肺腺癌SPC-A-1细胞表皮生长因子受体表达水平对其增殖的影响

目的 探讨采用体外化学合成的针对表皮生长因子受体(EGFR)设计的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，是否能诱导肺非小细胞肺癌(NSCLC)细胞出现序列特异性基因沉默，及抑制EGFR基因表达后NSCLC细胞的生物学特征。方法 体外合成EGFR序列特异性dsRNA(dsRNA-EGFR)，结合脂质体2000转染肺腺癌SPC-A-1细胞，用荧光显微镜及流式细胞仪测定转染细胞的EGFR受体数量；适时定量聚合酶链反应检测其EGFR基因表达水平。采用集落形成试验检测SPC-A-1细胞的增殖和集落形成能力。建立裸鼠肿瘤模型，计算肿瘤抑制率。结果 dsRNA-EGFR可使EGFR在蛋白水平表达下降71．3％、基因水平表达下降50．0％，SPC-A-1细胞集落形成下降66．8％，并显著抑制在体肿瘤生长，肿瘤抑制率为75．0％。结论 dsRNA-EGFR可序列特异性下调NSCLC细胞EGFR在基因及蛋白水平的表达，有效抑制肿瘤生长。     

Rho激酶抑制剂Y-27632对人气道平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察Rho激酶抑制剂Y-27632对人气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖的影响，为哮喘防治提供新思路。方法组织块贴壁法培养人ASMCs，对数传代后随机分为4组，A组加入含10％FBS的DMEM培养基，B、C、D组分别加入浓度为0．4、2．0、10．0μmol／L的Y-27632＋含10％FBS的DMEM培养基，非放射性细胞增殖（MTS）／吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）法检测各组细胞增殖情况（490nm处A值），流式细胞仪分析细胞周期。结果C、D组A值均显著低于A组（P〈0．05、0．01）；C、D组G0／G1期细胞比例显著高于A组，S、G2／M期细胞比例显著低于A组（P〈0．05、0．01）。结论Rho激酶抑制剂Y-27632可抑制人ASMCs增殖，阻滞细胞周期于G0／G1期；本研究为哮喘防治提供了新的选择。     

三氯化镧对CBRH-7919细胞CDK4和P21蛋白表达的影响

目的 研究三氯化镧(LaCl3)对大鼠肝癌细胞CBRH-7919 CDK4和P21蛋白表达的影响.方法 实验分为3组,2个实验组:CBRH-7919细胞分别培养在含0.10和1.00 mmol/L LaCl3的DMEM培养液中,对照组:CBRH-7919培养在不含LaCl3的DMEM培养液中.培养时间分别为1、3、5d.采用MTT法观察细胞生长变化,同时观察集落形成情况,运用流式细胞术检测细胞周期变化,采用免疫细胞化学方法检测CDK4和P21的变化情况.结果 与对照组比较,0.10和1.00 mmol/L LaCl3组培养后3、5 d CBRH-7919细胞的OD值均明显下降(P＜0.01);集落形成数量明显减少(P＜0.01);G0/G1期细胞百分数显著增加,S期细胞百分数显著减少(P ＜0.01);CDK4阳性率明显下降,P21阳性率明显增加(P＜0.01).结论 LaCl3可通过下调CDK4及上调P21,使肿瘤细胞从G1期进入S期受阻,从而抑制CBRH-7919细胞生长.     

靶向EGFR基因的shRNA对胰腺癌细胞放疗敏感性的增强作用

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因对胰腺癌细胞放疗敏感性的增强作用.方法 构建针对EGFR基因序列特异性shRNA的表达载体,用脂质体转染胰腺癌PANC-1细胞,G418筛选建立稳定克隆,采用RT-PCR、Western印迹检测EGFR基因的抑制情况.采用不同剂量X线照射瘤细胞后,用MTT法检测细胞凋亡率,集落形成实验检测细胞集落形成能力,观察胰腺癌细胞对放疗的敏感性.结果 靶向EGFR的序列特异性shRNA可明显抑制EGFR基因的表达,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为76.3%和71.4%;细胞凋亡增加(P<0.01),克隆形成率减少(P<0.01).结论 体外实验证实靶向EGFR的序列特异性shRNA可明显提高胰腺癌的放疗敏感性.     

介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞的试剂筛选及条件优化

目的筛选介导表皮生长因子受体（EGFR）小干扰RNA（siRNA）转染肝癌HepG2细胞的试剂,并优化转染条件。方法设计靶向EGFR的特异性siRNA,分别用Lipofectamine 2000、siPORT Amine、ICAFectin 442、N-TER nanoparticle、X-tremeGENE、polyMagnetofection、combiMAGnetofection介导转染肝癌HepG2细胞48、72 h。实时定量RT-PCR检测HepG2细胞的EGFR mRNA,计算敲除EGFR mRNA率,据此筛选出最佳转染试剂,继续进行不同试剂用量、不同siRNA浓度、正反向转染的对比。测算转染后细胞存活率及转染率。结果 Lipofectamine2000、siPORTAmine及combiMAGnetofection介导转染72 h后,HepG2细胞的EGFR mRNA敲除率均超过65%。2μl的combiMAGnetofection及200 nM的EGFR siRNA组合、72 h时HepG2细胞的EGFR mRNA沉默效率最高（90%±1%）,其细胞存活率为94%±8%,转染率超过95%。结论介导EGFR siRNA转染HepG2细胞的最佳试剂是combiMAGnetofection,优化转染条件为2μl的combiMAGnetofection、200 nM的EGFR siRNA、转染72 h。     

内皮素-1及其受体拮抗剂对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的　探讨内皮素 - 1(ET- 1)及其特异性内皮素 A受体 (ETA- R)拮抗剂 (BQ12 3)对脐动脉血管平滑肌细胞(HUSMC)凋亡的影响。方法　组织块培养 HU SMC,传代后分为对照组、ET- 1组、BQ12 3+ET- 1组。流式细胞术测定细胞核 DNA降解规律、凋亡细胞数、及细胞周期中各时相细胞的变化。结果　 ET- 1组可见明显 Ap峰 ,凋亡细胞百分比 (13.86 %± 4 .85 % )较对照组 (1.5 8%± 0 .2 3% )显著增加 (P<0 .0 5 )。ET- 1组 HUSMC的 G0 / G1 期细胞百分数 (31.5 6 %± 2 .73% ) ,较对照组 (71.15 %± 1.34% )明显降低 (P <0 .0 1)。 S期细胞百分数 (37.6 5 %±3.0 1% )和 G2 / M期细胞百分数 (30 .78%± 0 .30 % ) ,分别较对照组 (19.10 %± 1.99% )和 (12 .2 1%± 1.86 % )明显升高 (P<0 .0 1)。 BQ12 3+ET- 1组各期细胞百分数与相应对照组比较 ,统计学均无差异 (P>0 .0 5 )。结论　 ET- 1促 HU SMC凋亡和增殖的程度不同 ,产生增殖与凋亡的失平衡。BQ12 3可完全抑制 ET- 1的上述作用 ,具有临床应用前景     

IL-11促进胃癌细胞增殖的机制研究

目的研究IL-11对胃癌细胞增殖的促进作用及其分子机制。方法将培养的BGG823胃癌细胞株随机分为干预组和对照组,对照组使用不含药物的DMEM进行处理,干预组采用含有20μg/L、50μg/L rh IL-11的DMEM进行处理。处理后24 h、48 h时,PI染色后采用流式细胞仪测定细胞周期中G0/G1、S期、G2/M期细胞所占比例,抽提RNA后采用荧光定量PCR测定细胞中PCNA、Cyclin D1、CDK4、MMP2、MMP9的m RNA含量。结果处理24 h、48 h后,干预组细胞中G0/G1细胞的比例明显低于对照组,S期和G2/M期细胞的比例明显高于对照组(P0.05);50μg/L组细胞中G0/G1细胞的比例明显低于20μg/L组,S期和G2/M期细胞的比例显著高于20μg/L组(P0.05);干预组细胞中PCNA、Cyclin D1、CDK4的m RNA含量明显高于对照组(P0.05);50μg/L组细胞中PCNA、Cyclin D1、CDK4的m RNA含量明显高于20μg/L组(P0.05);干预组细胞中MMP2、MMP9的m RNA含量明显高于对照组(P0.05);50μg/L组细胞中MMP2、MMP9的m RNA含量明显高于20μg/L组(P0.05);且均与干预时间呈依赖性关系(P0.05)。结论 IL-11能够促进胃癌细胞的增殖以及细胞周期的发展,上调PCNA、Cyclin D1、CDK4、MMP2、MMP9的表达是IL-11发挥促增殖作用可能的分子机制。     

罗格列酮对PDGF-BB刺激的人气道平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨罗格列酮对血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）刺激的人气道平滑肌细胞（HASMCs）增殖的影响。方法组织块贴壁法培养HASMCs鉴定后,接种于96孔板,除空白对照组外,A、B、C、D组各孔在加入PDGF-BB前30min分别加入0、1、5、10μmol／L罗格列酮。MTS／PMS微量比色法检测各组HASMCs细胞A490吸光度,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果A组A490值高于空白对照组,B、C、D各组均高于A组（P均〈0．05）;与空白对照比较,单加入PDGF-BB后G0／G1期细胞比率降低,S期升高;用1、5、10μmol／L罗格列酮预处理的ASMCs在G0／G1期细胞比率逐渐升高,S期逐渐降低（P均〈0．05）。结论罗格列酮呈剂量依赖性抑制PDGF-BB刺激的HASMCs增殖。     

不同用药顺序吉非替尼、多西他赛联用对非小细胞肺癌细胞的体外抑制作用

目的探讨不同用药顺序吉非替尼、多西他赛(DXT)联用对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的体外抑制作用。方法选择人肺癌细胞株PC-9、PC-9/G、A549,用MTT法、流式细胞技术分别检测不同顺序吉非替尼、DXT联用对3种细胞存活率、周期及凋亡的影响;用药顺序分先用DXT、后用吉非替尼(D→G组)及先用吉非替尼、后用DXT组(G→D组)。结果与G→D组比较,D→G组细胞存活率显著减少,可使细胞阻滞在G2～M期,并增强DXT诱导的细胞凋亡(P均<0.05);G→D组可使细胞阻滞在G0～G1期,并减少DXT诱导的细胞凋亡。结论先用DXT、后用吉非替尼为抑制NSCLC细胞增殖的最佳联用方案。     

靶向表皮生长因子受体的RNA干扰技术对非小细胞肺癌细胞株A549细胞抑制及顺铂敏感性的研究

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术,将携带表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)同源基因的重组质粒稳定转染非小细胞肺癌细胞株A549细胞,观察其对A549细胞生长抑制作用及对顺铂敏感性的变化.方法 根据RNAi原理,体外设计并合成靶向EGFR特异性干扰片段,即h-EGFR,以pGensil-1为载体,构建重组质粒pGensil-1-EGFR,以Lipofectamine 2000介导转染肺腺癌细胞株A549细胞,经G418筛选后挑选出稳定转染的单克隆细胞.将所挑选出的单克隆细胞大量培养后加入不同浓度顺铂(40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L),采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞活力,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡的变化,观察RNAi对A549细胞抑制作用及是否与顺铂有协同作用.结果 与对照组、阴性对照组相比,从第2天起实验组生长缓慢,吸光度有统计学差异(P＜0.05);顺铂或联合dsRNA-EGFR对A549细胞有抑制作用,且随着浓度的增加和时间的延长抑制作用增强,dsRNA-EGFR联合顺铂与等浓度顺铂吸光度有统计学差异(P＜0.05),顺铂作用24 h后40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L顺铂抑制率分别提高了7.8%、30.70%、34.42%.实验组G0/G1细胞百分比较对照组增加了13.84%,较阴性对照组增加了14.65%,进入S期的细胞百分比较对照组减少了19.10%,较阴性对照组减少了18.68%;40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L顺铂处理细胞24 h后,与对照组相比,凋亡率明显增高(P＜0.05),且浓度越高,凋亡率越高;同一浓度顺铂作用下转染pGensil-1-EGFR的A549细胞凋亡率较A549细胞增高(P＜0.05).结论 dsRNA-EGFR可有效抑制A549细胞生长,使细胞阻滞在G0-G1期,顺铂可有效诱导细胞凋亡,RNAi与顺铂具有协同效应,提高细胞对顺铂的敏感性,RNAi技术为非小细胞肺癌基因治疗提供了新策略.     

靶向Her2/neu基因小干扰RNA对肺腺癌Calu-3细胞株药物敏感性的影响

目的探讨转染靶向Her2/neu基因小干扰RNA(sm all interfering RNA,siRNA)对肺腺癌Calu-3细胞株药物敏感性的影响。方法实验分4组,未转染对照组、空载体组、非特异性siRNA组、Her2/neu siRNA组,实验重复5次。即用Her2/neu基因的特异性siRNA和非特异性siRNA通过阳离子脂质体L ipofectAM INE 2000分别转染Calu-3细胞。采用流式细胞仪(FCM)检测各组Calu-3细胞Her2/neu蛋白和P糖蛋白(P-gp)的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测顺铂(DDP)对转染siRNA的癌细胞增殖水平的影响,应用膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)凋亡试剂盒检测各组Calu-3细胞的凋亡水平。结果Her2/neu siRNA组Calu-3细胞Her2/neu蛋白表达的阳性率为(25.04±1.56)%、P-gp蛋白表达阳性率为(4.24±1.01)%,而未转染对照组、空载体组、非特异性siRNA组Her2/neu蛋白表达的阳性率分别为(98.24±2.23)%、(95.67±1.98)%、(94.79±0.87)%;P-gp蛋白表达阳性率分别为(5.11±2.98)%、(6.98±2.47)%、(5.59±3.66)%。Her2/neu siRNA组Calu-3细胞Her2/neu蛋白表达受到明显抑制(F=112,P<0.05);而P-gp的表达水平各组差异无统计学意义(F=2.45,P>0.05);Her2/neu siRNA联合DDP作用的细胞抑制率达(67.1±2.3)%,而未转染对照组、空载体组及非特异性siRNA组联合DDP细胞抑制率分别为(48.1±3.5)%、(46.3±5.9)%及(50.2±2.9)%,3组间抑制率差异无统计学意义(F=8.68,P>0.05),3组分别与Her2/neu siRNA组比较差异有统计学意义(P<0.01);FCM分析显示靶向Her2/neu基因特异性siRNA组Calu-3细胞的DDP诱导凋亡率为(35.6±3.4)%,明显高于未转染对照组的(8.8±0.5)%、空载体组的(9.6±1.7)%及非特异性siRNA组的(11.3±1.8)%,差异有统计学意义(F=10.68,P<0.01)。结论靶向Her2/neu基因siRNA能增强肺腺癌Calu-3细胞株对顺铂的敏感性。     

RNA干扰p21对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默p21基因对肝癌细胞SMMC-7721增殖及恶性表型变化的影响.方法:通过慢病毒载体将p21小干扰RNA片段稳定转染入SMMC-7721细胞,通过RT-PCR,Western blot分别检MJp21 Mrna和蛋白表达变化,流式细胞仪检测7721-p2l RNAi组(感染p21 siRNA...     

siRNA mediated the type 1 insulin-like growth factor receptor and epidermal growth factor receptor silencing induces chemosensitization of liver cancer cells

Purpose This study was to investigate if downregulation of IGF1R and EGFR by RNA interference (RNAi) would sensitize human liver cancer cells (HEPG2, Huh7 ) to adriamycin. Methods HEPG2, Huh7 cell lines were transfected IGF1R siRNAs and EGFR siRNAs and IGF1R or EGFR mRNA level was determined by RT-PCR and Western-blot analysis. We investigated the effects of the adriamycin-induced apoptosis of these cells by TUNEL assay. Also we analyze caspase3, 8 and the phosphorylation levels of Akt and Erk by Western-blot. The p53 effect of adriamycin-induced cell death by inhibitors of EGFR/IGF1R is investigated by cell growth curves. Results Transfection of an IGF1R and EGFR siRNAs resulted in substantial loss of IGF1R and EGFR mRNA of HEPG2, Huh7 cells relative to the control case. EGFR siRNA and IGF1R siRNA treatments increased the adriamycin-induced apoptosis of these cells. IGF1R siRNA and EGFR siRNA enhance a caspase-dependent cell death program. The phosphorylation levels of Akt and Erk were reduced by the combination of the two agents. The facilitation of adriamycin-induced cell death by inhibitors of EGFR/IGF1R is p53-independent. Conclusions The results indicate that the siRNA for IGF1R has a great potential for cancer therapy when combined with either a chemotherapeutic agent or siRNAs that targets EGFR.     

Inhibitory effect of vascular endothelial growth factors-targeted small interfering RNA on proliferation of gastric cancer cells

AIM： To examine the effects of vascular endothelial growth factor （VEGF）-targeted small interfering RNA （siRNA） on proliferation of gastric cancer cellsin vitro.
METHODS： Several siRNAs were transfected into human gastric cancer cell line SGC-7901 with Lipofectamine 2000. Cells not transfected with LipofectamineTM 2000 or scrambled （SCR） siRNA served as controls. The inhibitory effect of siRNA on the expression of VEGF mRNA and protein was detected by RT-PCR and ELISA. MTT assay was used to examine the inhibition rate of cell growth.The change in cell cycling of siRNA-treated cells was detected by flow cytometry.
RESULTS： siRNA targeting human VEGF effectively inhibited the proliferation of gastric cancer cell lineSGC-7901 and the distribution of cell cycle. The percentage of G0/G1 phase was significantly higher in siRNA1- and siRNA2-transfected cells than in control cells.The expression of VEGF mRNA was significantly inhibited in siRNA1- and siRNA2-transfected cells compared with that in control cells. VEGF protein notably decreased in siRNA-transfected cells, but had no effect on SCR siRNA.
CONCLUSION： VEGF siRNA inhibits proliferation of gastric cancer cells in vitro.     

siRNA沉默USP22基因对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase22,USP22)对胃癌细胞增殖的影响.方法:针对USP22基因设计3条siRNA及阴性siRNA,用脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌AGS细胞,通过实时定量PCR和Western blot检测转染后AGS细胞USP22基因中mRNA和蛋白表达水平的变化情况,流式细胞术检测细胞周期分布变化情况,CCK8法检测细胞增殖率及抑制率.结果:转染48h后,3条siRNA均能显著抑制USP22 mRNA和蛋白的表达.其中,以转染USP22 siRNA3后效果最明显,mRNA和蛋白表达分别下降80.47%±2.99%和79.40%±3.58%.细胞增殖明显受到抑制,USP22 siR-NA3组细胞增殖抑制率为27.33%±3.49%.细胞周期中G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.结论:采用RNA干扰技术能够有效地沉默USP22基因的表达,并显著抑制胃癌细胞的增殖.