犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞的体外培养

目的：探索犬肢体血管内皮细胞简易培养方法,为在肢端复合组织体保存方法及存后组织细胞（血管内皮细胞）活性判定方面的研究奠定基础。方法：手术切取术旋股下动脉侧支,采用血管外翻术,消化分离血管内皮细胞后体外培养,用免疫组化法对增殖细胞分虽进行ＶＩＩＩ因子和ＣＯ３４相关抗原的检测。结果：分离的细胞存活率炒９９．３％,培养２４ｈ多数细胞已贴壁,至第３ｄ,细胞开始增殖,可见细胞分裂相,至第７ｄ,亚细胞克隆组单个细胞分裂增殖,呈环片样生长,扩增组细胞殖呈盛,呈铺路石样结构,ＶＩＩＩ因子和ＣＤ３４相关抗原表达阳性。结论：血管内皮细胞的分离采用因管外翻术手消化可获得理的分离效果,该方法简易行,重复性好,体外培养的犬血管内皮细胞可以检测至ＶＩＩＩ因子和ＣＤ３４相关抗原。     

小鼠动脉血管内皮细胞的原代培养和鉴定

目的探讨小鼠动脉血管内皮细胞分离、培养的方法,为进一步实验研究提供相应的技术手段。方法手术显微镜辅助下取小鼠主动脉,去除外膜及脂肪组织,将血管剪成1 mm×1 mm大小的组织块,用植块法在含20%胎牛血清的DMEM培养液中培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征,免疫细胞化学方法进行血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原(von Willebrand factor,vWF)鉴定。结果60 h后,相差显微镜下可观察到内皮细胞从组织块边缘游出,12天左右细胞开始融合成片,免疫染色相关抗原检测呈阳性。结论用组织块培养方法可以获取较为满意的小鼠血管内皮细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。     

犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞培养的实验研究

目的：探讨犬肢体血管内皮细胞简易培养方法，为在肢端复合组织体外保存方法及保存后组织细胞（血管内皮细胞（活性判定方面的研究奠定基础；方法：手术切取犬旋股下动脉侧支，采用血管外翻术使血管内皮朝外，以０．２０％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液消化分离血管内皮细胞后体外静置培养。利用免疫组化法对增殖细胞分别进行Ⅷ因子和ＣＤ３４相关抗原的检测。结果：分离的细胞活率为９９．３&;#177;０．７％。培养２４小时多数细胞已贴壁，     

大鼠心肌微血管内皮细胞的分离培养和鉴定

目的建立心肌微血管内皮细胞培养模型。方法以1%～2%鼠尾胶原对培养皿作预处理,采用胶原酶和胰蛋白酶两次消化法从SD大鼠心肌分离培养微血管内皮细胞。结果通过形态学特征及微血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度大鼠心肌微血管内皮细胞。结论以鼠尾胶原对培养皿作预处理,采用蛋白酶消化及机械剪切、过滤的方法培养大鼠心肌微血管内皮细胞,纯度和获得率均较高。     

豚鼠血管内皮细胞培养的研究

目的：建立稳定的豚鼠血管内皮细胞原代及传代培养方法,并保证豚鼠取材后较高的存活率。方法：采用自豚鼠一侧颈总动脉取材进行血管内皮细胞培养,克服了以往小动物血管内皮细胞培养自大血管取材,取材后动物均死亡的缺点,由于颈总动脉管腔细小,原代培养获取细胞数少,培养不易成功,采用新的血管外翻方法进行酶消化获取内皮细胞,并创造有利于细胞生长的最适条件。结果：血管内皮细胞扩增迅速,纯度较高,为进一步研究了奠定基础。结论：自豚鼠颈总动脉取材进行血管内皮细胞培养能够获得令人满意的结果。     

人脐静脉内皮细胞的体外培养,鉴定及形态观察

目的：建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞重要的实验手段。方法：Ｅ和０．２５％的胰蛋白酶静脐内皮细胞，种植在培养板中，观察其生长情况，且用间接酶免法及电下进行内皮细胞鉴定。结果：种植在培养板中的内皮细胞４ｈ开始贴壁生长，。４８￣７２ｈ生长最快，７￣１０ｄ呈多角形。内皮细胞胞浆中有ＶＷＦ相关抗原和电镜下可见胞浆中有Ｗ－Ｐ步体外可确定培养的细胞为血管内皮细胞，结论：有胰酶灌注脐静脉消化内皮     

组织工程心脏瓣叶体外实验研究--内皮细胞分离及鉴定

目的探讨组织工程心脏瓣叶种子细胞--内皮细胞的体外分离、培养及鉴定.方法杂种猪4头,取整段主动脉.使用0.25%Ⅱ型胶原酶消化分离血管内皮细胞.使用M199培养、扩增内皮细胞.使用倒置显微镜、免疫组化方法及透射电子显微镜对内皮细胞进行鉴定.结果倒置显微镜结果显示原代细胞及经传代培养后的细胞,呈现典型的内皮细胞特征,呈铺路石样改变.免疫组化检测示内皮细胞Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.透射电镜显示细胞间存在上皮细胞特有紧密连接,未发现内皮细胞Webel-Palade小体结构.内皮细胞经3～4次传代,细胞数量可增殖达到6×106.结论使用胶原酶消化法可有效分离内皮细胞,种子细胞经体外培养扩增达到一定数量,可用于组织工程心脏瓣叶的种植.     

大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定

目的：研究大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定方法。方法：取出生5~7d左右的大鼠乳鼠的腹主动脉血管,用组织块法在含20%胎牛血清及内皮细胞生长添加剂和肝素的DMEM培养基中培养,倒置相差显微镜观察内皮细胞形态和生长特征,免疫荧光方法进行血管内皮细胞Tie2相关抗原的鉴定。结果：来自于大鼠乳鼠腹主动脉的血管内皮细胞在改良的培养基中进行体外培养,能够保持增殖和传代的能力,且Tie2抗原鉴定呈阳性。结论：成功分离大鼠乳鼠腹主动脉组织并且获得体外原代培养大鼠乳鼠腹主动脉内皮细胞。用组织培养方法可以获得较满意的血管内皮细胞。     

小鼠肝枯否细胞的分离、培养与鉴定

目的研究BALB/c鼠肝枯否细胞分离、培养和鉴定。方法选用健康雌性8￣10w龄鼠,麻醉无菌取肝,D-Hank’s液注射冲洗去血并剪去部分结缔组织,剪碎肝组织,加入链霉蛋白酶E和I型胶原酶,水浴振荡消化,再加入DNaseI,共同消化。不锈钢筛网滤过,用0.005%DNaseⅠ的1640液清洗细胞液,加Tris-NH4CL溶解红细胞。30%￣70%Percoll梯度离心,用含10?S的RPMI-1640贴壁培养4￣6h洗去非贴壁细胞。通过吞噬墨水实验鉴定枯否细胞。结果枯否细胞的数量为(1.07±0.87)×107/g,贴壁率40.3%,用0.4%台盼蓝染色鉴定,细胞存活率在95%以上,吞噬实验发现90%的贴壁细胞具有吞噬功能,即KC的纯度可达90%。贴壁的枯否细胞的形态多样,已经完全伸出了伪足并且伸展贴壁,呈多边形、多角形或者梭形等不规则形状,并且胞浆内可见吞噬的微粒状物质。结论酶消化水浴振荡法结合梯度离心和贴壁培养是分离BALB/c鼠枯否细胞的可靠方法,为进一步实验打下了基础。     

小鼠肝枯否细胞的分离、培养与鉴定

目的研究BALB／c鼠肝枯否细胞分离、培养和鉴定。方法选用健康雌性8—10w龄鼠，麻醉无菌取肝，D—Hank’s液注射冲洗去血并剪去部分结缔组织，剪碎肝组织，加入链霉蛋白酶E和Ⅰ型胶原酶，水浴振荡消化，再加入DNase Ⅰ，共同消化。不锈钢筛网滤过，用0．005％DNase Ⅰ的1640液清洗细胞液，加Tris—NH4CL溶解红细胞。50％-70％Percoll梯度离心，用含10％FCS的RPMI-1640贴壁培养4—6h洗去非贴壁细胞。通过吞噬墨水实验鉴定枯否细胞。结果枯否细胞的数量为（1．07±0．87）×10^7／g，贴壁率40．3％，用0．4％台盼蓝染色鉴定，细胞存活率在95％以上，吞噬实验发现90％的贴壁细胞具有吞噬功能，即KC的纯度可达90％。贴壁的枯否细胞的形态多样，已经完全伸出了伪足并且伸展贴壁，呈多边形、多角形或者梭形等不规则形状，并且胞浆内可见吞噬的微粒状物质。结论酶消化水浴振荡法结合梯度离心和贴壁培养是分离BALB／c鼠枯否细胞的可靠方法，为进一步实验打下了基础。     

人骨髓间质干细胞体外扩增、冻存及初步鉴定

目的 探索人骨髓间质干细胞(hMSC)的体外分离、扩增、冻存、复苏的方法.方法 无菌条件下抽取骨外伤髓内钉固定手术髓腔内容物,应用Ficoll-Paque分离液分离hMSC,通过传代扩增细胞,"慢冻速融"进行细胞冻存、复苏;流式细胞仪检测hMSC的表面标志.结果 hMSC容易分离获取、体外扩增迅速、冻存复苏简便,复苏后细胞形态保持不变.流式细胞仪检测结果显示,CD34、CD45阴性,CD29及CD71、CD90阳性表达率分别为96.9%,99.1%及4.1%.结论 hMSC库有望建立,为组织工程、细胞移植的研究提供种子细胞.     

人脐静脉血管内皮细胞培养、冻存、复苏与鉴定

目的：探讨人脐静脉血管内皮细胞（humanumbicicalveinendothelialcell,HUVEC）体外分离、培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法。方法：采用改良的胶原酶灌注消化法对HUVEC进行分离、培养与鉴定,并遵循”慢冻快复”的原则进行冻存与复苏,同时使用Ⅷ因子相关抗原染色法进行鉴定。结果：分离的HUVEC生长良好,细胞总数可达I-3×10^2。Ⅷ因子相关抗原染色鉴定结果为95％以上阳性,冻存后复苏的细胞活性超过90％。结论：HUVEC可以从脐带获得并通过原代培养成为细胞系,获得了人脐静脉血管内皮细胞体外培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法。     

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

目的:建立一种简便的巨噬细胞分离与培养方法,为骨替代材料降解产物的研究提供巨噬细胞。方法:以无血清DMEM培养液灌洗小鼠腹腔,10min后吸出灌洗液于含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。采用HE染色和倒置显微镜观察细胞形态;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;墨汁颗粒吞噬实验检测其吞噬功能。结果:获得高纯度的巨噬细胞,具有巨噬细胞的形态特征,良好的吞噬功能,含水解酶类。结论:本法是一种简易而实用的体外分离培养腹腔巨噬细胞的方法。     

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10％胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,分析细胞周期,检测细胞表面抗原。结果采用Percoll（1．073g／mL）分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀,梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50％～70％细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

人脐静脉血管内皮细胞培养、冻存、复苏与鉴定

目的:探讨人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法.方法:采用改良的胶原酶灌注消化法对HUVEC体外分离、培养,按慢冻速融原则对第3代细胞进行液氮冻存、复苏.采用免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色和活体细胞荧光DiI-Ac-LDL鉴定.结果:分离的原代HUVEC总数平均为1×106个细胞,最多达3×106个细胞;两种鉴定结果HUVEC均为95%以上阳性;冻存后分3批复苏细胞活性均超过90%.结论:成功建立了人脐静脉血管内皮细胞体外培养、冻存、复苏与鉴定方法,获得了足够数目和纯度的血管内皮细胞,保持了细胞的同源同代性.     

新生大鼠神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的获得新生大鼠神经干细胞,为深入研究其增殖分化奠定基础。方法从新生24小时内大鼠端脑及中脑部位分离NSC,采用体外无血清悬浮培养,以获得能在体外长期生存的NSC;通过单细胞克隆实验检测其自我更新能力,免疫细胞化学检测NSC标志物nestin表达及分化为神经元和胶质细胞的能力;用细胞计数法研究其生长特点并绘制生长曲线。结果获得的NSC能在体外长期生存,具有很强的增殖能力、自我更新能力,能分化为神经元和胶质细胞,具有多向分化能力,表达nestin,体外传代至10代细胞数量扩增了40倍。结论成功地从新生大鼠端脑和中脑中分离得到了能在体外长期培养的NSC。     

半夏内生菌的分离培养与鉴定

目的从恩施产半夏植株体内分离培养有益的内生细菌,为制备半夏益生菌提供菌株。方法取半夏植株样品经前处理后,接种至牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基培养48 h后选择目的菌落,经纯化培养后,涂片革兰氏染色,油镜观察,并进行各种生化反应。结果三类标本的培养特征：在固体培养基上,菌落呈圆形,灰白色,直径3~4 mm,边缘整合,中央凹陷,呈肚脐状;在液体培养基中培养24 h后呈沉淀生长,上液澄清,革兰氏染色阳性,菌体呈直杆状,成链状排列,菌体长5~10μm,宽1~2μm,培养48 h后可见芽胞形成,位于菌体中央,呈柱状,结合生化反应结果,所分离的半夏内生菌菌株符合地衣芽胞杆菌特征。结论半夏内存在多种内生菌,从半夏植株内能分离出地衣芽孢杆菌,对研究制备半夏益生菌制剂提供了重要的理论依据。     

大鼠骨髓基质细胞的体外培养及鉴定

目的观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件，为诱导骨髓基质分化形成神经干细胞、神经元，以及移植鼠骨髓基质细胞治疗帕金森病大鼠奠定基础。方法取60～90g SD大鼠，体外培养骨髓基质细胞，利用倒置相差显微镜观察原代及不同传代细胞生长形态特点，并应用流式细胞仪鉴定原代及不同传代细胞表型。结果培养的骨髓基质细胞第3代，间充质干细胞的细胞表面标志CD90表达阳性的细胞已占到92．9％。造血干细胞的表面标志CD45表达阳性的细胞已从原代的73．4％降低到2．3％。结论传3代的细胞适合于细胞诱导分化，可作为理想细胞移植治疗的细胞来源。