人抗菌肽HBD-2的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

制备人β-防御素2(HBD-2)多克隆抗体,以用于HBD-2蛋白水平表达的检测。提取人肠腺上皮细胞株Caco-2总RNA,设计引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HBD-2成熟肽cDNA片段,以pGEX-1λT为载体,构建原核表达质粒pGEX-1λT-HBD-2。大肠杆菌裂解物经亲合层析纯化后获得分子量约30kDa的融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,并用正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,ELISA法显示抗血清对HBD-2的效价为1∶12800,Western印迹显示抗血清可识别HBD-2。本实验结果证明应用重组融合小肽代替白蛋白或甲状腺-肽偶联免疫可获得其高效价的识别HBD-2的多克隆抗体,为今后从蛋白质水平研究HBD-2基因的诱导表达,包括组织分布和基因表达调控等研究打下了基础。     

人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13,RPS13)cDNA全长,构建原核表达质粒,诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长,利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a( )-RPS13,双酶切及测序鉴定。将重组载体转化入大肠杆菌BL21中,筛选抗性克隆并经DNA测序证实。IPTG诱导融合蛋白的表达,利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western blot检测抗体活性。结果RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a( )-RPS13构建成功,DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同。IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE检测显示在Mr19000处出现一新生条带,与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot,结果证实融合蛋白表达成功。其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13。结论成功地获得了RPS13的编码基因序列,并获得了纯化的RPS13蛋白质,为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础。     

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b( )原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以Western blot进行检测。结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上,应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度,特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白,并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。     

FILIP-1L 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的： 表达、纯化GST-FILIP-1L融合蛋白,制备FILIP-1L多克隆抗体。方法：pGEX-4T3-FILIP-1L重组质粒转化E-coliBL21大肠杆菌,IPTG诱导GST-FILIP-1L融合蛋白表达,Glutathion Sepharse 4B纯化GST-FILIP-1L融合蛋白。将纯化的GST-FILIP-1L融合蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备FILIP-1L多克隆抗体,用ELISA方法检测多克隆抗体效价,Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白、细胞转染FILIP-1L蛋白及细胞FILIP-1L蛋白的结合能力。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的FILIP-1L融合蛋白,经Glutathion Sepharse 4B纯化后免疫新西兰大耳白兔,获得了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,亲和层析获得纯度较高的多克隆抗体,WB检测显示多克隆抗体能够与FILIP-1L蛋白、293细胞转染FILIP-1L蛋白及肝癌细胞FILIP-1L蛋白结合。结论：成功表达、纯化了GST-FILIP-1L融合蛋白,制备了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,为研究FILIP-1L蛋白生物学功能提供了有用的实验工具。     

小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段,制备小鼠Klotho多克隆抗体.方法 以小鼠基因组为模板进行PCR,克隆了小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因外显子Ⅳ部分序列,经BamHⅠ和NheⅠ双酶切后定向克隆到质粒pET-GST中,构建原核表达质粒pET-GST-Klotho,转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.以重组GST-Klotho融合蛋白免疫家兔, 制备Klotho多克隆抗体.结果 表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠埃希菌中成功表达了GST-Klotho融合蛋白,GST-Klotho融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15 %左右;另外通过ELISA法测得抗血清抗体效价约为1∶ 10 000,Western印迹分析验证了抗体特异性.结论 GST-Klotho融合蛋白的表达和Klotho多克隆抗体的制备为进一步研究Klotho蛋白在小鼠体内的表达模式以及相关抗衰老药物的研制奠定了基础.     

人ULBP1重组蛋白的克隆表达和多克隆抗体制备

目的:表达人UL16结合蛋白l(ULBP1)胞外段重组蛋白,并制备兔抗人ULBP1多克隆抗体.方法:利用RT-PCR技术获得人ULBP1分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-ULBP1.测序鉴定正确后转化入大肠杆菌感受态细胞M15,经IPTG 30℃诱导4h后,对表达产物进行鉴定.用镍柱对人ULBP1重组蛋白进行纯化,并将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,采用流式细胞术(FCM)、Western blot法对制备的多克隆抗体进行生物学鉴定.结果:成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP1(aa81～244),并获得了高纯度的人pQE30-ULBP1 (aa81～244)重组蛋白.制备的多克隆抗体能够识别肺癌细胞株A549表面表达的天然构象ULBP1分子.结论:成功表达了人ULBP1(aa81～244)重组蛋白并成功制备了兔抗人ULBP1的多克隆抗体.     

GST-snail融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的制备snail多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法PCR扩增编码人snail 264个氨基酸的cDNA全长片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β—D-硫代半糖苷（IPTG）诱导表达GST／Snail融合蛋白。经电泳纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、免疫荧光和免疫印迹法鉴定血清特异性和效价。结果成功构建了pGEX-4T-1／snail原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白GST—snail,免疫产生的snail多抗可特异检测snail真核表达载体转染COS-7细胞后snail的表达及定位情况。结论获得了效价和特异性都良好的snail抗体,适合对snail的检测应用。     

TRPM2蛋白在大肠杆菌的表达纯化和多克隆抗体制备

目的 获得人瞬时受体电位M2(TRPM2)离子通道蛋白N末端的原核表达融合蛋白,制备兔抗人TRPM2多克隆抗体.方法 采用PCR扩增编码人TRPM2蛋白N末端l～334位氨基酸残基(在人与小鼠中高度保守)的cDNA序列,将其克隆至谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-3上.将原核表达重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-TRPM2N融合蛋白的表达,并纯化获得相对分子质量(Mr)约70 000的GST-TRPM2融合蛋白.将此融合蛋白与弗氏完全佐剂混合后采用经典的4次免疫法免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用Western blot法对该抗体进行鉴定.结果 通过PCR扩增获得编码TRPM2蛋白N末端的cDNA片段并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T3中,采用IPTG诱导、蛋白质的变性与复性纯化获得融合蛋白GST-TRPM2N,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备获得特异性抗TRPM2蛋白的多克隆抗体.结论 成功制备了特异性抗人TRPM2蛋白的多克隆抗体.     

α—catenin／GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的 制备α-catenin多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法 PCR扩增编码人α-catenin C－端455个氨基酸的DNA片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-4T-3,转化大肠杆菌JM109菌株,异丙基β－D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生GST／α-catenin融合蛋白。GST－Sepharose亲和层析纯化可溶性融合蛋白,免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、免疫荧光细胞化学和SP免疫组织化学法鉴定血清特异性和效价。结果 成功地构建了pGEX-4T-3/α-Cat表达载体,转化JM109后可高效表达融合蛋白GST－α-catenin（α－Cat）。免疫兔产生的α-Cat多抗可特异检测人体组织和细胞中α-Cat表达及定位情况。结论 α-catenin抗体效价高,特异性强,适合免疫组织化学、ELISA等检测应用。     

CD83重组蛋白的原核表达、复性纯化及多克隆抗体制备北大核心CSCD

目的:利用原核表达系统表达、纯化CD83蛋白,制备CD83多克隆抗体。方法:构建CD83胞外结构域的原核表达质粒,利用TOP10F’菌株表达,使用IPTG诱导并寻找最佳条件;采用0.3%SKL将包涵体溶解变性,透析复性后通过GST亲和层析纯化GST-CD83蛋白;通过QuickAntibody免疫佐剂免疫SD大鼠制备CD83多克隆抗体,ELISA分析抗体的反应活性和特异性。结果:成功构建重组质粒pGEX-2T-CD83(Met1-Arg133),获得最佳诱导条件:0.2 mmol/L IPTG、25℃、O/N。成功获得CD83重组蛋白,免疫大鼠后获得了特异性及活性较高且效价为1∶104~1∶105的多克隆抗体。结论:获得的CD83重组蛋白及多克隆抗体,为后期深入开展CD83蛋白及CD83抗体的免疫抑制特性研究提供支持。     

Expression of Recombinant Human FADD,Preparation of Its Polyclonal Antiserum and the Application in Immunoassays

The wild-type human Fas-associated death domain （FADD） protein was expressed as a His-tag fusion protein in Escherichia coll. Recombinant FADD proteins were purified under the denatured condition. After denatured protein purification, it was refolded and obtained at a yield of about 23 mg/L. Purified FADD exhibited as a homogenous band corresponding to the molecular weight of 31 kDa. Immunization of rabbits against the refolded FADD protein was allowed the production of high titre polyclonal antiserum. This new polyelonal antibody could recognize recombinant FADD protein in Western blot. Immunoreactivity was also observed in immunofiuorescence assay. The low cost polyclonal antiserum was applicable to extensive detection of FADD in various immunoassays. Cellular ＆ Molecular Immunology. 2008;5（6）：471-474.     

金黄色葡萄球菌膜蛋白nEBPS原核表达及抗体制备

目的：构建金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白（N-terminal elastin binding proteins of S.aureus,nEBPS）的原核表达系统,制备其多克隆抗体。方法：设计引物,PCR方法扩增nEBPS基因（nebps）,分别构建克隆载体pMD19-T（＋）/nebps和原核表达载体pQE30（＋）/nebps,经PCR、双酶切和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌M15[pREP4],经1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Bloting,WB）分析鉴定,经镍螯合亲和层析（Ni-NTAAgrose）纯化后再用SDS-PAGE和WB法鉴定。制备抗原,免疫新英格兰白兔,得到抗血清并对其进行鉴定。结果：pQE30（＋）/nebps重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中较高表达,纯化后得到高纯度的nEBPS,免疫动物后得到理想的多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌膜蛋白nEBPS在构建的原核表达系统M15[pREP4]中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体。     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体。方法应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western-blot检测多抗的效价及特异性。结果从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白。将纯化、复性的重组蛋白免疫小鼠。得到了滴度高于1：10^6的高效价多克隆抗体。Western-blot显示此多抗能与32000Mr的重组蛋白特异结合,并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白。结论利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性。制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具。     

小鼠IL-12受体β2胞内区蛋白表达及多抗制备

从ConA刺激的小鼠脾细胞中抽提总RNA,用RT-PCR的方法克隆出小鼠IL-12R β2亚基胞内区基因。再将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化宿主菌BL-21(DE3),用IPTC诱导宿主菌表达蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,蛋白主要存在于包涵体中。利用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫兔子制备多抗。经ELISA检测,证明免疫后兔血清中有高滴度的针对IL-12Rβ2亚基胞内区的抗体。     

人硫氧还蛋白cDNA的克隆、表达及其多克隆抗体制备

目的制备硫氧还蛋白1(thioredoxin-1,Trx-1)多克隆抗体。方法从乳腺癌细胞系MCF-7中用RT-PCR的方法得到了Trx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上进行大量的表达和纯化,纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清用梯度饱和硫酸铵沉淀的方法进行多克隆抗体的纯化。用ELISA和Western印迹实验测定抗体效果。结果成功获得了Trx-1全长cDNA,通过原核表达得到了大量Trx-1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。结论此多克隆抗体对Trx-1蛋白具有良好的识别能力,可以应用于Trx-1的功能研究。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体。方法应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度：用Western-blot、ELISA法检测纯化后IgG性质及效价。结果重组NS1蛋白获得分泌表达。其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1：6000。结论重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

不同免疫方案制备鼠抗PBP2a多克隆抗体的比较

目的制备针对青霉素结合蛋白（PBP2a）的抗血清，比较不同免疫方案的免疫效果。方法以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白作为免疫原，采用多种注射途径（足垫、腹腔、足垫＋腹腔、足垫＋皮下）免疫BALB／C小鼠，ELISA和Western-blot法检测所制备的抗血清效价和特异性。结果足垫快速免疫组、腹腔免疫组、足垫和腹腔免疫组、足垫加皮下免疫组的效价依次为1：12800、1：25600、1：51200、1：102400。Western-blot显示所制备的抗血清能有效识别原核表达及耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株中的PBP2a。结论重组PBP2a蛋白免疫BALB／c小鼠能有效刺激特异性抗体的产生，足垫加皮下多点免疫法是一种值得推崇的免疫方案。     

小鼠SAP基因的克隆、表达及多抗制备

目的 制备小鼠SAP多克隆抗体,为进一步研究其功能和探讨其与炎症,肿瘤等疾病的相关性提供素材。方法 PCR扩增小鼠SAP基因编码区的DNA片断,将其重组入原核表达质粒pET30a(+),转化入大肠杆菌BL21中,异丙基β-D硫代办乳糖苷（IPTG）诱导产生His/mSAP融合蛋白,SDS-PAGE分析结果表明,蛋白主要以包涵体形式存在。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、Western blot来检测抗血清效价及特异性。结果 成功的构建了pET30a(+)/mSAP重组质粒,表达融合蛋白,免疫兔子所获的mSAP多克隆抗体。结论 mSAP多克隆抗体特异性强,效价高。