不同来源血液NK细胞大体系培养质量统计分析

目的 分离外周血、脐血中的单个核细胞,经过体外大体系培养扩增其中的NK细胞,对比两种来源的NK细胞在扩增倍数、数量、比例上的差异。〖HTH〗方法 收集外周血和脐血,通过同样的培养方法扩增NK细胞,检测起始细胞数、细胞总数、增殖倍数并通过流式方法检测其中CD3-CD56+细胞的比例。结果 同样体积的外周血中分离的单核细胞（起始细胞）数量比脐血中的单核细胞数量多,差异有统计学意义(P＜0.05）。经过同样大体系方法培养后,脐血来源扩增的细胞总数多于外周血来源扩增的细胞总数（P＜0.01）;脐血来源NK细胞扩增倍数、CD3-CD56+细胞比例高于外周血来源,但两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 同样的大体系细胞培养方案既可以扩增培养外周血来源NK细胞,也可以扩增培养脐血来源的NK细胞;培养后的NK细胞总数有差异,造成差异的主要原因是起始细胞数量的不同。     

NK细胞、HLA-G、和HLA-DRB1等位基因在子痫前期发病机制中的作用研究

目的:研究子痫前期患者发病机制中相关的免疫学变化及基因背景。方法:SAP法检测血液中NK细胞数量。MTT珐检测NK细胞增殖能力。51Cr释放法测定NK细胞杀伤活性。免疫组化法检测胎盘蜕膜浸润的NK细胞数量及HLA-G蛋白表达水平。RT-PCR和real time PCR法检测胎盘蜕膜组织HLA-G mRNA。PCR-SSP法检测两组HLA-DRB1等位基因频率,并分析母/儿间所携带某些HLA-DRB1等位基因配伍的频率。结果:①子痫前期患者外周血及其新生儿脐血NK细胞数均显著高于正常晚孕者及其新生儿。②子痫前期患者外周血及其新生儿脐血NK细胞增殖活性及杀伤活性均明显高于正常晚孕组(P<0.05)。③轻度与重度子痫前期组胎盘蜕膜NK细胞均多于正常晚孕组,但仅重度子痫前期组蜕膜NK细胞数量增加有统计学意义(P<0.05)。④轻度子痫前期组、重度子痫前期组和正常晚孕组之间HLA-G mRNA水平两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。⑤轻度子痫前期组HLA-G蛋白表达水平与正常晚孕组无显著性差异,重度子痫前期组胎盘HLA-G蛋白表达水平较正常晚孕组显著降低(P<0.05)。⑥两组孕妇和新生儿均检出13个HLA-DRB1等位基因,各等位基因频率在两组间均无明显差异。子痫前期组母不携带HLA-DRB1*04基因/儿携带DRB1*04基因、均不携带HLA-DRB1*14基因的频率显著高于正常晚孕组(P<0.05);母/儿均不携带HLA-DRB1*10基因、均携带HLA-DRB1*14的频率显著低于正常晚孕组(P<0.05)。结论:①先兆子痫患者外周血、脐血及蜕膜的NK细胞数量增多,活性增强,在妊娠过程中影响母胎免疫耐受。②母婴所携带的某些HLA-DRB1基因配伍与子痫前期易感性或抗性相关;父源性HLA-DRB1*04基因与子痫前期易感性相关。     

重度子痫前期患者血小板源性生长因子-D的研究

目的：探讨血小板源性生长因子（PDGF-D）与重度子痫前期发病的关系;通过比较早发型及晚发型重度子痫前期患者血清及胎盘组织中PDGF-D的表达,探讨其病因和发病机制的差异。方法：选择2009-01~2010-06在福建医科大学厦门第一医院妇产科住院剖宫产分娩的重度子痫前期患者40例,其中早发型11例、晚发型29例,同期选择20例孕妇作为对照组,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法测各组外周血血清中PDGF-D的浓度,采用实时定量PCR（Realtim e PCR）测定各组胎盘组织PDGF-D mRNA表达水平。结果：重度子痫前期组孕妇血清PDGF-D的浓度,早发型组：571.59±67.35pg/mL,晚发型组：573.92±51.24 pg/mL,高于正常妊娠组（509.63±49.99 pg/mL）,差异有统计学意义（P〈0.05）;胎盘PDGF-D mR-NA的表达量,早发型组：2.72±1.60,晚发型组：2.77±1.57,高于正常妊娠组（1.93±0.82）,差异有统计学意义（P〈0.05）;重度子痫前期患者血清及胎盘组织PDGF-D表达水平呈正相关（r=0.328,p〈0.05）;早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期其血清PDGF-D浓度及胎盘组织PDGF-D表达量相比,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：外周血血清及胎盘组织中升高的PDGF-D可能与重度子痫前期的发病有关,可能参与了重度子痫前期的病理生理过程;PDGF-D在早发型和晚发型重度子痫前期的表达差异无显著性,提示两者的发病机制可能存在共同之处。     

Rho-GDI在子痫前期蜕膜组织中的表达及其意义

目的探讨Rho-GDI在子痫前期蜕膜组织中的表达及意义。方法采用荧光实时定量PCR(SYBR GREEN I assay)、Western blot和免疫组织化学技术分别对正常足月妊娠妇女(对照组)30例、晚发型重度子痫前期30例及早发型重度子痫前期30例的Rho-GDI mRNA及蛋白进行测定。结果 Rho-GDI主要表达于蜕膜细胞的胞浆、胞核和少许间质。荧光实时定量PCR,Western blot和免疫组化表达等各方法验证结果显示Rho-GDI mRNA及蛋白在正常妊娠组蜕膜组织中表达最高;早发型子痫前期组中次之;晚发型子痫前期中最低。正常组与早发组和晚发组比较,差异均有显著性(P<0.05),但早发组与晚发组间比较的差异无显著性(P>0.05)。结论 Rho-GDI在子痫前期蜕膜组织中表达下调,Rho-GDI可能通过调控滋养细胞浸润和血管平滑肌舒缩状态等环节参与了子痫前期的发生发展。     

正常早孕及稽留流产患者NK细胞中整合素αvβ3的表达分析

目的分析正常早孕妇女和稽留流产患者外周血及蜕膜组织中CD56+CD16-和CD56+CD16+自然杀伤(NK)细胞比率以及细胞表面整合素αvβ3的表达。方法分别采集15例正常早孕妇女和7例稽留流产患者外周血和蜕膜组织,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞悬液,流式细胞术检测样本CD56+CD16-和CD56+CD16+NK细胞的比率以及其细胞表面αvβ3表达。结果 与早孕妇女外周血相比,蜕膜组织中CD56+CD16-NK细胞比率增高而CD56+CD16+NK细胞的比率却降低(P<0.01);正常早孕妇女及稽留流产患者外周血和蜕膜组织中CD56+CD16-和CD56+CD16+NK细胞的比率均无差异(P>0.05)。与正常早孕妇女相比,稽留流产患者蜕膜组织CD56+CD16-NK细胞表面αvβ3阳性表达率降低而其平均荧光强度(GM)值却增高(P<0.05)。结论 NK细胞及其所表达的整合素αvβ3在早孕期胚胎植入及胎盘形成过程中发挥重要作用,稽留流产患者NK细胞表面整合素αvβ3的表达异常,可能是稽留流产发生的免疫致病因素。     

人外周血与脐带血来源自然杀伤细胞大体系扩增培养比较

目的探讨人外周血、脐带血来源的细胞因子诱导的自然杀伤(NK)细胞在体外大体系扩增培养的增殖能力及细胞表型分析。方法无菌采集健康志愿者外周血、孕产妇脐带血,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,加入白细胞介素-2(IL-2)体外诱导NK细胞,细胞计数法检测比较其增殖能力,流式细胞术检测诱导后NK细胞的表型。结果加入IL-2诱导体外培养15 d后,外周血、脐带血来源的NK细胞扩增倍数分别为187.87±7.57和165.80±9.24,外周血来源的NK细胞扩增倍数高于脐带血来源的(P<0.05)。培养前,流式细胞术检测外周血、脐带血不同来源单个核细胞中CD3~-CD16~+CD56~+表型的NK细胞所占比例分别为(18.37±3.16)%和(13.29±2.41)%,差异无统计学意义(P>0.05);诱导培养15 d后,外周血、脐带血不同来源单个核细胞中CD3~-CD16~+CD56~+表型的NK细胞所占比例分别为(91.32±5.38)%和(84.26±4.11)%,较诱导前均显著升高(P<0.05);外周血来源CD3~-CD16~+CD56~+表型的NK细胞所占比例稍高于脐带血来源,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论经细胞因子IL-2诱导后,外周血和脐血来源诱导的NK细胞的增殖能力、CD3~-CD16~+CD56~+表型细胞所占比例均有较大提高。     

特发性血小板减少性紫癜患者免疫功能的研究

目的了解特发性血小板减少性紫癜((idiopathic thrombocytopenic purura,ITP)患者的免疫功能并探讨ITP的发病机制。方法应用流式细胞术检测41例ITP患者及18例正常对照者外周血淋巴细胞亚群;同时与患者的临床资料进行相关性分析。结果(1)ITP患者外周血淋巴细胞亚群的表达中,CD19+的表达率明显增加(P<0.01);CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值、CD3-CD16+CD56+(NK细胞)的表达率明显降低(P<0.05)。(2)患者外周血CD19+的表达率与患者发病至就诊时间呈正相关(r=0.50,P=0.02),与患者骨髓巨核细胞数值均呈正相关(r=0.62,P=0.002);患者CD3+CD4+的表达率与患者发病至就诊时间呈负相关(r=-0.49,P=0.02);患者CD3-CD16+CD56+的表达率与患者巨核细胞数值呈负相关(r=-0.43,P=0.04)。结论ITP患者细胞免疫及体液免疫功能的紊乱可能与ITP的发病有关;ITP患者NK细胞的异常表达可能是ITP的致病机制之一。     

重度子痫前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞改变与发病孕周的关系

目的 探讨子痫前期患者外周血CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T淋巴细胞(Treg)的比例改变与发病孕周之间的关系.方法 2010年1月至2011年12月对宁波市妇女儿童医院早发型重度子痫前期患者20例、晚发型重度子痫前期患者20例、28～34周的正常妊娠组20例及34周以后的正常妊娠20例,采用流式细胞仪检测其外周血CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg的比率,分析其与子痫前期发病及发病孕周之间的关系.结果 早发型和晚发型子痫前期患者妇女外周血CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg比例分别为(2.80±0.54)％、(3.23±0.44)％,分别低于28～34、＞34周正常妊娠组妇女外周血CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg比例(3.48±0.3D％、(3.58±0.41)％,差异有统计学意义(P＜0.05).且早发型子痫前期患者妇女外周血CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg比例低于晚发型子痫前期患者,差异有统计学意义(P＜0.01).28～34、＞34周正常妊娠组妇女外周血CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg比例比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg的减少可能参与子痫前期的发病,下降程度可能与子痫前期发病孕周密切相关.     

重型再生障碍性贫血患者外周血自然杀伤细胞亚群百分比及功能变化

目的 分析重型再生障碍性贫血(SAA)患者免疫抑制治疗(IST)前、后外周血自然杀伤(NK)细胞亚群占淋巴细胞百分比、功能变化及其与造血功能相关性,探讨NK细胞在SAA发病机制中的作用.方法 用流式细胞术检测2010年4月至2010年12月天津医科大学总医院收治的12例初治(初治组)、30例IST后恢复(恢复组)的SAA患者的外周血NK细胞(CD3-CD56+/CD16+)及其亚群[CD3-CD56brightCD16-(CD56bright)、CD3-CD56dimCD16+(CD56dim)、CD3-CD56-CD16+]占淋巴细胞百分比、活化性受体(NKG2D和NKp46)、穿孔素、颗粒酶β表达,并与13名健康对照(对照组)比较;分析上述变化与外周血中性粒细胞比例(ANC%)、淋巴细胞比例、网织红细胞计数及骨髓造血功能(增生程度、粒系百分比、红系百分比、巨核细胞数量、淋系百分比)的相关性.结果 (1)初治组NK细胞、CD56bright细胞百分比(10.30%±6.08%、0.11%)均显著低于恢复组(16.47%±8.29%、0.68%,P＜0.05)和对照组(19.45%±6.88%、0.53%,均P＜0.05);初治组CD56dim细胞百分比(9.62%±6.04%)明显低于对照组(18.21%±7.16%,P＜0.05);恢复组CD3-CD56-CD16+细胞百分比(0.79%)显著高于初治组及对照组(0.37%、0.41%,均P＜0.05).(2)初治组与恢复组NK细胞NKp46、穿孔素表达[初治组(88.23%、64.97%±21.61%),恢复组(82.97%、66.14%±20.73%)]显著高于对照组(40.99%、42.11%±27.25%,均P＜0.05).(3)NK、CD56bright及CD3-CD56-CD16+细胞的百分比与SAA患者ANC%呈正相关(r分别为0.423、0.609、0.468,均P＜0.05),与骨髓粒系百分比呈正相关(r分别为0.357、0.517、0.434,均P＜0.05);NK、CD56bright、CD56dim和CD3-CD56-CD16+细胞的百分比与SAA患者骨髓增生程度呈正相关(r分别为0.455、0.412、0.404、0.451,均P＜0.05),与骨髓淋系百分比呈负相关(r分别为-0.522、-0.435、-0.411、-0.547,均P＜0.05);NK细胞NKG2D、NKp46、穿孔素、颗粒酶β表达与各造血指标无相关性(均P＞0.05).结论 SAA患者外周血NK细胞、CD56bright、CD56dim亚群占淋巴细胞百分比降低及穿孔素途径增强可能引起免疫耐受被破坏、T细胞功能亢进而导致造血功能衰竭.

Abstract：

Objective To analyze the percentage and functional changes of natural killer(NK)cell subsets in peripheral blood of severe aplastic anemia(SAA)patients before and after immunosuppressive therapy(IST)so as to evaluate the relationships between these changes and hematopoietic functions and explore the role of NK cells in the pathogenesis of SAA.Methods By flow cytometry,the percentages of NK cells(CD3-CD56+/CD16+)and its subsets[CD3-CD56brightCD16-(CD56bright),CD3-CD56dimCD16+(CD56dim),CD3-CD56-CD16+]in peripheral blood lymphocytes were detected in 12 untreated patients,30 recovered patients and 13 normal controls respectively from April 2010 to December 2010 in our hospital.NK cells activating receptors(NKG2D and NKp46),pofforin and granzyme-β of patients and normal controls were also detected.The correlation between these changes and hematopoietic functions,including the percentages of neutrophil granulocyte(ANC%),lymphocyte and reticulocyte absolute value in peripheral blood,and hyperplasia degree,percentage of granulocytes,erythrocytes,lymphocytes and megakaryocytes absolute value in bone marrow were evaluated.Results (1)The percentages of NK cells (10.30% ± 6.08%)and CD56 bright cells(0.11%)in untreated patients were significantly lower than those of recovered patients(16.47% ± 8.29%,0.68%,both P ＜0.05)or normal controls(19.45% ±6.88%,0.53%,both P ＜0.05).The percentage of CD56dim cells in untreated patients was significantly lower than that of normal controls(9.62% ±6.04% vs 18.21% ±7.16%,P ＜0.05).The percentage of CD3 CD56 CD16 + cells was significantly higher in recovered patients than that of untreated patients or normal controls(0.79% vs 0.37%,0.41%,both P＜0.05).(2)The expression of NKp46 and pefforin of NK cells in untreated(88.23%,64.97% ± 21.61%)and recovered patients(82.97%,66.14% ±20.73%)were significantly higher than those of healthy controls(40.99%,42.11% ±27.25%,all P ＜0.05).(3)The percentage of NK CD56bright and CD3-CD56-CD16+ cells of patients was positively correlated with ANC%(r=0.423,0.609,0.468 respectively,all P＜0.05)and the percentage of granulocytes in bone marrow(r=0.357,0.517,0.434 respectively,all P＜0.05).The percentages of NK,CD56bight,CD56dim and CD3-CD56-CD16+ cells were positively correlated with the hyperplasic degree of bone marrow(r=0.455,0.412,0.404,0.451 respectively,all P＜0.05),but they were negatively correlated with the percentage of lymphocytes in bone marrow(r =-0.522,-0.435,-0.411,-0.547 respectively,all P ＜0.05).The expression of NKG2D,NKp46,pefforin and granzyme-β of NK cells had no correlation with hematopoiesis(all P＞0.05).Conclusion The lowered percentage of NK CD56bright,CD56dim cells and a higher expression of pefforin may cause the over-function of T lymphocytes and thus lead to hematopoietic failure in SAA.     

子痫前期孕妇外周血辅助性T细胞和自然杀伤细胞的表达水平分析

目的:分析子痫前期(PE)孕妇外周血辅助性T细胞和自然杀伤(NK)细胞表达水平。方法:选择近期住院确诊的PE妇女42例,入选对象均接受辅助性T细胞和自然杀伤(NK)细胞(CD3+、CD4+、CD+8、CD4+/CD8+、CD56+)检测,并与同期住院正常怀孕产妇(对照组,20例)的检测结果比较。结果:PE组血清CD4+、CD4+/CD8+、CD56+表达水平明显高于对照组,而CD8+表达水平则显著低于后者(P均<0.05~0.01)。结论:子痫前期孕妇外周血辅助性T细胞和自然杀伤(NK)细胞的水平异常表达。