为分离介质,用水和乙腈( V/V=1∶1)作溶剂重组残留样本的方法进行柱上样本堆积,0.5 psi压力进样,进样...     

沉默Par-4基因表达可抑制肺泡上皮细胞凋亡

目的 研究促凋亡基因Par-4沉默对氧化应激导致的肺泡上皮细胞凋亡的影响.方法 培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞.利用过氧化氢诱导细胞凋亡.利用小RNA干扰(siRNA)技术,靶向诱导Par-4基因沉默.设立正常对照组(常规培养细胞)、过氧化氢组(1.0 mmol/L过氧化氢处理细胞)、过氧化氢+Par-4-siRNA组(1.0 mmol/L过氧化氢和Par-4-siRNA转染的细胞).设非抑制序列转染的对照组.流式细胞术测定各组细胞凋亡百分率.Western blot检测促凋亡基因Smac蛋白表达量.凝胶迁移率改变试验测定转录因子E2F1的DNA结合力.比色法检测Caspase-3酶活性.实验结果采用单因素方差分析(F检验和g检验).结果 过氧化氢+Par-4-siRNA组细胞凋亡百分率(29.7±2.3)%显著低于过氧化氢组(54.2±4.1)%,q=8.91,P＜0.01.Par-4-siRNA的转染显著抑制过氧化氢诱导的肺泡上皮细胞中Smac蛋白表达、E2F1DNA结合力和caspase-3活性上调.结论 采用siRNA诱导Par-4基因沉默,可减少氧化应激导致的肺泡上皮细胞凋亡.其分子机制可能和抑制Smac蛋白表达、抑制E2F1 DNA结合力和抑制caspase-3活性有关.

Abstract：

Objective To investigate the effects of Par-4 gene silence on hydrogen peroxide-induced apoptosis in alveolar epithelial cells. Method The alveolar epithelial cells A549 were cultured and exposed to hydrogen peroxide. The siRNA sequences targeted Par-4 gene was chemically synthesized and transfected to A549 cells with or without the exposure of hydrogen peroxide. The cells were divided into normal control groups, hydrogen peroxide-treated group(The cells were treated with 0. 1 mmol/L hydrogen peroxide), hydrogen peroxide and Par-4-siRNA-treated group(The cells were treated with 0. 1 mmol/L hydrogen peroxide after transfection of Par-4-siRNA), Non-specific DNA sequence transfection control group. The apoptosis of A549 cells was quantified by flow cytometry. The expression of Smac protein was detected by Western blot.Electrophoretic mobility shift assay was applied for evaluating the change of E2F1 DNA binding activity. Relative activity of Caspase-3 was detected by clolorimetric assay. Results The percent of apoptotic cells in hydrogen peroxide and Par-4-siRNA-treated group was (29.7 ± 2.3) %, which was significantly lower than that of hydrogen peroxide-treated group [(54.2 ± 4.1)%, q= 8.91, P ＜ 0.01)]. Par-4 siRNA could significantly suppress the increase of Smac protein, E2F1 DNA binding activity and caspase-3 activity induced by hydrogen peroxide in A549 cells. Conclusions Par-4 gene silence induced by siRNA might inhibit the apoptosis of alveolar epithelial cells, which might be resulted from suppression of the up-regulation of Smac gene expression, E2F1 DNA binding activity and caspase-3 activity.     

丙戊酸钠对Molt-4细胞增殖的影响及其作用途径探讨

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对人急性T细胞白血病细胞系Molt-4细胞增殖和细胞周期的影响,并探讨其对Molt-4细胞p15INK4B基因甲基化状态的影响.方法 不同浓度VPA作用Molt-4细胞后,用MTr法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期的变化,半巢式甲基化特异PCR(MSP)法检测p15INK4B基因甲基化状态,RT-PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMrT3B mRNA的表达.结果 VPA可明显抑制细胞增殖,影响Molt-4细胞周期分布,5.0mmol/L VPA作用Molt-4细胞48 h,G0/G1期细胞为(66.87±3.31)%,S期细胞为(8.47±2.56)%,与未加VPA组相比,S期细胞明显下降,G0/G1期细胞明显升高(P＜0.05).经VPA作用后Molt-4细胞p15基因甲基化程度明显下降,p15基因表达水平明显增加,DNMT-1、DNMT3B mRNA表达水平下降,以DNMT-1下降较明显.结论 VPA可能通过抑制甲基转移酶DNMT-1和(或)DNMT3B表达使p15INK4B基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制Molt-4细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期.     

HO-1基因表达对伊马替尼耐药的慢性髓系白血病细胞增殖的影响

目的 通过氯高血红素(Hemin)诱导伊马替尼耐药慢性髓系白血病(CML)细胞株K562/A02-IM 中血红素加氧酶-1(HO-1)基因表达,探讨HO-1基因对伊马替尼耐药CML细胞增殖的影响,为治疗CML多药耐药及新药的开发提供思路和实验依据.方法 采用RT-PCR法检测20例CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞中HO-1基因的表达,半定量RT-PCR法和Western blot法分别检测不同剂量Hemin处理K562/A02-IM细胞不同时间后HO-1的表达,通过Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况,采用MTT法检测Hemin诱导及锌原卟啉抑制HO-1表达与细胞存活率的关系.结果 RT-PCR结果显示耐药患者骨髓细胞中HO-1基因阳性表达,半定量RT-PCR和Western blot法显示,不同浓度的Hemin(0、10、20及40 μmol/L)处理K562/A02-IM细胞16 h后,HO-1的表达量随Hemin浓度的升高而增加,存在剂量依赖关系,而20 μmol/L Hemin分别处理K562/A02-IM细胞0、8、16、24 h后,HO-1的表达肇在处理16 h组最高.Annexin V/PI法检测显示,0、10、20及40 μmol/L Hemin作用于K562/A02-IM细胞16 h后细胞凋亡率分别为(17.61±0.01)%、(12.13±0.11)%、(7.94±0.03)%和(4.62±0.15)%,其抗凋亡的作用呈剂量依赖性;20 μmol/L Hemin作用K562/A02-IM细胞8、16及24 h的细胞凋亡率分别为(14.72±0.05)%、(8.15±0.07)%和(16.37±0.13)%.MTT法检测显示与对照组相比,Hemin诱导K562/A02-IM细胞HO-1基因表达促进了细胞的增殖,且作用存在剂量依赖关系;而锌原卟啉抑制HO-1的表达,促进了细胞的凋亡(P<0.05).结论 CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞HO-1基因阳性表达,HO-1 是一种可诱导表达型基因,具有抗细胞凋亡及促进细胞增殖的作用,抑制HO-1 表达可能成为治疗CML耐药的新方法.

Abstract：

Objective To investigate the effect of heme oxygenase-1 (HO-1 ) expression on cell growth and apoptosis in imatinib resistant chronic myeloid leukemia (CML) cells ( K562/A02-IM) , and explore the relationship between HO-1 gene and CML. Methods The expression of HO-1 in 20 drug-resistant CML patients was detected by RT-PCR. Different concentrations of hemin were used to induce HO-1 expression of K562/A02-IM, HO-1 expression at different time was detected by RT-PCR and Western blot analysis. Cell apoptosis was detected by Annexin V/PI staining, and MTT assay was used to detect viability of K562/ A02-IM cells after induction or inhibition of HO-1 gene by hemin and zinc protoporphyrin (ZPP). Results RT-PCR showed that HO-1 was expressed in the bone marrow mononuclear cells (BMMNCs). When treated with hemin at different concentrations (0, 10, 20, 40 μmol/L) for 16 h, the expression of HO-1 in K562/ A02-IM was increased in a dose-dependent manner, and peaked at 20 μmol/L of hemin for 16 h. The apoptosis rates were (17.61 ±0.01)%, (12. 13 ±0.11)%, (7.94 ±0.03)% and (4.62 ±0. 15)% at 0,10, 20 and 40 μmol/L of hemin respectively for 16 h and were (14. 7 ± 0.05) % , (8. 1 ± 0. 07) % and (16. 3 ± 0. 13)% at 20 μmol/L of hemin treatment for 8,16, and 24 h respectively. Hemin induced apoptosis of K562/A02-IM cells in a dose-dependent manner. The expression of HO-1 was induced in K562/A02-IM cells in a dose-dependent manner, and the survival of K562/A02-IM cells was significantly increased as compared to that of control group. When HO-1 was inhibited by ZPP, the cells survival was sharply decreased compared to that of the control group (P<0.05). Conclusion HO-1 was expressed in the BMMNCs. It is a kind of molecules whose expression can be induced and can promote the growth of drug-resistant cells. Inhibition of HO-1 expression probably be used for the treatment of drug-resistant CML.     

DNA工作站在HLA测序分型中的应用

目的 建立从全血样本中高通量提取基因组DNA的方法,以应用于HLA常规测序分型.方法 采用DNA工作站及2 ml深孔板,从400份全血样本中提取基因组DNA.用紫外分光光度仪测定其浓度和A<,260>/A<,280>值,并采用琼脂糖电泳检测DNA的完整性.扩增产物经纯化后作为测序模板,产物经酒精/EDTA/NaOAc法纯化,用ABI Prism<'TM>3730测序仪电泳检测.相关的分析软件分析HLA基因型.结果 使用400μL全血中400份样本的DNA产量平均为(3.217±0.715)μg,A<,260>/A<,280>值平均为1.710±0.103;琼脂糖电泳表明DNA的分子量均大于15×10<'3>;HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1座位序列碱基峰高均在2000以上,测序评分在75分以上.48份HLA-A、B和DRB1基因型已知的室内质控样本,经本文的方法提取DNA并进行HLA基因分型,经盲检质控检测,所得到的结果与已知的HLA基因型相一致.结论 采用本方法所提取的DNA能稳定、可靠地应用于骨髓捐献者样本的HLA-A、B和DRB1座位测序分型,具有快速、高通量化的特点和广泛的应用前景.     

TNF-α基因多态性与老年2型糖尿病的关系研究

目的研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因多态性与老年2型糖尿病的关系。方法利用DNA测序法对65例老年2型糖尿病患者及35例正常对照者的TNF-α基因-308位点和-238位点进行基因多态性分析。结果2型DM组FPG、TNF-α、甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）分别为（11.57±2.16）nmol/L、（2.97±0.24）ug/L、（2.43±1.15）mmol/L、（5.49±1.63）mmol/L、（1.23±0.28）mmol/L,高于对照组,差异有统计学意义（t分别=14.95、12.64、3.90、4.29、-8.40,P均〈0.05）,而BMI与对照组比较,差异无统计学意义（t=1.56,P〉0.05）。TNF-α基因-308位点在患病组中变异的G/A基因型频率为21.7%,与对照组组间比较,差异有统计学意义（t=12.89,P〈0.05）,而-238位点未见突变在两组之间比较差异无统计学意义。结论TNF-α基因G-308A单核苷酸多态性与老年2型糖尿病存在相关性。