小鼠白蛋白增强子在肝癌细胞系中无增强功能

目的：鉴定小鼠白蛋白增强子序列在肝癌细胞系中对白蛋白启动子转录活性的影响。方法：以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因，将小鼠白蛋白增强子序列(-10．21～-8．43kb)之间的不同区段与白蛋白启动子相融合，转染不同组织来源细胞系，用荧光显微镜和流式细胞仪分别对GFP的表达情况进行分析。结果：瞬时转染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，上游的不同增强子区段均不能增强白蛋白启动子的转录活性，相反，它们都不同程度地下调了启动子的转录活性；稳定转染期，E1E3能极弱地增强启动子的转录活性。稳定转染人肝癌细胞系HepG2，上游的不同增强子区段均能抑制白蛋白启动子的转录活性，导致报告基因不能表达。在非肝脏组织的细胞系中，小鼠白蛋白启动子无转录活性。结论：只使用白蛋白启动子在肝癌细胞系中表达目的基因较同时使用白蛋白启动子和增强子效果会更好。     

ST8SiaV基因启动子的克隆及功能鉴定

目的：克隆ST8SiaV基因启动子及构建ST8SiaV基因启动子-pGL3-Basic-GFP表达栽体，并对该栽体进行功能鉴定。方法：①基于NCBI公布的大鼠基因组ST8SiaV基因序列，以SD大鼠肝基因组DNA为模板，采用PCR方法，扩增ATG起始密码子上游1．7kb片段。②分离、纯化PCR产物，与pMD 18-T栽体相连，构建克隆栽体，转化大肠杆菌(DH5α)，筛选阳性克隆并测序。③启动子片段进行SacⅠ和Bg2Ⅱ双酶切，克隆进pGL3-Basic质粒载体。为探索该基因在神经干细胞分化过程的活体表达，将pGL3-Basic的luciferase报告基因替换为GFP，构建成promoter-pGL3-Basic-GFP表达栽体。④将构建的表达载体电转染SD大鼠神经干细胞，对该表达载体进行生物学功能鉴定。结果与结论：成功地克隆到1．7kb的具有生物学活性的ST8SiaV基因启动子，并构建了适于活体研究的promoter-pGL3-Basic-GFP表达栽体，为进一步研究该基因的启动子区转录及调控作用奠定了基础。     

LRP16基因启动子的克隆及荧光素酶报道重组子的构建

目的：克隆LRP16基因启动子及构建LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。方法：（1）以LRP16基因全长作为探针，在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载LRP16基因5′端3kb基因组DNA序列。（2）以健康献血员基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段，将分离纯化的PCR产物用T4DNA连接酶与pGEM-T Easy载体相连，转入JM109感受态化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序，进行Kpn I和BamH I双酶切和巢式PCR鉴定。（3）将LRP16启动子－pGEM-T Easy载体再次酶切，纯化回收鉴定过的目的DNA片段，构建LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。结果与结论：长度为2．7kb的LRP16基因启动子克隆成功，并构建了LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。充分利用因特网上人类基因组数据库的生物信息资源，搜索已知基因的启动子序列，可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定

目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR) 164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.     

人类管家基因和非管家基因microRNA绑定密度的比较及与3′UTR进化保守性关系的分析

目的：该研究从整体水平比较microRNA（miRNA）对管家基因和非管家基因的调控差异并研究3′UTR的进化保守性与miRNA对两类基因调控差异之间的相关性。方法通过对3个基于序列的miRNA靶基因预测软件整合分析,并结合基于miRNA-靶基因的表达谱数据相关性分析,以获得miRNA对两类基因的调控情况,同时利用phastCons保守性分值对两类基因的3′UTR区域进行多物种进化分析。结果研究发现miRNA在管家基因的3′UTR上有显著地高密度绑定,管家基因的3′UTR区域具有相对较高的序列保守性。结论该研究结果突出了miRNA对管家基因表达调控的重要作用,对于重新理解miRNA对真核生物基因表达调控作用具有一定的参考价值。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析

目的：克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法：以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据，设计并合成D123／D61和D81／D84两对引物，同时从猪肝中提取猪基因组DNA，并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针，对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选，从噬菌体文库中共获得4个基因片段，并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因，对猪血清白蛋白启动子在Hep(泛细胞中的表达进行研究。结果：共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号：AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对，发现基因的同源性为53.8％，其中编码区同源性为82．3％。荧光显微镜下可见EGFP在HepC2细胞中的表达。结论：获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepC2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础，另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。     

VEGF-C基因3′端未翻译区对荧光素酶表达的影响

目的构建小鼠血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因3′端未翻译区(3′UTR)的荧光素酶表达载体,利用双荧光报告系统观察VEGF-C基因3′UTR对荧光素酶基因表达的影响。方法通过PCR分别扩增小鼠Lewis肺癌细胞VEGF-CcDNA全长3′UTR(429bp)和一段312bp的编码区序列(CR),采用基因工程方法将PCR产物克隆至pTA2克隆载体,随后再亚克隆至荧光素酶报告基因载体(pGL3-Promoter)荧光素酶编码基因下游的XbaⅠ酶切位点,使用LipofectamineTM2000真核转染小鼠Lewis肺癌细胞,化学发光法检测荧光素酶的活性,定量RT-PCR检测荧光素酶mRNA水平。结果PCR成功扩增出与预期长度相符的小鼠VEGF-CCR(312bp)和VEGF-C3′UTR(429bp)。经酶切、测序鉴定,小鼠VEGF-C基因3′UTR和CR均插入到pGL3-Promoter的XbaⅠ位点,插入序列碱基组成和插入方向均正确,获得载体pGL3-VEGF-C3′UTR和pGL3-VEGF-CCR。荧光素酶报告系统和定量RT-PCR检测显示,与pGL3-Promoter组比较,pGL3-VEGF-C3′UTR转染组荧光素酶活性和mRNA水平均显著降低,而pGL3-VEGF-CCR组与pGL3-Promoter组之间无显著性差异。结论VEGF-C基因3′UTR可以抑制荧光素酶的表达。     

hTERT启动子调控caspase 3基因的特异性表达及其抑癌作用

目的：探讨端粒酶催化亚基(KFERT)启动子调控caspase3(半胱天冬酶-3)基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中表达的特异性及在体内外的抑癌作用。方法：构建hTERT启动子调控的caspase3基因的真核表达载体，通过RTPCR、瞬时转染、MTT法、流式细胞术和动物实验方法，检测hTERT启动子调控caspase3基因表达对肿瘤细胞生长的影响。结果：hTERT启动子调控caspase3基因在端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2中有明显表达，而在正常人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast，HEL)中未见表达；caspase3表达能对端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549细胞的增殖产生明显抑制作用，抑制率为10．5％-37．9％；同时也可以诱导HepG2、HeLa、Glc和A549细胞发生凋亡，凋亡率为15．39％-35．19％；而对端粒酶阴性的正常细胞HEL没有明显的影响。动物实验结果显示，hTERT启动子调控的caspase3基因转染对HepC2细胞的体内增殖具有抑制作用。结论：hTERT启动子调控的caspase3基因表达载体是一种有应用潜力的肿瘤基因治疗载体。     

人ID4基因启动子及上游顺式表达调控元件的克隆及特征分析

目的克隆人ID4基因启动子及上游顺式调控元件,并对其结构及调控元件的特征进行生物信息学分析。方法从NCBI人类基因组数据库中截取ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列。利用TESS和Genomax等在线分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析。设计PCR引物,采用分段扩增法,获得长度分别为1811bp和650bp的两条产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆。先后应用KpnⅠ/NheⅠ、KpnⅠ/EcoRⅠ对获得的两个pGEM-T重组载体及pGL3Basic荧光素酶报告载体进行双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,最后测序鉴定。结果获得长度为2461bp的ID4基因启动子DNA序列,经测序证实与人类基因组序列一致。ID4基因具有Ⅱ型启动子特征,有2个非常显著的上游元件(TATA盒和GC盒),GC含量占总碱基含量的65.9%。在转录起始位点上游-1000bp与下游212bp之间分别存在多个可能具有正向和负向调控作用的顺式元件。结论成功克隆了人ID4基因启动子及其顺式调控元件,并...     

HBV启动子对肝细胞具有特异性转录活性的研究

目的：探讨HBV转录调控核心序列在肝细胞中转录的活性。方法：构建HBV增强子和启动子调控的荧光素酶报告栽体，用脂质体转染法将其转染肝细胞和非肝细胞，双荧光素酶报告基因试验检测其在不同细胞中的转录活性。结果：HBV启动子在2、2.15细胞中转录活性最高，在其他肝细胞中的转录活性显著高于非肝细胞。结论：由HBV启动子构建的载体可能是一种新颖的有前景的靶向性肝癌细胞基因治疗栽体。     

miR-193b在HepG2细胞中下调K-Ras蛋白表达

目的探讨microRNA-193b（miR-193b）在HepG2细胞中对K-Ras蛋白表达的调控作用。方法 Tar-getScan软件预测获得miR-193b调控候选靶基因K-ras;构建包含预测miR-193b作用靶位点的K-rasmRNA3′UTR野生型和突变型荧光素酶报告基因载体pGL-KRAS和pGL-Mu-KRAS,检测转染HepG2细胞的荧光素酶活性;合成miR-193b的dsRNA,转染HepG2细胞,实时定量PCR和Western印迹检测对K-rasmRNA和蛋白表达的影响。结果与结论 miR-193b可以与K-rasmRNA3′UTR结合。在HepG2中,miR-193b在mRNA和蛋白水平下调K-ras基因表达。     

增强型RACE技术克隆辐射诱导小鼠肠上皮新基因RS1

目的 在获得了辐射诱导小鼠肠上皮新基因RS1 EST序列的基础上获得全长cDNA。方法RT-PCR方法对RS1基因进行表达谱分析，找到表达丰度较高的组织提取总RNA作为模板，应用增强RACE技术即结合生物素探针富集靶cDNA的方法克隆RS1的cDNA末端。结果克隆到RS1片段3′端约2kb的序列。该序列5′端包含已知的RS1片段，3′端具有明显的polyA加尾信号，有编码区的终止密码子。明确了RS1的正、负链及其蛋白编码方向，为RS1 5′端的克隆提供了必要信息。结论 结果与本实验的设计完全一致，说明这一方法对从表达丰度低，难以设计最佳基因特异性引物的EST序列克隆其对应的全长cDNA是可行的，同时为下一步研究RS1在小鼠肠上皮辐射应激反应中的作用和被辐射诱导表达的调控模式奠定了基础。     

噬菌体展示技术筛选诱导型NOS基因启动子DNA结合蛋白的研究

目的筛选诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子DNA结合蛋白。探索iNOS基因的表达调控机制。方法应用生物信息学方法确定iNOS基因启动子序列，以PCR扩增iNOS基因启动子DNA片段，构建真核报告载体pcAT3-iNOSp，并转染HepG2细胞系，用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性以明确所得到的DNA片段具有启动子活性；以iNOS基因启动子片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附一洗脱一扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，进行【)NA序列分析和蛋白质同源性生物信息学搜索。结果pCAT3-iNOSp瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的4．2倍，说明所得到的DNA片段具有启动子活性；噬菌体经富集后，筛选出12个阳性克隆，成功获得了iNOS基因启动子的DNA结合蛋白编码序列。结论所构建的iNOS基因启动子具有顺式激活下游基因表达的作用；筛选得到的iNOS启动子DNA结合蛋白对于研究iNOS基因的转录调节机制具有重要意义。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5''''端调控序列功能分析

目的克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析.方法以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84 两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选.经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接.以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究.结果共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35 kb(GenBank登录号AY663543).将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%.荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达.结论获得猪血清白蛋白全基因.猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能.此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料.     

核因子kB与肝损伤

核因子(nuclear factor kappa B，NF-kB)是1986年由Sen和Baltimore首次发现的转录调控因子，因其能与B细胞中免疫球蛋白K氢链增强子结合并具有结构性转录激活活性而被命名。它能同许多基因的启动子及增强子中的kB序列结合，从而启动或增强这些基因的转录。     

人Toll样受体4基因5’远端增强子样区定位及反式作用因子鉴定

目的 对人Toll样受体4(TLR4)基因5′远端增强子样区进行定位,并鉴定参与其转录调控的反式作用因子.方法 采用PCR克隆方法,将TLR4基因5′旁侧-1337～-683序列及其缺失片段与荧光索酶报告基因载体pGL-3-promoter进行重组,构建pGL-3 -1337～- 683-promoter重组质粒及其系列缺失质粒.将构建成功的质粒转染人人白血病K562细胞,检测各质粒的荧光素酶活性,根据缺失序列对荧光素酶活性的影响来确定TLR4基因5′远端增强子样区的位置.采用转录因子数据库检索和电泳迁移率实验(EMSA)两种方法对TLR4基因5′远端增强子样区反式作用因子进行鉴定.结果 TLR4基因5′远端增强子样区位于-923 ～-679的245bp范围内,并再细化为-923 ～ -742和-721 ～-679两个功能单元.EMSA和转录因子数据库检索证实激活蛋白-1(AP1)是与-721 ～-679功能单元结合的转录因子,淋巴增强因子-1(LEF-1)可能是与该功能单元结合的另一个转录因子.结论 TLR4基因5′远端增强子样区中的一个功能单元定位在-721～ -679的43bp片段中,AP1是与该区域结合的反式作用因子,可能与LEF-1共同起到转录增强作用.     

稳定转染COL1A1-EGFP基因的ROS17/2.8细胞株的建立

目的 构建稳定表达由COL1A1启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的ROS17／2．8细胞株。方法 用PCR方法从大鼠基因组DNA中扩增出长为3．6Kb的COL1A1(Ⅰ型胶原α1链基因)启动子,并克隆到T载体;然后将COL1A1启动子分段酶切,获得不同长度的启动子片段;与报告基因EG—FP相连接,构建成真核表达载体;随后转染ROS17／2．8细胞系,再用G418筛选。结果 得到了稳定转染COL1A1-EGFP基因的ROS17／2．8细胞株。结论 这些细胞株的建立为研究微重力对COL1A1启动子活性及成骨相关基因表达的影响奠定基础。     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因转染胃癌GC9811细胞的功能研究

通过RT—PCR从BALB／c小鼠腹腔巨噬细胞扩增出编码小鼠α1，3—半乳糖基转移酶基因的全长cDNA并构建其真核表达载体pCDNA3．1／V5—HisAα1，3GT，pCDNA3.1／V5-HisAα1，3GT通过脂质体转染胃癌GC9811细胞，使胃癌细胞表达Galα(1，3)Gal糖表位，G418筛选2个月内的阳性克隆，RT—PCR鉴定转染细胞，间接免疫荧光染色检测转染真核表达载体的癌细胞Galα(1，3)Gal的表达，利用人体血清内针对Galα(1，3)Gal糖表位的天然抗体对癌细胞进行杀伤。结果表明，成功构建了α1，3—半乳糖基转移酶基因真核表达载体，转染α1，3—半乳糖基转移酶基因的癌细胞高表达Galα(1，3)Gal糖表位，人血清对表达该表位的癌细胞具有杀伤作用。     

E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白启动子的构建及活性测定

目的：构建含有E-钙黏蛋白（cadherin）基因和N-钙黏蛋白基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测E-钙黏蛋白启动子和N-钙黏蛋白启动子的活性。方法利用PCR技术从乳腺癌细胞ZR75-1基因组中扩增出E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白启动子片段,插入到荧光素酶报告基因载体pGL4-basic中,确定所扩增的DNA序列后,将其转染至乳腺癌细胞ZR75-1和肝癌细胞HepG2中,检测启动子的活性。结果测序结果表明,扩增的E-钙黏蛋白启动子序列正确;荧光素酶活性实验表明,E-钙黏蛋白启动子和N-钙黏蛋白启动子在乳腺癌细胞ZR75-1和肝癌细胞HepG2中表达都具有活性。结论成功构建了E-钙黏蛋白启动子和N-钙黏蛋白启动子报告基因表达载体,为进一步筛选调节E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白表达的转录因子提供了重要基础。     

人铜锌超氧化物歧化酶基因启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体的构建及表达

目的 构建人铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn SOD,SOD1)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,并对其功能进行鉴定,为研究细胞内SOD1基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法 提取人基因组DNA,FCR扩增SOD1 5'非编码区启动子序列(-1 499- +17);采用基因重组技术构建由SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,将该载体瞬时转染Hella细胞,观察静息或佛波酯(PMA)刺激下红色荧光蛋白表达,以检测SOD1启动子的转录活性及其基凶表达.结果 酶切和DNA测序证明所构建红色荧光蛋白报告基因载体正确;该表达载体静息状态下在Hella细胞表达少量红色荧光蛋白,经PMA刺激后,能够表达较多高亮度的红色荧光蛋白.结论 成功构建了SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,其对相关刺激有很好的反应,可用于SOD1基因表达信号调控机制的研究.