以活性复合真皮基质为载体构建组织工程皮肤的研究

目的 构建含活性真皮基质的组织工程皮肤. 方法将人成纤维细胞(Fb)与Ⅰ型牛胶原混合接种于猪脱细胞真皮基质(PADM)的表面,构建活性真皮替代物.其上接种人表皮细胞进行气-液面培养,获得组织工程皮肤,进行组织学观察. 结果 Fb在胶原内结构完整,与PADM形成复合真皮基质.所构建的组织工程皮肤表皮层结构与人正常皮肤相似,具备基底层、棘层、颗粒层和角质层,细胞之间有桥粒连接,细胞分化良好. 结论 Fb-胶原-PADM真皮替代物可作为较好的构建组织工程皮肤的真皮支架.     

米非司酮抑制人子宫内膜基质细胞增殖

目的在改良子宫内膜细胞原代分离培养方法的基础之上,探讨米非司酮对原代分离培养的人子宫内膜基质细胞增殖的抑制作用。方法利用改良后的"二次消化法"分离培养增殖期人子宫内膜基质和上皮细胞,进行细胞形态学观察,并通过流式细胞术检测人子宫内膜基质和上皮细胞的波形蛋白和角蛋白表达阳性的细胞比率,计算分离培养的基质和上皮细胞的纯度;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测米非司酮对原代分离培养人子宫内膜基质细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果原代分离培养的基质细胞较上皮细胞生长迅速。流式细胞检测结果显示,分离培养的基质细胞波形蛋白阳性率达97%,上皮细胞角蛋白阳性率达90%。米非司酮处理人子宫内膜基质细胞2d或3d后,结果均显示,随着米非司酮浓度增加,基质细胞的细胞抑制率(IR)逐渐升高。米非司酮作用基质细胞2d后,50和100μmol/L组的IR值均高于对照组,差异均具有统计学意义(P0.05);米非司酮作用3d后,25、50和100μmol/L组的IR值均高于对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。通过对IR值进行直线回归分析,结果表明:米非司酮处理2d和3d对原代人子宫内膜基质细胞的IC50分别为52.85μmol/L和86.46μmol/L。结论改良后的"二次消化法"可获得高纯度人子宫内膜基质细胞和上皮细胞。米非司酮对原代人子宫内膜基质细胞有抑制作用,并呈时间和剂量依赖效应。     

缺氧环境下miR-7851-3p可能通过抑制Wnt8b表达调控子宫内膜腺上皮细胞增殖

目的 探究缺氧环境下影响子宫内膜腺上皮细胞增殖的潜在机制。方法 分别在常氧和缺氧条件下(1%氧浓度)培养子宫内膜腺上皮细胞,提取RNA,高通量测序分析两种状态子宫内膜腺上皮细胞微小RNAs(microRNAs, miRNAs)的差异表达,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)对差异表达的miRNA进行验证;通过Targetscan网站分析差异显著的miRNAs与增殖相关的靶基因,采用Western blot检测Wnt8b蛋白的表达。细胞计数(CCK8)检测正常和缺氧条件下培养子宫内膜腺上皮细胞之间的细胞增殖的情况。结果 miRNA高通量测序结果显示缺氧条件下miR-7851-3p、miR-125a-3p和miR-141-5p等16个miRNAs在子宫内膜腺上皮细胞中表达升高,qPCR检测结果显示缺氧环境下子宫内膜腺上皮细胞的miR-7851-3p的表达显著升高(P<0.001)。靶基因预测结果显示Wnt8b是miR-7851-3p潜在靶基因,而在缺氧环境下子宫内膜腺上皮细胞的Wnt8b蛋白表达降低。CCK8检测结果显示缺氧条件下子宫内膜腺上皮细胞增殖能力降低,尤其在培养36 h时差...     

子宫内膜异位症和腺肌症患者子宫内膜雌激素受体的时空表达

目的　研究子宫内膜异位症和子宫腺肌症子宫内膜各种细胞中雌激素α和 β受体的表达模式 ,为探索子宫内膜异位症和子宫腺肌症的致病机理提供依据。　方法　 10 8例患有内膜异位症、腺肌症、两症并发组和对照组子宫内膜组织 ,常规光镜下按Noyes分期标准行形态学分期。采用免疫组织化学的方法观察不同月经周期时相子宫内膜腺上皮、基质和血管内皮细胞中雌激素受体ERα和ERβ的表达。　 结果　与对照组相比 ,ERα信号强度在各组相应的细胞类型、相应的时相无显著差异 ,但子宫内膜腺上皮细胞、基质细胞和血管内皮细胞中显示阳性信号的细胞比例增大 ,且腺上皮细胞质普遍出现ERα阳性信号。子宫内膜异位症和腺肌症的血管内皮细胞中ERα阳性细胞数显著增加。ERβ在各组的表达模式与对照组相比无明显差异 ,甚至略呈下降趋势。　结论　人子宫内膜中ERα为雌激素效应的主要受体亚型 ,表达ERα的腺上皮、基质和血管内皮细胞数量的增多以及腺上皮细胞质普遍出现ERα阳性信号可能与这两种疾病的发病密切相关 ;ERβ并不参与这一过程。     

表皮生长因子对子宫内膜细胞体外增殖的影响

本研究观察了表皮生长因子（ＥＧＦ）在体外对子宫内膜上皮细胞及基质细胞增殖的影响。采用酶消化加物理方法分离人子宫内膜上皮细胞及基质细胞,分别在体外培养,细胞汇合后消化,一部分用盖片法培养,用特异性抗体鉴定细胞纯度,另一部分做细胞增殖实验。在细胞中加入不同浓度的ＥＧＦ,培养２４、４８、７２小时,用ＭＴＴ法及流式细胞仪测定ＥＧＦ对子宫内膜上皮细胞及基质细胞增殖的作用。结果：ＥＧＦ浓度为５．０及１０．０ｎｇ／ｍｌ时,明显刺激子宫内膜上皮细胞及基质细胞的增殖,ＭＴＴ与流式细胞仪两法一致。ＥＧＦ不刺激细胞凋亡。结论：采用酶消化结合物理方法分离的人子宫内膜基质细胞及上皮细胞,方法简便、快速,细胞纯度高,在体外生长良好,可用于体外研究着床及异位子宫内膜生长的机制。当ＥＧＦ浓度为５．０及１０．０ｎｇ／ｍｌ时,确实刺激子宫内膜细胞的增殖。     

三维培养汗腺腺上皮细胞形成汗腺样结构的初步研究

目的 探索体外构建人外泌汗腺样结构的方法 . 方法 取自愿捐献的正常腋部全层皮肤,分离培养汗腺腺上皮细胞,倒置相差显微镜下观察.将汗腺腺上皮细胞以2×105个/cm2密度接种至Matrigel凝胶下(A组)、凝胶上(B组)、凝胶中(C组),进行三维立体培养,激光扫描共聚焦显微镜、HE染色及免疫组织化学染色观察有无汗腺样结构形成. 结果 原代汗腺分泌部上皮细胞接种后24 h可见细胞贴壁,贴壁细胞呈梭形,2～3 d后细胞呈多克隆麦粒样生长,14 d后细胞融合呈铺路石样生长,融合后的汗腺腺上皮细胞呈扁平多角形,中间有较大圆形核;第1代细胞形态与原代极为相似;第2代细胞形态不规则,多数伸出长伪足;第3代细胞多呈星形状,细胞体积大,与邻近细胞相互融合.A组汗腺腺上皮细胞三维立体培养11 d形成管腔结构;B组汗腺腺上皮细胞立体培养8 h,细胞胞浆伸长呈丝状,与邻近细胞相连呈管腔或半管腔形,但细胞增殖不明显;C组汗腺腺上皮细胞三维立体培养2～3 d,细胞分裂增生,增生细胞彼此紧密排列成管腔结构,中间可见明显腔隙,随新生细胞增多,管腔结构逐渐演变为不规则球形结构.激光扫描共聚焦显微镜观察示C组形成球形结构,细胞团中央有管腔结构;球形结构HE染色示为管腔结构,免疫组织化学染色示角蛋白18、癌胚抗原表达阳性,与汗腺分泌部管状结构极为相似. 结论 汗腺腺上皮细胞在Matrigel凝胶中三维立体培养可形成汗腺样结构.     

表皮生长因子对宫内膜细胞体外增殖的影响

本研究观察了表皮生长因子（ＥＧＦ）在体外对子宫内膜上皮细胞及基质细胞增殖的影响。采用酶消化加物理方法分离人子宫内膜上皮细胞及基质细胞，分别在体外培养，细胞汇合后消化，一部分用盖片法培养，用特异性抗体鉴定细胞纯度，另一部分做细胞增殖实验。在细胞中加入不同浓度的ＥＧＦ，培养２４、４８、７２小时，用ＭＴＴ法及流式细胞仪测定ＥＧＦ对子宫内膜上皮细胞及基质细胞增殖的作用。结果：ＥＧＦ浓度为５．０及１０．０ｎ     

人子宫内膜基质细胞及上皮细胞的分离

为获得供人胚胎联合培养的人子宫内膜上皮和基质细胞标本，必须进行人子宫内膜上皮和基质细胞的分离和培养。为此，我们对传统的Ｋｅｖｉｎ［１］方法进行改进，现介绍如下。一、材料及方法１．标本来源：选自１９９６年１０月～１９９７年１２月在山东省立医院妇产科因子宫肌瘤做子宫切除术病例１０例，年龄３６～４８岁，月经周期规律（２８～３２天），术前３个月未用激素，病理检查为增殖期至早分泌期子宫内膜。２．子宫内膜上皮细胞及基质细胞的分离：参照Ｋｅｖｉｎ等［１］方法加以改良：术后立即刮取子宫内膜，置于含无菌Ｄ－Ｈａｎ…     

miR-182靶向调控AQP5基因介导Wnt信号通路对子宫内膜异位症小鼠子宫内膜腺上皮细胞增殖、侵袭的调控机制

目的:阐明miR-182靶向调控水通道蛋白5（aquaporin5,AQP5）基因介导Wnt信号通路对子宫内膜异位症（endometrrosis,EMs）小鼠子宫内膜腺上皮细胞增殖、侵袭的影响。方法:构建EMs小鼠模型。取小鼠子宫内膜腺上皮组织并检测组织中miR-182、AQP5的表达。酶联免疫吸附法检测正常和EMs模...     

骨桥蛋白在人正常月经周期子宫内膜的表达

目的研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在人正常月经周期子宫内膜的表达。方法采用免疫组织化学法对51例人正常月经周期子宫内膜OPN蛋白质进行定位和定量检测,Western blotting法测定增殖期及分泌期OPN蛋白水平,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测18例人正常月经周期子宫内膜增殖期及分泌期OPN mRNA的表达。结果OPN蛋白质主要分布在正常子宫内膜腺上皮细胞,增殖早期、中期无表达,增殖晚期出现,分泌中期、晚期表达最强。月经期子宫内膜腺上皮细胞表达较强。OPN mRNA表达分泌期强于增殖期(P<0.05)。Western blotting检测结果显示正常子宫内膜组织中存在OPN蛋白,分泌期含量较高。结论OPN蛋白质及mRNA在正常子宫内膜中的表达呈现明显周期依赖性。分泌中、晚期表达增强提示其可能参与胚胎着床。     

子宫内膜体外三维重建的形态学研究

目的 :探索建立子宫内膜体外三维模型的方法。方法 :将分离的子宫内膜基质细胞和上皮细胞依次种植于生物可降解胶原 -聚乳酸羟基乙酸共聚物杂交聚合网上下两面 ,光镜及扫描电镜观察细胞的生长状况。结果 :接种后第 5天子宫内膜细胞能在聚合网上融合生长 ,第 1 4天细胞融合成片 ,呈复层生长 ,形成三维结构。结论 :生物可降解的杂交聚合网作为支架可建立体外子宫内膜三维模型。     

子宫内膜异位症子宫内膜及输卵管细胞对鼠胚胎发育的影响

目的探讨子宫内膜异位症(内异症)子宫内膜及输卵管上皮细胞对小鼠胚胎体外发育的影响。方法小鼠2细胞期胚胎202个与卵巢巧克力囊肿患者术中切除的子宫内膜及输卵管上皮细胞共培养(实验组),314个与非卵巢巧克力囊肿患者子宫内膜及输卵管上皮细胞共培养作为对照。结果体外培养72~96h后,与对照组输卵管上皮细胞及子宫内膜共培养时有25.7%和26.2%的2细胞期胚胎发育到扩张期囊胚,与实验组输卵管上皮细胞共培养有25.9%发育到扩张期囊胚,二者无显著差异(P>0.05),而子宫内膜仅为11.1%,二者有显著差异(P<0.05)。结论内异症患者的输卵管上皮细胞对鼠早期胚胎体外发育无影响;子宫内膜对胚胎发育有明显的抑制作用,这可能与内异症的生育率降低有关。     

类肝素结合性表皮生长因子在人子宫内膜植入窗期的表达和意义

探讨类肝素结合性表皮生长因子 (HB-EGF)在人正常子宫内膜中的表达特点 ,评估其在子宫内膜的生长、分化及在植入窗期介导胚泡着床中的作用。采用免疫组织化学方法检测 5 6例正常子宫内膜 (1 6例增殖期 ,1 3例分泌早期 ,1 5例分泌晚期 ,1 2例植入窗期 )中 HB-EGF的表达及定位。结果 :HB-EGF在人各期子宫内膜均有表达 ,在植入窗期或分泌中期子宫内膜上皮细胞和间质细胞表达最强 ,并定位于腺上皮和腔上皮细胞表面 ,呈顶浆分泌状。结论 :HB-EGF存在于人各期子宫内膜 ,在植入窗期明显高表达可能参与介导胚泡着床 ,并与间质细胞的生长、分化有关 ,利于子宫内膜蜕膜化 ,为胚泡着床做准备。     

大鼠脂肪干细胞复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架构建组织工程软骨

目的 探讨大鼠脂肪干细胞复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架的优越性.方法 选用6周龄健康Wistar大鼠,分离出脂肪干细胞后行体外培养.将Ⅰ型胶原溶液与壳聚糖溶液混合后冷冻干燥,交联硫酸软骨素后再冷冻干燥得到复合三维支架,检测支架的孔径值、含水量及孔隙率.将接种的脂肪干细胞消化后分别接种到平面、微球和支架,软骨方向诱导培养.MTT检测细胞增殖情况,3周后倒置显微镜及扫描电镜观察细胞形态及在支架上的生长及黏附情况,并分析成软骨分化的情况.结果 5 d后MTT检测显示三维支架组及微球组细胞增殖速度较平面组快;三维支架组14 d后仍有细胞增殖.组织学分析显示细胞在支架上密集重叠生长,内层仍有残留支架结构.Ⅱ型胶原免疫组化检测结果显示,三维支架组及微球组表达呈强阳性,而平面组表达呈弱阳性.RT-PCR结果显示各组均有软骨特异性mRNA的表达.但平面组一直表达X型胶原,微球组培养至21 d时也表达X型胶原,而三维支架组则一直未表达.结论 复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架能促进细胞的增殖、分化,并能更好地维持软骨细胞的表型,可以作为组织工程构建软骨的最佳选择.     

无排卵性功能失调性子宫出血患者子宫内膜雌、孕激素受体及基质金属蛋白酶表达变化的研究

目的研究无排卵性功能失调性子宫出血(功血)患者子宫内膜雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、IV型胶原、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其抑制物-1(TIMP-1)的表达,探讨无排卵性功血的发病机制。方法采用免疫组化法检测20例正常增殖期子宫内膜(对照组)和66例无排卵性功血患者(病例组)子宫内膜腺上皮和基质细胞ER、PR、IV型胶原、MMP-9及TIMP-1表达。结果病例组子宫内膜腺上皮和基质ER、PR表达高于对照组(P<0.05),MMP-9水平明显增加(P<0.05),MMP-9/TIMP-1比值升高(P<0.01),IV型胶原含量明显下降(P<0.01)。相关分析显示,无排卵性功血患者子宫内膜MMP-9水平与ER、PR均呈正相关(r=0.605,P<0.05;r=0.697,P<0.05)。结论无排卵性功血患者子宫内膜出血原因可能与雌激素作用下ER、PR表达失调有关,且MMP-9水平异常升高,导致细胞外基质过度降解,临床表现为子宫不规则出血。     

原位杂交检测HOXA-10基因在人子宫内膜的表达

目的 :探讨正常生育妇女月经周期不同时期子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞中HOXA-1 0基因的表达。方法 :采用原位杂交的方法。结果 :HOXA-1 0基因在子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞均有表达 ;中晚分泌期的表达高于增殖期及分泌早期 ,且间质细胞的表达高于腺上皮细胞。结论 :( 1 ) HOXA-1 0基因在分泌中期子宫内膜高表达提示其可能在人胚胎着床过程中起某种作用。 ( 2 ) HOXA-1 0基因可能在人子宫内膜蜕膜化过程中有重要作用。     

转染人骨形成蛋白-7基因的骨髓基质细胞异位成骨实验研究

目的 观察转染人骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7,BMP-7）基因的骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）与胶原膜（BME-10X）复合培养后的异位成骨能力。方法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC,与胶原膜复合培养后,植入裸鼠皮下,8周后取材,HE、Mallory染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察其异位成骨能力。结果各组均有不同程度Ⅰ型胶原的表达,转染组和未转染组显著高于单纯膜组,转染组又显著高于未转染组（P〈0．05）。结论转染了hBMP-7基因的BMSCs具有更强的异位成骨能力,有望成为牙周组织工程理想的种子细胞,