荧光标记复合扩增短串联重复序列基因分析骨髓移植物的植入

目的 为了准确地识别骨髓移植物的植入状态,探讨PCR扩增短串联重复序列（short tandem repeat,RCR－STR）在亲缘或无关供者骨髓移植的预后及白血病复发中的预警作用。方法 建立荧光标记PCR－STR等位基因分析技术,采用单克隆磁珠提取DNA,四色荧光标记,于移植前、移植后7天－6个月不等,采集供、受者血液（2例回顾性研究患者刮取口腔粘膜脱落细胞作为术前样本）DNA作PCR－STR分析。结果 ①12例患者骨髓移植后10例为完全供者型,其中同胞损髓8例,HLA全相合77例,半相合1例;无关供者损髓1例,HLA全相合,母亲供髓1例,HLA-Ⅰ全相合,HLA－Ⅱ半相合。10例受者术后出现Ⅰ度移植物抗宿主病（GVHD）,STR均完全和持续表达供者基因型,追求观察3－25个月,预后良好。②12例中1例由嵌合型转变为完全供者型,系同胞损髓,HLA－Ⅰ半相合,HLA－Ⅱ全相合;术后第30天PCR－STR表达供、受者双方基因型,第60天完全转变为供者基因型,而自身的基因在外周血中消失,预后良好。③12例中1例为持续未植入,HLA半相合同胞捐髓,术后虽然有血液学和临床情况的改善,但移植后7,14,21天STR分析始终仅显示受者基因型,移植后4个月死亡。结论 基于分子水平的移位点PCR－STR分析是骨髓移植后供者植入的精确标志。研究表明,PCR－STR植入分析的准确性优于任何传统技术,对移植效果有预警作用。     

造血干细胞移植植入存活检定技术的应用性研究

目的 探讨荧光标记短串联重复(STR)复合扩增技术在造血干细胞移植(SCT)存活检定中的应用价值。方法 用荧光标记引物对15个STR位点和1个性别位点牙釉质蛋白基因(amelogenin)进行聚合酶链反应(PCR)复合扩增，再用DNA自动测序仪对PCR产物进行分离及分型，并对30例移植后病人做存活鉴定检测。结果 有20例移植后病人的15个STR位点的分型完全表现供者源性，与受者移植前不同；3例表现为供／受体干细胞混合嵌合状态，7例未表现出供者源性细胞在受者体内的植入。结论 荧光标记STR复合扩增体系特异性强，个体识别力高，检测灵敏、快速、简便，可作为SCT存活的可靠指标。     

无关供者骨髓移植中HLA—Cw基因与急性GVHD相关性的初探

目的探讨无关供者骨髓，外周血造血干细胞移植（BMT／PBSCT）后的急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发生与供/受者HLA—Cw等位基因匹配程度的相关性。方法选择HLA—A、B、DRB1相同、并业已进行BMT/PBSCT的无关供／受者对，采用PCR—SSP方法对供受者进行HLA—Cw位点的高分辨基因定型，并收集移植后患者的临床资料，对HLA—Cw基因与aGVHD的相关性进行回顾性分析。结果观察4例HLA-A、B、DRBI相同的移植患者，即急淋（ALL）患者1例、慢性髓细胞白血病（CML）患者2例、急性髓细胞白血病（AML）患者1例，HLA—Cw等位基因完全相合、半相合和完全不相合的患者分别为1例、2例和1例．结果1例CML及1例AML患者中出现Ⅲ度aGVHD。结论无关供者骨髓/外周血造血干细胞移植中，供受者HLA—Cw等位基因匹配程度对急性GVHD具有重要影响，并建议对HLA—Cw基因进行常规检测．     

HLA相合亲缘供受者自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的分析

本研究分析HLA相合亲缘关系供受者自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）基因分布情况并探讨其KIR相合的可能性。采用Luminex流式技术和测序方法检测HLA—A，-B，-Cw和-DRBl位点；利用序列特异性引物PCR法（PCR．SSP）检测KIR基因。结果表明：在HLA—A，-B，-Cw和-DRBl等8个位点相合的27对亲缘关系供受者样本中检出17个KIR基因，其中KIR3DL3、KIR3DPI、KIR2DL4和KIR3DL2基因存在于所有个体；检出20种KIR基因型和12种单倍体。常见基因型为2，2。频率为29．6％；最常见单倍体是2，频率为53、0％，样本以A型单倍体为主，频率为67．2％；12对（44、4％）供者KIR与受者KIR基因型和单倍体完全相同，13对（48、1％）供者KIR与受者KIR存在1个单倍体相同，2对（7．4％）供者KIR与受者KIR基因型和单倍体完全不同；1对供者KIR2DLl与受者HLA—Cw（Lys80）配基完全相合，17对供者KIR2DL2／2DL3与受者HLA—Cw（Asn80）配基完全相合，5对供者KIR3DLl与受者HLA—B（Bw4）配基完全相合。结论：HLA相合亲缘关系供受者KIR匹配的错配率比较高。     

短串联重复序列检测在异基因造血干细胞移植植入状态中的应用

背景:移植后造血干细胞植活的判断主要依赖于体内各种遗传标记,其在敏感性和有效性方面各不相同,故亟待建立一种鉴别力强、敏感性高、不受性别限制的检测方法。目的:观察异基因造血干细胞移植供受者移植前及受者移植后不同时间段的血样DNA短串联重复序列遗传位点检测情况。设计:观察测量实验。单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室。对象:选择2004-02/2005-12在深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传实验室配型成功并进行造血干细胞移植的18对供受者血样,18例患者中,男10例,女8例,平均35岁。接受血缘关系供者移植6例,无关供者移植12例。所有受试对象均对检测项目知情同意。方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复序列(STR)检测技术,对18例进行造血干细胞移植的血液病患者移植后的系列血样及移植前供、受者的血样进行15个STR位点和1个性别位点的检测,找出供受者间的差异基因,观察移植后供者的STR基因在受者体内的植入情况及变化过程,找出最早检测到供者STR基因的时间及完全嵌合体最早出现的时间。主要观察指标:①观察移植前供受者差异基因。②供者STR基因及完全嵌合体最早出现时间。结果:供受者18对均进入结果分析。①供受者中能区分出彼此差别的平均STR差异位点数为12.4(8～15)个。②患者移植后最早可检测到供者STR基因的平均时间为8(5～14)d,由受者型向完全供者型转化的平均时间为14(9～23)d。植入状态由供受者嵌合型转为完全供者嵌合型。结论:荧光标记复合扩增STR检测方法可精确地描述异基因造血干细胞移植植入状态及其演变过程,可为临床提供一个准确、可靠的实验依据。     

FBC预处理方案在HLA半相合异基因外周血干细胞移植中的应用

目的　观察降低预处理强度对HLA半相合异基因干细胞植入的影响。方法　用氟达拉宾 (30mg m2 × 6d)、白消安 (4mg kg× 2d)、环磷酰胺 [(30～ 6 0 )mg kg× 2d]组成FBC方案。将 12例白血病患者分成两组 ,HLA完全相合移植组 4例 ,移植前患者处完全缓解状态 ;HLA半相合移植组 8例 ,皆为难治性白血病 ,其中 1例HLA 3个位点不合 ,6例二个位点不合 ,1例一个位点不合 ,接受本处理方案后 ,进行G CSF动员的异基因外周血干细胞移植 ,并于移植后第 30天 (+30天 )、+6 0天、+90天输注供者淋巴细胞 ,观察异基因干细胞植入和长期植入情况。结果　HLA半相合组患者平均接受 4.87× 10 8 kg供者外周血单个核细胞 ,其中CD3 4+细胞平均数为 4.5 8× 10 6 kg,HLA全相合组平均接受 4.85× 10 8 kg供者外周血单个核细胞 ,其中CD3 4+细胞 4.47× 10 6 kg。HLA半相合组 7例白细胞升至 1.0×10 9 L的平均时间为 2 9d(11～ 90d) ,血小板升至 2 0× 10 9 L的时间为 36d(14～ 96d) ,1例HLA 3个位点不合的患者移植失败 ,但该患者于 +5 0天恢复自体造血。而HLA全相合的 4例患者白细胞升至 1.0×10 9 L平均需 14d(11～ 18d) ,血小板升至 2 0× 10 9 L平均需 15d(11～ 18d)。经STR PCR检测 ,两组患者除 1例表现为混合嵌合体 ,其余均呈完     

HLA单倍体与全相合异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病

背景:异基因造血干细胞移植是治疗恶性血液病的一种非常有效的方法。单倍体相合的造血干细胞移植扩大了移植的应用范围,是无HLA相合供者患者的一种重要选择。目的:比较HLA单倍体相合与全相合异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病的临床疗效。方法:回顾性分析接受异基因造血干细胞移植79例恶性血液病患者的临床资料,其中HLA单倍体相合组26例、全相合组53例,对比两组受者移植物抗宿主病的发生率、复发率、2年生存率等。结果与结论:78例受者获得完全、持久供者干细胞植入;1例受者在移植后28 d尚未植入,后因感染死亡。两组慢性移植物抗宿主病发生率、复发率和2年无病生存率差异无显著性意义(P>0.05)。单倍体相合组急性移植物抗宿主病发生率高于全相合组(P<0.05);2年总生存率低于全相合组(P<0.05)。提示血缘HLA单倍体相合移植治疗恶性血液病的安全性及疗效接近于全相合移植,在缺乏HLA相合供者的情况下,行HLA单倍体相合造血干细胞移植治疗恶性血液病是切实可行的选择。     

异基因脐血干细胞移植后STR基因座位的表达分析

本研究分析杜氏型肌营养不良（DMD）病人异基因脐带血干细胞移植后STR基因座位的表达。利用PCR—SSO方法检测患者、供者HLA-A、B、DR位点，并利用STR—PCR方法检测术后各个器官的STR-基因位点的表达情况。结果表明：患者与供者在HLA中、低分辨情况下A、B、DR位点全相合，患者的胸骨骨髓显示为供者独立植入，脾、左上肺、前臂、肌舌、左肝、胃、右颞叶、膈肌、右支气管、左心室、右肾均为嵌合状态。结论：造血干细胞移植术后，供者的基因可在实体器官表达，形成嵌合状态.     

Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定

目的探讨应用Profiler体系进行短串联重复序列（STR）基因位点检查在异基因造血干细胞移植中的作用。方法采用荧光标记STR-PCR复合扩增、毛细管电泳基因分型技术，对11例异基因造血干细胞移植的供者和受者移植前、后STR基因进行检测，了解造血干细胞的植入情况。结果11例异基因造血干细胞移植受者移植后STR基因型与受者移植前STR基因型不同，与供者STR基因型完全相同，提示供者造血干细胞的植入。结论应用Profiler体系进行STR基因位点检查可用于判断异基因造血干细胞移植的植入情况。     

Ph+急性淋巴细胞白血病的移植治疗现状及其进展

Ph+急性淋巴细胞白血病(ALL)是预后极差的一种急性白血病。传统化疗治疗Ph+ALL 的生存率低于10％～20％,同胞相合供者的异基因干细胞移植(allo—SCT)可以使治愈率提高到40％～ 50％。对于不适合传统allo—SCT或无同胞相合供者的年轻患者,可考虑行相合无关供者的干细胞移植,但移植相关死亡率较高;高龄患者可进行自体干细胞移植,极少数患者可选择非清髓性干细胞移植。酪氨酸激酶抑制剂伊吗替尼(imatinib)用于移植前净化或移植后治疗,可以改善自体和allo-SCT的效果。     

混合脐血成人移植定量监测植入状态的实验研究

为了定量监测和研究双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、供者细胞相对数量的动态变化及演变规律 ,采用荧光标记复合扩增短串联重复 (STR)位点嵌合体定量检测技术 ,对 1例急性髓细胞白血病成人患者移植两份 (脐血 1有核细胞数为 2 .5× 10 7/kg ,脐血 2有核细胞数为 1.5 3× 10 7/kg)HLA各 1个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行 9个STR位点的检测 ;利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型 ;而后根据 377XLDNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的细胞相对数量 ,定量分析供体细胞植入程度及演变规律 ;并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比。结果表明 :移植后 15天两份脐血同时植入 ,植入状态为完全双份供者嵌合体 ,患者体内脐血 1的相对细胞数量占 5 1.3% ,脐血 2占 4 8.7% ;30天时脐血 1嵌合体细胞上升为 70 .0 % ,脐血2嵌合体细胞下降为 30 .0 %。 5 2天时只检测到脐血 1的基因 ,植入状态转为完全单份供者嵌合体 ,有核细胞数少的一份脐血被排斥 ,有核细胞数多的一份长期植入。结论 :荧光标记复合扩增STR嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程 ,为临床脐     

成人移植双份脐血植入状态的定量监测

背景:脐血因所含的有核细胞数量有限,主要应用于儿童患者,近年来,人们尝试将两份脐血混合输入,用于成人血液系统疾病的治疗。目的:定量监测双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、相对数量的动态变化及演变规律。设计:以脐血干细胞移植的供受者为观察对象,供受者移植前及受者移植后不同时间段的系列血样提取DNA作为检测标本,短串联重复序列遗传位点为观察指标。单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室。对象:纳入2005-06在北京大学深圳医院住院治疗的急性髓细胞白血病患者,男性,43岁,体质量75kg。首次化疗完全缓解后6个月移植两份人类白细胞抗原(HLA)各一个位点不合的非血缘脐血,脐血1有核细胞数为2.5×107kg-1;脐血2有核细胞数为1.53×107kg-1。脐血来源于广州脐血库。患者对治疗方案知情同意。方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复位点嵌合体定量检测技术,对急性髓细胞白血病成人患者移植两份(脐血1有核细胞数为2.5×107kg-1,脐血2有核细胞数为1.53×107kg-1)HLA各一个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行了9个短串联重复序列位点的检测,利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型;而后根据377XLDNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的相对数量,定量分析供体细胞植入程度及演变规律。并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比。主要观察指标:在成人移植双份脐血后,观察患者及两供者9个位点的短串联重复序列基因在患者体内的转变过程,对植入状态进行定量及定性的描述。结果:移植后15d两份脐血植入状态为完全双份供者嵌合体,患者体内脐血1的相对细胞数量占51.3%,脐血2占48.7%;30d时脐血1上升为70.0%,脐血2下降为30.0%。52d时只检测到脐血1的基因,植入状态转为完全单份供者嵌合体,有核细胞数少的一份脐血被排斥,有核细胞数多的一份长期植入。结论:荧光标记复合扩增短串联重复序列嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程,为临床脐血的应用及供者的选择提供了一个准确、可靠的实验依据,证明双份HLA各一个位点不合的脐血同时用于成人的移植是可行的。     

Bone marrow transplant engraftment analysis with loss of an informative allele

Short tandem repeats (STRs) are highly polymorphic DNA sequences in the human genome. STR genotype analysis is used for human identity testing and to monitor bone marrow engraftment after allogeneic transplantation. Engraftment analysis requires one or more informative STR loci that distinguish recipient from donor. The following case illustrates that chromosome loss in tumor cells during the course of disease may cause corresponding loss of an STR locus. This circumstance is a potential source of error in the interpretation of engraftment analysis, especially if only one informative allele is used to monitor engraftment.     

Cytogenetic changes associated with myelodysplastic syndrome affecting bone marrow engraftment analysis

In vitro amplification of polymorphic genetic markers, especially short tandem repeats (STRs), has become standard laboratory practice in the monitoring of allogeneic bone marrow transplant patients. After initial analysis of donor and recipient samples at multiple loci before transplantation, one or more loci are used to follow engraftment status in subsequent specimens. We describe an unusual pattern of STRs in a transplanted patient with a prior history of refractory acute myelogenous leukemia. DNA chimerism studies showed a lack of engraftment at 1 and 2 months after transplantation. Atypical minor peaks occurred at each of three STR loci in the pre-transplant and 2-month post-transplant recipient samples. However, these peaks were of equal amplitude as the major corresponding allele in the 1-month post-transplant sample. A history of myelodysplasia with specific chromosomal deletions before the patient's acute myelogenous leukemia diagnosis appears to explain the spurious peaks. STR analysis of blood and archival paraffin-embedded tissues collected from the patient at various time points before transplantation reflected the evolution, progression, and response to therapy of the myelodysplasia. The case illustrates the need for comprehensive evaluation of pertinent clinical and laboratory data during engraftment monitoring to identify potential sources for error in interpretation of STR analysis.     

Treatment of aplastic anemia by marrow transplantation from HLA identical siblings. Prognostic factors associated with graft versus host disease and survival.

73 consecutive patients with severe aplastic anemia were treated by marrow transplantation from hematologically normal HLA identical siblings. 68 patients lived long enough to document marrow engraftment. 21 rejected the graft and 19 of these died. 47 sustained engraftment and 18 of these died. In 16 patients, death was associated with graft versus host disease. 29 patients with sustained engraftment are alive with complete hematologic restoration between 8 mo and 5 yr. This analysis, by using a proportional hazards regression model, was directed at identifying factors that predicted survival (and absence of graft versus host disease). Of the 24 factors entered into the analysis only two strongly correlated with survival: (a) sex match of donor and recipient (P less than 0.01), and (b) absence of refractoriness to random donor platelets at the time of transplantation (P less than 0.05). Refractoriness adversely influenced the survival of the sex mismatched patients, These data suggest that X and Y-associated transplantation antigen systems are important determinants of the outcome of marrow grafts between HLA identical siblings for the treatment of aplastic anemia. The machanism by which refractoriness to random donor platelets influences survival is currently unclear.     

STR-PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用

利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列（STR-PCR）结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率（DC）,以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后转归的预警作用,采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓,DNA样本用Profiler Plus和Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果表明：两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点,Profiler Plus为6.3（4-9）个,Cofiler Plus为4.9（2-6）个。26例患者均在移植后28天出现供者细胞,1例患者未出现供者细胞。14例患者DC100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存;另有9例患者出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0%-90.2%）,其中5例为血液学复发。27例病人中有6例死亡。上述5例复发患者均在出现临床症状前发生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病（GVHD）的发生率高于MC组。结论：动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义。     

异基因造血干细胞移植植活状态的变性高效液相色谱检测研究的首次报告

异基因造血干细胞移植后动态检测供者嵌合状态对判断移植效果和实施临床早期干预治疗具有重要意义。在临床上已有多种方法用于植活检测，本研究用变性高效液相色谱(DHPLC)技术结合聚合酶链反应扩增短串联重复序列(STR—PCR)检测造血干细胞移植植活状态的特点及可靠性。用非亲缘个体的系列DNA混合体在体外检测此测定方法的可行性和半定量结果的准确性。结果表明，体外模拟混合嵌合体检测实验，显示扩增前供者DNA嵌合百分率与扩增后供受者DHPLC色谱峰峰面积比值呈直线相关，最小检出DNA百分比为5％。用该方法分析51例移植对的结果显示：45例均至少有2个可以区分彼此的有信息住点(另外5例无移植前受者标本，1例为同卵双生双胞胎)；39例与荧光标记多重PCR扩增STR结合毛细管电泳方法进行对照，准确性为100％；29例与性染色体FISH分析，27例与特殊基因标记的分析结果一致；所有病例均检测到完全供者细胞嵌合状态(FDC)；对3例患者观察到临床复发的同时，检测到供者嵌合体的比例明显下降，其中2例为混合嵌合体，1例转变为受者自身型。在此基础上，我们将该方法首次用于对8例人类白细胞抗原(HLA)配型不同一单倍型亲缘供者干细胞及无血缘关系脐带血混合移植患者植活情况的动态检测。结果显示，8例混合移植患者STR—PCR检测结果均为FDC，来源均为亲缘供者。结论：用DHPLC技术结合短串联重复序列具有快速、经济、无污染和自动化高等特点，用于检测异基因造血干细胞移植物植活状态是可靠的。     

基于免疫磁珠分选的调节性T细胞亚群嵌合性定量分析

为了探讨免疫分选偶联短串重复序列（STR）方法用于调节性T细胞（Treg）嵌合性定量监测的可行性,以淋巴细胞不同比例混合制备14组人工嵌合体血样,以单个核细胞为起点,以免疫磁珠阴性和阳性选择法获取CD4＋CD25＋Treg细胞,分选后的Treg细胞再进行16位点的STR长度多态性分析。结果显示,从分选后的Treg细胞提取的DNA量能满足STR检测要求,当嵌合体中受体比例≥10%时,16个STR位点均能检出受体和供体特异性等位基因,按照STR峰面积计算的受体比例与理论值相符;当受体比例≤1%时,仅有部分位点能检出受体特异性等位基因,实测嵌合率与理论值存在差异。结论：建立了基于免疫分选的Treg细胞嵌合性定量分析方法,对造血嵌合体的检出灵敏度和准确性在1%-10%,可用于造血干细胞移植术后嵌合体监测。